專利名稱：貝類gⅱ型扎幌樣病毒檢測用的引物、探針、檢測方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物檢測技術(shù)，具體涉及貝類GII型扎幌樣病毒的檢
背景技術(shù)：
扎幌樣病毒(Sapporo-like viruses, SLVs)屬于人類杯狀病毒科，是 引起非菌性急性胃腸炎暴發(fā)流行的重要因素之一，在世界上很多國家 均有其爆發(fā)流行的相關(guān)報道。SLVs為單股正鏈RNA病毒，包括3個 開放閱讀框(ORF)。扎幌樣病毒一般被分為GI、 GII、 GIII、 GIV、 GV5個亞型，其中除GIII感染豬外，其它四個亞型均只感染人類。 GII型扎幌樣病毒的基因序列多變，樣本中的病毒含量較低，不易被 檢測。GII型SLVs可通過糞口途徑和人-人接觸進行傳播。生食貝類 等水產(chǎn)品可引起GII型扎幌樣病毒的大面積感染，因此如果能在貝類 等水產(chǎn)品中檢測GII型SLVs，并對感染的食品源頭加以控制，有利 于政府監(jiān)控GII型SLVs突發(fā)公共衛(wèi)生事件，具有重要的社會和經(jīng)濟 價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供貝類GII型扎幌樣病毒檢測用的引物、探 針和試劑盒。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種貝類GII型扎幌樣病毒的檢測方法。
本發(fā)明目的通過如下方案予以實現(xiàn)通過分析已報道扎幌樣病毒 RNA多聚酶與衣殼蛋白的連接區(qū)域，分別設(shè)計引物和探針序列用于
實時熒光定量PCR。上游引物的核苷酸序列(SLVs-FP)如SEQ ID NO:l所示，下游引物的核苷酸序列(SLVs-RP)如SEQ ID NO: 2所 示(通用核苷酸符號y=cort; s=corg; r=aorg; h=a, cort; v=a, c or g);與該引物配合使用的探針的核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所 示，且該探針5'端標(biāo)記有報告基團(如FAM、 VIC等)，3'端標(biāo)記有 熒光淬滅基團(如TAMRA等)。以樣本總RNA為模板，在50nL反 應(yīng)體系中含有5X熒光定量PCR緩沖液10jiL， lpL dNTPs
(20ummol/L)， 1.5pL引物SLVs-RP (10ummol/L)， L5pL引物 SLVs-FP (10ummol/L)， l^L熒光探針(10ummol/L)， 50 ng總RNA
(3pL)， lnLTaq酶(3U)，并用DEPC處理水補充到50pL，進行實 時熒光定量PCR擴增，反應(yīng)條件是93°C， 3min; 93°C， 30s; 54°C， 40s共做40個循環(huán)。當(dāng)探針完整的時候，5'端報告基因所發(fā)射的熒光 能量被3'端淬滅基團吸收，儀器檢測不到熒光信號；隨著實時熒光定 量PCR的進行，Taq酶在鏈延伸過程中遇到與模板結(jié)合的探針，其5' —3'外切核酸酶活性就會將探針切斷，報告基因遠(yuǎn)離淬滅基團，其 能量不能被吸收故發(fā)出的熒光信號被儀器檢測到，每個循環(huán)接收采集 數(shù)據(jù)，故每經(jīng)過一個PCR循環(huán)，熒光信號隨著目的片段的延伸有一 個同步指數(shù)增長的過程，反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)擴增曲線判定結(jié)果，從而實 現(xiàn)對GII型扎幌樣病毒的檢測和定量。也可用含有本發(fā)明引物和探針的試劑盒通過實時熒光定量PCR檢測貝類GII型扎幌樣病毒。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點本發(fā)明引物和探針特異 性好，制備成試劑盒用于貝類GII型扎幌樣病毒的檢測靈敏度、準(zhǔn)確
性高；本發(fā)明檢測方法可以快速直觀判斷樣品是否含有GII型扎幌樣 病毒，并能準(zhǔn)確測定樣品中GII型扎幌樣病毒的拷貝數(shù)含量。


圖1為實施例3中實時熒光定量PCR檢測GII型扎幌樣病毒的 標(biāo)準(zhǔn)曲線；
圖2為實施例4中實時熒光定量PCR檢測GII型扎幌樣病毒的 結(jié)果；
其中，1為貝類中GII型扎幌樣病毒的實時熒光定量PCR擴增結(jié) 果，2為干凈貝類中GII型扎幌樣病毒的實時熒光定量PCR擴增結(jié)果， 3為貝類中諾瓦克樣病毒陽性質(zhì)粒的實時熒光定量PCR擴增結(jié)果；
圖3為實施例5中實時熒光定量PCR檢測GII型扎幌樣病毒的 靈敏度實驗；
其中，1表示貝類中GII型扎幌樣病毒的量為106拷貝4丄，2表 示貝類中GII型扎幌樣病毒的量為1()S拷貝/^iL， 3表示貝類中GII型 扎幌樣病毒的量為104拷貝/^， 4表示貝類中GII型扎幌樣病毒的量 為1()S拷貝4iL， 5表示貝類中GII型扎幌樣病毒的量為102拷貝/^， 6表示貝類中GII型扎幌樣病毒的量為10拷貝/pL， 7為陰性對照。
具體實施例方式
6下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的描述，但具體實施例并 不對本發(fā)明做任何限定。 實施例1引物及探針的設(shè)計和合成
從GenBank下載GII型扎幌樣病毒所有同源基因序列，引物和探 針由Invitrogen公司合成。根據(jù)與GII型扎幌樣病毒標(biāo)準(zhǔn)株(GeneBank No. AJ249939)的所有同源基因序列，用Bioedit軟件進行同源性比 對，用primer Express3.0軟件，設(shè)計出引物及TaqMan探針，擴增目 的片段長度為116bp。
上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO:l所示；
下游引物核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示；
與上述引物配合使用的探針的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。 該探針5'端標(biāo)記有報告FAM熒光染料，另3'端標(biāo)記有淬滅TAMRA 熒光染料。
實施例2總RNA的提取
提取步驟如下
1) 取20g污染了病毒的貝類胃、腸組織，加入20mL甘氨酸緩 沖液，勻漿器快速勻漿3min;
2) 取lOmL勻漿液裝于離心管中,室溫下充分振蕩后，4°C 6000 r/min離心30min;
3) 調(diào)上清液pH至7.5，加入等體積的8。/。PEG6000,4t:沉淀4h 后，4 °C 6000 r/min離心30min;4) 棄上清，加入10mL pH9.0的PBS振蕩；加入等體積氯仿， 充分混勻，4 °C 6000r/min離心30min，棄去沉淀，保留上清液；
5) 調(diào)節(jié)上清液pH值至7.0，再用16。/。PEG6000 4t:沉淀2h后， 4 。C 6000 r/min離心30min;
6) 棄上清，加入lml的Trizol試劑提取RNA，反應(yīng)管室溫靜置 5min，加入0.2ml氯仿，置4。C， 12000rpm離心15min;
7) 取上層水相的1/3體積轉(zhuǎn)入滅菌離心管，加入等體積異丙醇， 置—20。C靜置2h，然后4。C， 12000rpm離心15min，棄去上清；
8) 用lml含75。/。DEPC的乙醇洗滌沉淀，吹打混勻。置4。C， 12000rpm離心5min。吸去大部分乙醇，空氣干燥10min，加適量滅菌 DEPC雙蒸水溶解沉淀，-70"保存。
實施例3 實時熒光定量PCR擴增方法的建立
1、 實時熒光定量PCR反應(yīng)體系
以總RNA為模板，進行實時熒光定量PCR反應(yīng)，即在50iiL反 應(yīng)體系中含5X定量PCR緩沖液10pL， lpLdNTPs (20ummol/L)， 1.5pL弓|物SLVs-RP(10ummol/L)， 1.5pL引物SLVs陽FP( 1Oummol/L)， 1)iL熒光探針(10ummol/L)， 50 ng總RNA(3fiL), lpL Taq酶(3U)， 并用DEPC處理水補充到50pL。
2、 實時熒光定量PCR反應(yīng)條件
將樣品管放入ABI公司7000熒光PCR儀后，設(shè)置如下條件進行 93°C， 3min; 93°C， 30s; 54°C， 40s共做40個循環(huán)。每個循環(huán)結(jié)束后采集數(shù)據(jù)。反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)擴增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線判定結(jié)果。 3.實時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
將GII型扎幌樣病毒116bp基因片段克隆到PCR2.1-TOPO載體 中構(gòu)建成GII型SLVs的陽性質(zhì)粒，調(diào)整質(zhì)粒至lxl0W拷貝/pL。然后 以10倍系列稀釋的陽性質(zhì)粒為定量陽性標(biāo)準(zhǔn)模板，建立GII型扎幌 樣病毒的實時熒光定量PCR反應(yīng)。結(jié)果顯示在102 106拷貝范圍內(nèi) GII型扎幌樣病毒檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線有很好的線性關(guān)系(圖1)。
實施例4 GII型扎幌樣病毒實時熒光定量PCR方法的特異性確定
以污染病毒的貝類總RNA為模板，以干凈貝類、諾瓦克樣病毒 陽性質(zhì)粒為對照，通過實時熒光定量PCR檢測熒光強度變化。結(jié)果 顯示，以污染GII型扎幌樣病毒的貝類總RNA為模板，通過實時熒 光定量PCR檢測可觀察到明顯的熒光強度變化和很好的陽性擴增結(jié) 果，而干凈貝類、諾瓦克樣病毒陽性質(zhì)粒的熒光強度沒有變化。提示 本發(fā)明所建立的實時熒光定量PCR體系對GII型扎幌樣病毒有很好 的特異性(圖2)。
實施例5 靈敏度實驗
用DEPC處理水分別稀釋GII型扎幌樣病毒陽性模板，以污染 GII型扎幌樣病毒的貝類總RNA為模板，通過實時熒光定量PCR檢 測熒光強度變化。實驗結(jié)果顯示，實時熒光定量PCR檢測可觀察到 明顯的熒光強度變化和很好的陽性擴增結(jié)果，貝類中GII型扎幌樣病 毒的實時熒光定量PCR動力學(xué)曲線顯示，濃度在102拷貝以上的反應(yīng) 體系有明顯的熒光增長，而10i拷貝和陰性對照均無熒光增長，因此該實時熒光定量PCR檢測體系的最低檢出限為102拷貝，即其靈敏度為1Q2拷貝4iL (圖3)。貝類GII型扎幌樣病毒檢測用引物、探針、檢測方法及試劑盒SEQUENCE LISTING
<110>廣東藥學(xué)院
<120>貝類GII型扎幌樣病毒檢測用的引物、探針、檢測方法及試劑盒
<130>
〈160> 3
<170〉 Patentln version 3. 2
<210> 1
<211> 21
<212〉 DNA
<213> 人工序列
<400> 1
rcccactcaa gttgagacay c 21
<210> 2
<211> 21
<212> 腿<213>人工序列
<400〉 2
traccgcagc aaaacahtch c
<210> 3
〈211〉 24
<212> 腿〈213>人工序列
<400> 3
tcagcgtgtr gadcttgcaa tgsc
權(quán)利要求
1.一種貝類GII型扎幌樣病毒檢測用的引物，其上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO2所示。
2. —種貝類GII型扎幌樣病毒檢測用的探針，其特征在于該探針 與權(quán)利要求1所述引物配合使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的探針，其特征在于該探針核苷酸序列 如SEQ ID NO:3所示。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的探針，其特征在于該探針5'端標(biāo)記有 報告基團，3'端標(biāo)記有熒光淬滅基團。
5. —種貝類GII型扎幌樣病毒檢測用的試劑盒，其特征在于該試 劑盒含有權(quán)利要求1所述的引物和權(quán)利要求2所述的探針。
6. —種貝類GII型扎幌樣病毒的檢測方法，其特征在于該方法是 以樣品總RNA為模板，利用權(quán)利要求1所述的引物和權(quán)利要求2所 述的探針進行實時熒光定量 PCR擴增。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測方法，其特征在于該方法是以樣 品RNA為模板，建立如下反應(yīng)體系·5 X熒光定量PCR緩沖液 10pL dNTPs 1 pL·10ummol/L上游引物 1.5pL 10ummol/L下游引物 1.5)iL 10ummol/L探針 l)iL總RNA 3pL3U Taq酶 lpL，用DEPC處理水補充到5(HiL，將該體系進行實時熒光定量PCR擴增，根據(jù)擴增曲線判定樣品是否含有貝類GII型扎幌樣病毒。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測方法，其特征在于該方法的反應(yīng)條件是93°C， 3min; 93°C， 30s; 54°C， 40s，共做40個循環(huán)。
全文摘要
本發(fā)明公開了貝類GII型扎幌樣病毒檢測用的引物、探針、檢測方法及試劑盒。本發(fā)明上游引物的正向核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，反向下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO2所示；與該引物配合使用的探針，其核苷酸序列如SEQ ID NO3所示，且該探針5’端標(biāo)記有報告基團，3’端標(biāo)記有熒光淬滅基團，上述引物和探針可制備成試劑盒用于貝類GII型扎幌樣病毒檢測。本發(fā)明還公開了一種檢測貝類GII型扎幌樣病毒的方法。本發(fā)明引物和探針特異性好，制備成試劑盒用于貝類GII型扎幌樣病毒的檢測靈敏度、準(zhǔn)確性高；本發(fā)明檢測方法可以快速直觀判斷樣品是否含有GII型扎幌樣病毒，并能準(zhǔn)確測定樣品中GII型扎幌樣病毒的拷貝數(shù)含量。
文檔編號C12Q1/70GK101660004SQ20091004083
公開日2010年3月3日 申請日期2009年7月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月3日
發(fā)明者曾愛華, 朱家勇, 梅寒芳, 禇夫江, 金小寶, 艷 馬 申請人:廣東藥學(xué)院