專利名稱：特異性檢測旱稻孢囊線蟲的pcr方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物寄生線蟲檢測領(lǐng)域，具體涉及以旱稻孢囊線蟲特異性引物檢測旱稻孢囊線蟲的PCR方法。
背景技術(shù)：
旱稻抱囊線蟲(Heterodera elachista ohshima, 1974)又稱日本抱囊線蟲(Japanese cyst nematode),最早由岡田1953年在日本櫪木縣山地稻田中發(fā)現(xiàn)。該病害在湖南省多個(gè)縣市的丘陵地帶稻田均有發(fā)生。該病害危害隱蔽，同缺肥、缺水癥狀相似，不造成特異性癥狀。該線蟲一般寄生在水稻根部，具有主動(dòng)侵染寄生和自行轉(zhuǎn)移危害等特點(diǎn)，對水稻的危害，除吸取寄主的營養(yǎng)和對植物的根部造成損傷外，還能顯著降低水稻對水的利用效率，從而破壞植物的正常代謝和機(jī)能，影響生長和發(fā)育，致使植物的產(chǎn)量減少，品質(zhì)下降。據(jù)報(bào)道，該線蟲在水稻上可造成7%-19%的損失。建立簡單快速檢測旱稻孢囊線蟲的方法有助于有效地進(jìn)行旱稻孢囊線蟲的監(jiān)測與防控。 在孢囊線蟲的鑒定與檢測方面，目前主要以傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定為主，不僅需要豐富的知識經(jīng)驗(yàn)，而且往往會(huì)出現(xiàn)誤診的問題，同時(shí)形態(tài)鑒定耗時(shí)費(fèi)力，需要專業(yè)人士操作，并且還需要從土壤中分離大量孢囊線蟲樣品，卻達(dá)不到快速從土壤分離的線蟲混合樣品或水稻根系中直接檢測出線蟲的水平。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，線蟲檢測鑒定技術(shù)取得了重大突破，線蟲的系統(tǒng)分類不再僅僅依靠形態(tài)學(xué)特征等傳統(tǒng)的方法，已探索出許多線蟲種群分類鑒定的分子診斷方法，利用分子技術(shù)探索不同種群rDNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer, ITS)和rDNA28S的D2 / D3區(qū)的序列特征已成為近年來線蟲分子診斷的研究熱點(diǎn)。ITS序列是一個(gè)多用途的遺傳標(biāo)記，位于18S和28S核糖體DNA基因的重復(fù)簇之間，中間被5. 8S核糖體DNA基因分開。研究ITS區(qū)域有很多優(yōu)勢，尤其是在樣品較少而其它方法不能正確地鑒定線蟲時(shí)，分析rDNA-ITS區(qū)域的序列，可以更有效地鑒定和分辨更多的農(nóng)業(yè)重要線蟲種或近緣種(Subbotin, et al，2001)。目前，國內(nèi)外尚無基于旱稻孢囊線蟲的rDNA的ITS序列設(shè)計(jì)特異性引物檢測旱稻孢囊線蟲的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種特異性檢測旱稻孢囊線蟲的PCR方法。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是一種特異性檢測旱稻孢囊線蟲的PCR方法，該方法是以旱稻孢囊線蟲特異性引物He-F/He-R對待測樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再電泳鑒定，該特異性引物為He-F :5’-ATTCACCACCTACCCTCGCTGCCTA-3’，He-R :5，-TTGGAGCAGCAAACCGACCAGCGAT-3，。
采用上述特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，能擴(kuò)增出旱稻孢囊線蟲281bp的片段?；谏鲜鎏禺愋砸?，還可采用一步雙重PCR擴(kuò)增進(jìn)行檢測，即在PCR反應(yīng)體系中加入通用引物D2A/D3B作內(nèi)標(biāo)D2A : 5’-ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG-3’，D3B :5’-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3’ ；可同時(shí)擴(kuò)增出780bp和28Ibp的片段。對本發(fā)明方法詳細(xì)敘述如下一、特異性引物的設(shè)計(jì)
本發(fā)明人將旱稻孢囊線蟲的ITS序列及從NCBI基因庫下載的隸屬孢囊屬的6個(gè)近緣種(見下表I)的ITS序列進(jìn)行比對分析，設(shè)計(jì)篩選出一對旱稻孢囊線蟲特異性引物He-F/He-R。此對特異性引物的上游引物(He-F)位于ITS序列的第48bp至第72bp，下游引物(He-R)位于ITS序列的第304bp至328bp，擴(kuò)增得特異性片段長度為281bp，該特異性引物序列如下He-F :5’ -ATTCACCACCTACCCTCGCTGCCTA-3’(如 SEQ ID NO 1 所示)，He-R :5’-TTGGAGCAGCAAACCGACCAGCGAT-3’(如 SEQ ID NO :2 所示)。表I 6種孢囊線蟲及登錄號
Y~W^登錄號
擬水稻孢囊線蟲 H. oryzicolaAF274387
大豆孢囊線蟲H. glycinesHM560782
禾谷孢囊線蟲H. avenaeHM560737
菲利普孢囊線蟲H. FilipjeviHM147947
碗豆抱囊線蟲H. goettingianaAF498374
甘鹿抱囊線蟲H. sacchariAF274403將該特異性引物He-F/He-R分別經(jīng)BLAST檢索，見表2和表3，結(jié)果表明，引物He-F/He-R的序列與檢索出現(xiàn)的旱稻孢囊線蟲的核苷酸序列均100%覆蓋。表2弓丨物He-F的BLAST結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種特異性檢測旱稻孢囊線蟲的PCR方法，其特征在于該方法是以旱稻孢囊線蟲特異性引物He-F/He-R對待測樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再電泳鑒定，該特異性引物為He-F :5’-ATTCACCACCTACCCTCGCTGCCTA-3’，He-R :5，-TTGGAGCAGCAAACCGACCAGCGAT-3，。
2.如權(quán)利要求I所述的特異性檢測旱稻孢囊線蟲的PCR方法，其特征在于采用所述特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)生281bp的片段。
3.如權(quán)利要求I或2所述的特異性檢測旱稻孢囊線蟲的PCR方法，其特征在于所述PCR擴(kuò)增采用的反應(yīng)體系中還包括以下通用引物D2A :5’-ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG-3’，D3B :5’-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3’。
4.如權(quán)利要求3所述的特異性檢測旱稻孢囊線蟲的PCR方法，其特征在于所述PCR擴(kuò)增同時(shí)產(chǎn)生780bp和281bp的片段。
全文摘要
一種特異性檢測旱稻孢囊線蟲的PCR方法，是以旱稻孢囊線蟲特異性引物He-F/He-R對待測樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再電泳鑒定，該特異性引物可在旱稻孢囊線蟲群體特異性擴(kuò)增出281bp的片段，其靈敏度達(dá)1/256條2齡幼蟲。還可在PCR體系中加入通用引物D2A/D3B作內(nèi)標(biāo)，同時(shí)擴(kuò)增出780bp的片段。本發(fā)明方法不僅可用于單個(gè)旱稻孢囊線蟲種孢囊和單條旱稻孢囊線蟲的2齡幼蟲的鑒定和檢測，還適用于土壤和水稻根樣中旱稻孢囊線蟲的檢測，本方法特異性強(qiáng)，靈敏度高，耗時(shí)短，操作簡單，在旱稻孢囊線蟲的檢測和旱稻孢囊線蟲病的早期診斷方面具有很高的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號C12Q1/68GK102796825SQ20121032205
公開日2012年11月28日 申請日期2012年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月3日
發(fā)明者丁中, 王水南, 何旭峰, 徐萍 申請人:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)