專利名稱：傳染性支氣管炎病毒h120疫苗株反向遺傳操作系統(tǒng)及其操作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種傳染性支氣管炎病毒H120疫苗株反向遺傳操作系統(tǒng)及其操作方法。
背景技術(shù)：
傳染性支氣管炎(Infectious Bronchitis, IB)是由冠狀病毒科冠狀病毒屬的雞傳染性支氣管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus, IBV)引起的一種急性高度接觸性傳染病。該病毒可感染所有日齡的雞，導(dǎo)致生長遲緩、死亡和飼料報(bào)酬降低；還常常因霉形體混合感染以及大腸桿菌病等繼發(fā)感染而提高雞群的死亡率，給養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大損失。目前， 該病呈世界廣泛流行，是嚴(yán)重危害世界養(yǎng)禽業(yè)的重大傳染病之一。IBV的基因組為單股正鏈RNA，長約27. 6kb，具有典型的5'帽子和3' Poly A尾巴結(jié)構(gòu)，至少有10個(gè)明顯的開放閱讀框(ORF)，分別編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白。其中S蛋白構(gòu)成了 IBV的最表層纖狀突起，是最重要的保護(hù)性抗原，其作用表現(xiàn)為刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，在病毒吸附細(xì)胞過程中發(fā)揮作用，因此決定病毒的組織嗜性，但并不是IBV毒力的唯一決定性因素。N蛋白是IBV病毒內(nèi)部核衣殼的組成蛋白，在病毒復(fù)制、組裝中有作用，蛋白的磷酸化對其功能的發(fā)揮具有重要作用。3a、3b、fe*恥均為病毒編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白，在IBV感染細(xì)胞內(nèi)均可檢測到，但其功能目前還不清楚。最近發(fā)現(xiàn)3a、3b、fe*^編碼區(qū)的缺失不影響IBV病毒的復(fù)制和病毒的致病性。IBV RNA基因組因具有獨(dú)特的先導(dǎo)引物轉(zhuǎn)錄機(jī)制，具有很高的錯(cuò)配率。在免疫接種程序、家禽密度等因素的影響下，IBV正以不同的速度和不同的進(jìn)化方向發(fā)生變異。目前世界上已分離的主要流行株有M41株、Corm株、澳大利亞T株、Hotle株、Gray株等，不同毒株在毒力、致病性和組織嗜性上存在著很大差異。疫苗接種是預(yù)防IB的重要手段，相繼研制出常規(guī)的IB活苗和滅活苗，其中雞胚適應(yīng)毒H120和H52弱毒苗已被世界各國廣泛應(yīng)用。 由于不同血清型IBV毒株之間交叉保護(hù)力弱，這給IB的免疫預(yù)防帶來了很大的困難。常規(guī)單一毒株疫苗常有免疫失敗的報(bào)道，弱毒疫苗還存在重組、毒力返強(qiáng)等問題。針對IBV新的流行情況研制有效的新疫苗迫在眉睫。反向遺傳操作技術(shù)(reverse genetics)，即病毒的全長感染性cDNA克隆技術(shù)，包括病毒基因組全長cDNA克隆構(gòu)建技術(shù)和由cDNA轉(zhuǎn)錄病毒RNA的感染性轉(zhuǎn)錄本制備技術(shù)， 能在病毒DNA水平上對其進(jìn)行人工操作，解決了 RNA病毒基因組難以操作的難題，從而為 RNA病毒的基因復(fù)制與表達(dá)調(diào)控機(jī)理研究、新疫苗的研制等提供了強(qiáng)有力的手段。IB病毒的基因組是目前已知RNA病毒中最大的一類病毒，其反向遺傳操作技術(shù)難度較大。本研究建立了傳染性支氣管炎病毒H120疫苗株的反向遺傳操作系統(tǒng)，為該病新型疫苗的研制奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種傳染性支氣管炎病毒H120疫苗株反向遺傳操作系統(tǒng)，該系統(tǒng)包含1)構(gòu)建RNA病毒的全長cDNA分子，該全長cDNA分子其5，端具有完整的T7 RNA 聚合酶啟動(dòng)子的核心序列，3’端具有polyA尾巴結(jié)構(gòu)；2)輔助cDNA，輔助cDNA編碼所述傳染性支氣管炎病毒H120疫苗株的核蛋白(N) 的cDNA序列，其5’端具有完整的T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子的核心序列，3’端具有polyA尾巴結(jié)構(gòu)。3)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。全長cDNA分子中基因組的第738位的堿基從C突變?yōu)門。全長cDNA分子中基因組的第17243位的堿基從G突變?yōu)門。構(gòu)建全長cDNA分子的多個(gè)重組質(zhì)粒中的cDNA序列兩端具有限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，以實(shí)現(xiàn)片段間的定向克隆，用于構(gòu)建所述傳染性支氣管炎病毒H120疫苗株的全長cDNA 分子。所述的限制性內(nèi)切酶是Bsa I。全長cDNA分子中將fe基因替換成綠色熒光基因。所述的傳染性支氣管炎病毒為H120疫苗株。其中所述的轉(zhuǎn)染細(xì)胞是BHK-21。一種反向遺傳操作系統(tǒng)拯救傳染性支氣管炎病毒的方法，其特征在于，按以下步驟進(jìn)行1)將所述多個(gè)重組質(zhì)粒酶切后連接成全長cDNA分子；2)將全長cDNA和所述輔助cDNA在體外轉(zhuǎn)錄成RNA后，共轉(zhuǎn)染病毒復(fù)制許可的宿主細(xì)胞；3)收獲宿主細(xì)胞及上清液，接種雞胚尿囊腔救獲病毒。所述1)步驟中先以提取的H120株病毒基因組RNA為模板反轉(zhuǎn)錄成cDNA ；然后對所述cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增過程中病毒基因組17243位的堿基突變；擴(kuò)增后連接到 PMD19-T載體后進(jìn)行篩選，篩選后進(jìn)行病毒基因組738位的堿基突變；接著接種LB培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，然后按照方法回收目的片段；最后各目的片段通過酶切位點(diǎn)連接成全長cDNA分子。所述2、步驟中以提取的H120株病毒基因組RNA為模板反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后進(jìn)行 N蛋白基因PCR擴(kuò)增，接著進(jìn)行Hind III和Bio I雙酶切；同時(shí)pVAXl載體同樣進(jìn)行Hind III和》ιο I雙酶切；接著將兩者連接獲得重組質(zhì)粒pVAXN ；最后以篩選的pVAXN為模板， PCR擴(kuò)增后回收含N基因的輔助cDNA。構(gòu)建全長cDNA分子過程中將fe基因替換成綠色熒光基因。1)步驟中將H120株基因組根據(jù)IIs型限制性內(nèi)切酶Bsa I的分布情況分成10段進(jìn)行擴(kuò)增，然后將按照權(quán)利要求10中的方法獲得目的片段TM1、TM2、……、TM10，最后按照摩爾濃度1 1將TM2禾口 TM3、TM4禾口 TM5、TM6禾口 TM7、TM8禾口 TM9混合進(jìn)行連接，獲得中間產(chǎn)物 TM2-3、TM4-5、TM6-7、TM8-9，然后將 TM1、TM2-3、TM4-5，TM6-7、TM8-9、TMlO 分別按照摩爾濃度1 1 1的比例混合連接，獲取中間產(chǎn)物TM1-5、TM6-10，最后將TM1-5、TM6-10 按照摩爾濃度1 1比例混合連接得到全長cDNA分子。


圖1 H120病毒株全基因組分段擴(kuò)增的策略。根據(jù)IIs型限制性內(nèi)切酶Bsa I的分布情況，分TMla、TM2、TM3、TM4、TM5、TM6、TM7、TM8、TM9和TMlO等10個(gè)片段對全基因組進(jìn)行分段擴(kuò)增。圖2 H120病毒株全基因組RT-PCR分段擴(kuò)增結(jié)果。RT-PCR獲得10個(gè)DNA片段TMla、 TM2、TM3、TM4、TM5、TM6、TM7、TM8、TM9 禾口 TM10，片段的大小與理論值一致，分另Ij為 0. 9kb、 3. 7kb、2. 9kb、2. 6kb、3. 7kb、3. 7kb、3. 6kb、3. 2kb、3. Ikb、0. 9kb。其中 M 為 DL5000 Marker。圖3 H120病毒株全基因組cDNA分段拼接的策略。其中圖片頂端的字母代表堿基， 是片段間用來連接的末端互補(bǔ)序列；根據(jù)DNA片段的摩爾濃度，按照1 1的比例將TM2和 TM3、TM4和TM5、TM6和TM7、TM8和TM9混合，利用各個(gè)片段間的酶切位點(diǎn)進(jìn)行連接，獲取中間產(chǎn)物 TM2-3, TM4-5, TM6-7, TM8-9 ；再次Mf TMU TM2-3 禾Π ΤΜ4-5，ΤΜ6-7, ΤΜ8-9 禾Π TMlO 按照1 1 1的比例混合后連接，獲取中間產(chǎn)物ΤΜ1-5、ΤΜ6-10 ；最后將ΤΜ1-5、ΤΜ6-10按照 1 1的比例混合后連接，獲取傳染性支氣管炎病毒Η120株基因組全長CDNA，其5’端具有完整的Τ7 RNA聚合酶啟動(dòng)子的核心序列，3’端具有polyA尾巴結(jié)構(gòu)。圖4獲取fe基因替換成綠色熒光基因的H120株全基因組cDNA的示意圖。采用高保真PCR擴(kuò)增綠色熒光基因(EGFP)，用其替換pMDTM9質(zhì)粒中的fe基因，再通過體外拼接獲取fe基因替換成綠色熒光基因的傳染性支氣管炎病毒H120株基因組全長cDNA，其5’ 端具有完整的T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子的核心序列，3’端具有polyA尾巴結(jié)構(gòu)。圖5拯救病毒H120-R的測序鑒定結(jié)果。測序結(jié)果表明H120-R株基因組第738位的堿基為T，而非其親本H120株的C，和設(shè)定的遺傳標(biāo)記結(jié)果相符，突變消除了該處的Bsa I 限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)；測序結(jié)果表明H120-R株基因組第17243位的堿基為T，而非其親本H120毒株的G，和設(shè)定的遺傳標(biāo)記結(jié)果相符，該處的突變引入了一個(gè)Bsa I限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)。圖6拯救病毒H120_5a/EGFP感染雞胚的熒光檢測結(jié)果。取H120_5a/EGFP種毒接種雞胚的咽喉部位粘液、絨毛尿囊膜、羊膜和腸系膜等組織，在熒光倒置顯微鏡下經(jīng)藍(lán)光激發(fā)后，均能在大量的細(xì)胞內(nèi)檢測到綠色的熒光，表明H120-fe/EGFP重組病毒能夠在被感染的雞胚中表達(dá)綠色熒光蛋白。圖7拯救病毒H120-R、H120-5a/EGFP的致雞胚矮小化試驗(yàn)。結(jié)果表明H120-R和 H120-5a/EGFP感染雞胚后均能引起雞胚死亡，出現(xiàn)特征性變化羊膜增厚，緊貼胚體，雞胚發(fā)育受阻，胚體比同日齡正常雞胚矮小，蜷曲，與其親本毒株H120對雞胚的致病性相同。圖8拯救病毒H120-R、H120_fe/EGFP在雞胚中生長曲線的測定。采用熒光定量 RT-PCR測定H120-R、H120-fe/EGFP及其親本毒株H120感染雞胚后不同時(shí)間段的病毒滴度， 結(jié)果表明H120-R及其親本毒株H120的病毒滴度在接種雞胚3 后達(dá)到最高峰，然后逐漸下降；而H120-fe/EGFP的病毒滴度在接種雞胚4 后達(dá)到最高峰。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明，所述實(shí)施例僅是意圖說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的范圍由后附的權(quán)利要求具體限定。1構(gòu)建傳染性支氣管炎病毒H120株的全長基因組cDNA
IB病毒的基因組大小在27. 6kb左右，不同分離株在長度上略有差異。根據(jù)傳染性支氣管炎病毒H120疫苗株基因組全序列(GenBank登錄號(hào)FJ80765》上IIs型限制性內(nèi)切酶 BsaI 的分布情況，分 TMla, TM2、TM3、TM4、TM5、TM6、TM7、TM8、TM9 禾口 TMlO 等 10 個(gè)片段對全基因組進(jìn)行分段擴(kuò)增(圖1)。設(shè)計(jì)覆蓋該病毒全基因組的10對引物，引物序列及其在基因組中的位置(見表1)在TMla擴(kuò)增片段的上游引物TMlS中引入T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子的核心序列，以保證完成全長cDNA拼接后能在體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生病毒基因組RNA ；引物 MU1S、MUlA將H120株病毒基因組第738位的堿基C突變?yōu)門，消除了該處的Bsa I限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(GGTCTC — GGTCTT)，突變前密碼子CTC與突變后密碼子CTT均編碼Leu， 為同義突變，能夠作為拯救病毒的遺傳標(biāo)記，將突變后的DNA片段命名為TMl ；在引物TM6A、 TM7S中引入點(diǎn)突變，擴(kuò)增后將H120株病毒基因組第17243位的堿基G突變?yōu)門，突變前密碼子GGG與突變后密碼子GGT均編碼Gly，為同義突變，獲得的序列GGTCTC為Bsa I限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列，能夠用于全長cDNA的構(gòu)建，也能作為拯救病毒的遺傳標(biāo)記；在引物TM1S、 TM4A、TM5S、TM5A、TM6S、TM8A、TM9S和TMlOA的5，端分別引入Bsa I限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列，以保證后續(xù)全長cDNA的拼接；在下游引物TMlOA中引入25個(gè)堿基T，以保證在TMlO片段3’端具有polyA尾巴結(jié)構(gòu)。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。表1 Hl20基因組全長cDNA擴(kuò)增引物
引物名稱引物位置引物序列(5’-3’ )TMlS1-19GAGhCCTAATACGACTCACTATAGGGACTYKMQKiAaATATTAATTMlA898-919CACGAGCATCCAGTGTTTCTACMUlS751-772GGAGTTGACAAAATAACACCTGMUlA725-750CTTCAATAGGAAAAGACCACAAACAGTM2S875-896CAGCATGCCAGTGGTCTCTTACTM2A4382-4403GCTACAAAATCAGTTGGGTCTCTM3S4367-4386CACAACTTTTGGGTGGAGACTM3A7261-7280CCACTAATGACACCACCAGCTM4S7165-7186GCAACTGTCAAGTCAGGGTCTCTM4A9743-9758GGTCTCCAGGATGTGGCTCTTCTM5S9753-9767GGTCTCATCCTGGTTTTGGAGTM5A13480-13495GGTCTCCCAGACGCTAATGCACTM6S13490-13506GGTCTCGTCTGGTATTACTCATC
權(quán)利要求
1.一種傳染性支氣管炎病毒H120疫苗株反向遺傳操作系統(tǒng)，其特征在于，該系統(tǒng)包括1)構(gòu)建RNA病毒的全長cDNA分子，該全長cDNA分子其5，端具有完整的T7RNA聚合酶啟動(dòng)子的核心序列，3’端具有polyA尾巴結(jié)構(gòu)；2)輔助cDNA，輔助cDNA編碼所述傳染性支氣管炎病毒H120疫苗株的核蛋白(N)的 cDNA序列，其5’端具有完整的T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子的核心序列，3’端具有polyA尾巴結(jié)構(gòu)；3)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的傳染性支氣管炎病毒H120疫苗株反向遺傳操作系統(tǒng)，其特征在于，全長cDNA分子中基因組第738位的堿基從C突變?yōu)門。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的傳染性支氣管炎病毒H120疫苗株反向遺傳操作系統(tǒng)，其特征在于，全長cDNA分子中基因組第17243位的堿基從G突變?yōu)門。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的傳染性支氣管炎病毒H120疫苗株反向遺傳操作系統(tǒng)，其特征在于，構(gòu)建全長cDNA分子的多個(gè)重組質(zhì)粒中的cDNA序列兩端具有限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，以實(shí)現(xiàn)片段間的定向克隆，用于構(gòu)建所述傳染性支氣管炎病毒H120疫苗株的全長cDNA 分子。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的傳染性支氣管炎病毒H120疫苗株反向遺傳操作系統(tǒng)，其特征在于，所述的限制性內(nèi)切酶是Bsa I。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的傳染性支氣管炎病毒H120疫苗株反向遺傳操作系統(tǒng)，其特征在于，全長cDNA分子中的fe基因替換成綠色熒光基因。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任何一項(xiàng)的反向遺傳操作系統(tǒng)，其特征在于，其中所述的傳染性支氣管炎病毒為H120疫苗株。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任何一項(xiàng)的反向遺傳操作系統(tǒng)，其特征在于，其中所述的轉(zhuǎn)染細(xì)胞是BHK-21。
9.一種利用上述任一項(xiàng)權(quán)利要求的反向遺傳操作系統(tǒng)拯救傳染性支氣管炎病毒的方法，其特征在于，按以下步驟進(jìn)行1)將所述多個(gè)重組質(zhì)粒酶切后連接成全長cDNA分子；2)將全長cDNA和所述輔助cDNA在體外轉(zhuǎn)錄成RNA后，共轉(zhuǎn)染病毒復(fù)制許可的宿主細(xì)胞；3)收獲宿主細(xì)胞及上清液，接種雞胚尿囊腔救獲病毒。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的反向遺傳操作系統(tǒng)拯救傳染性支氣管炎病毒的方法，其特征在于，所述1)步驟中先以提取的H120株病毒基因組RNA為模板反轉(zhuǎn)錄成cDNA ；然后對所述 cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增過程中基因組17243位的堿基突變；擴(kuò)增后連接到pMD19_T載體后進(jìn)行篩選，篩選后進(jìn)行病毒基因組第738位的堿基突變；接著接種LB培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，然后按照方法回收目的片段；最后各目的片段通過酶切位點(diǎn)連接成全長cDNA分子。
11.根據(jù)權(quán)利要求9的反向遺傳操作系統(tǒng)拯救傳染性支氣管炎病毒的方法，其特征在于，所述2)步驟中以提取的H120株病毒基因組RNA為模板反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后進(jìn)行N蛋白基因PCR擴(kuò)增，接著進(jìn)行Hind III和Β ο I雙酶切；同時(shí)pVAXl載體同樣進(jìn)行Hind III和 Xho I雙酶切；接著將兩者連接獲得重組質(zhì)粒pVAXN ；最后以篩選的pVAXN為模板，PCR擴(kuò)增后回收含N基因的輔助cDNA。
12.根據(jù)權(quán)利要求10的反向遺傳操作系統(tǒng)拯救傳染性支氣管炎病毒的方法，其特征在于，構(gòu)建全長cDNA分子過程中將fe基因替換成綠色熒光基因。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的反向遺傳操作系統(tǒng)拯救傳染性支氣管炎病毒的方法，其特征在于，將H120株基因組根據(jù)IIs型限制性內(nèi)切酶BsaI的分布情況分成10段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后將按照權(quán)利要求10中的方法獲得目的片段TM1、TM2、……、TM10，最后按照摩爾濃度1 Mf TM2禾Π ΤΜ3、ΤΜ4禾Π ΤΜ5、ΤΜ6禾Π ΤΜ7、ΤΜ8禾Π ΤΜ9 t昆合進(jìn) 亍連接，獲得中間產(chǎn)物 ΤΜ2-3、ΤΜ4-5、ΤΜ6-7、ΤΜ8-9，然后將 ΤΜ1、ΤΜ2-3、ΤΜ4-5，ΤΜ6-7、ΤΜ8-9、TMlO 分別按照摩爾濃度1 1 1的比例混合連接，獲取中間產(chǎn)物ΤΜ1-5、ΤΜ6-10，最后將ΤΜ1-5、ΤΜ6-10按照摩爾濃度1 1比例混合連接得到全長cDNA分子。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的反向遺傳操作系統(tǒng)拯救傳染性支氣管炎病毒的方法，其特征在于，構(gòu)建全長cDNA分子過程中將fe基因替換成綠色熒光基因，其余按照權(quán)利要求14 的方法獲得全長cDNA分子。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種傳染性支氣管炎病毒H120疫苗株的反向遺傳操作系統(tǒng)及其操作方法，該系統(tǒng)包含用于構(gòu)建所述傳染性支氣管炎病毒H120疫苗株基因組全長cDNA的多個(gè)重組質(zhì)粒，及其輔助cDNA，其中所述輔助cDNA編碼傳染性支氣管炎病毒H120疫苗株核蛋白(N)。通過上述反向遺傳操作系統(tǒng)，成功拯救獲得了基因突變或基因置換的H120病毒株。本發(fā)明為進(jìn)一步開展傳染性支氣管炎病毒分子病毒學(xué)研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。本發(fā)明還涉及由所述反向遺傳操作系統(tǒng)產(chǎn)生和衍生的在疾病診斷、疫苗研制上的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N15/09GK102382812SQ201010588470
公開日2012年3月21日 申請日期2010年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月15日
發(fā)明者劉梅, 周生, 唐夢君, 尤素蘭, 戴亞斌, 戴有理, 沈欣悅, 程旭, 許玲霞, 趙寶華 申請人:周生, 唐夢君, 江蘇省家禽科學(xué)研究所