本發(fā)明屬于生物監(jiān)測領(lǐng)域，具體涉及一種抗pedv的單克隆抗體及其化學發(fā)光方法檢測方法。

背景技術(shù)：

豬流行性腹瀉（ped）由豬流行性腹瀉病毒（pedv）引起豬只發(fā)生嘔吐、腹瀉、腸炎、脫水以及哺乳仔豬的高死亡率為特征。所有不同階段的豬群均可感染，發(fā)病率可達100%，哺乳仔豬的死亡率高達90%以上。在許多養(yǎng)豬業(yè)發(fā)達的國家都己有此病暴發(fā)的報道,尤其是在亞洲、歐洲等地區(qū)引起了重大的經(jīng)濟損失。

ped首次在1971年于英國報道，隨后在1978年該病在比利時和英國首次得到鑒定，我國于1984年證實該病在的存在，目前世界上大多數(shù)養(yǎng)豬國家都有該病的報道，尤其以韓國、日本、中國、泰國和越南等國家發(fā)病嚴重。自2010年秋以來,我國南方部分省份出現(xiàn)了嚴重的仔豬流行性腹瀉,發(fā)病情況比先前更為兇猛，造成仔大量的哺乳仔豬發(fā)病死亡，尤其是7日齡以內(nèi)的仔豬死亡率高達100%，給養(yǎng)殖戶造成了巨大的經(jīng)濟損失，并已成為影響我國養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的重要疫病之一。由于ped與豬傳染性胃腸炎(tge)在流行病學、臨床癥狀等變化上非常相似這給該病的快速診斷與防治都帶來了一定困難。另外，由于pedv具有在體外分離培養(yǎng)難度大的特點，在研制單克隆抗體方面大多通過原核表達病毒的某個蛋白，制備抗相應(yīng)蛋白的單克隆抗體，而通過pedv疫苗弱毒株，研制出抗pedv的igg2a單克隆抗體，并利用單克隆抗體，建立化學方法檢測pedv方法，未見報道。因此，本研究利用空斑純化技術(shù)，從豬流行性腹瀉-豬傳染性胃腸炎-輪狀病毒的三聯(lián)弱毒疫苗中獲得pedv弱毒株，作為抗原，制備pedv單克隆抗體，并建立化學發(fā)光檢測技術(shù)及應(yīng)用于該病的診斷，對該病的有效診斷與防控具有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種抗pedv的單克隆抗體及其化學發(fā)光方法檢測方法，主要利用空斑純化技術(shù)，從豬流行性腹瀉病毒-豬傳染性胃腸炎-豬輪狀病毒的三聯(lián)活疫苗中純化獲得pedv弱毒，通過細胞培養(yǎng)、梯度離心、免疫小白鼠和制備單克隆抗體核心技術(shù)，獲得抗pedv單克隆抗體雜交瘤細胞株及pedvigg2a單克隆抗體，單克隆抗體具有效價高、特異性強及穩(wěn)定性好等特點。利用pedv單克隆抗體，通過包被液、單抗包被濃度等系列條件優(yōu)化，建立了一種檢測pedv的化學發(fā)光檢測方法。該方法具有特異性強、敏感性高、一次性檢測量大及穩(wěn)定性好等特點,能檢測到0.26ng的病毒。建立的化學發(fā)光檢測方法，應(yīng)用表明與rt-pcr檢測技術(shù)的符合率在95%以上，與熒光定量rt-pcr檢測方法符合率100%，適合對pedv的快速診斷。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種利用所述pedv單克隆抗體建立檢測pedv的化學發(fā)光檢測方法，具體包括如下步驟：

（1）抗體包被：采用磷酸鹽緩沖液為包被液，以4ug/mlpedv單克隆抗體濃度包被于固相載體微孔板上，100ul/孔，37℃孵育2h或4℃過夜，洗滌3次；

（2）封閉：以2.5%bsa作為封閉液體封閉覆蓋微孔板，每孔300ul/孔，4℃過夜，洗板3次；

（3）加樣：依次加入樣品，100ul/孔37℃溫育1小時，洗板3次；

（4）加酶標二抗：加入hrp酶標記的pedv單克隆抗體，以1:4000稀釋后的液體加100ul/孔，37℃45min，洗板6次；

（5）加檢測底物：加入化學發(fā)光底物液thermoscientificsupersignalelisafemto底物液（購自thermofisher）100ul/孔，避光反應(yīng)3分鐘；

（6）檢測：用發(fā)光檢測儀測定發(fā)光計數(shù)。

hrp酶標記pedv單克隆抗體的方法通過常規(guī)方法標記獲得。

本發(fā)明的優(yōu)點在于：

所獲得單克隆抗體具有特異性強，穩(wěn)定性好，抗體效價高等特點（elisa和ifa效價均在10^-5），且是針對pedvm蛋白的單克隆抗體，同時pedv單克隆抗體株具有中和病毒特性，其效價為10^-3。利用pedv單克隆抗體，建立了一種檢測pedv的化學發(fā)光檢測方法，該方法具有特異性強（只能檢測到pedv），敏感性高(能檢測到0.26ng的病毒，比普通rt-pcr敏感10倍以上)、操作簡單（相當于普通elisa檢測方法）、一次性檢測量大（一次可以檢測80以上個樣品）及穩(wěn)定性好等特點，具有比其他檢測方法無可比擬的絕對優(yōu)勢。應(yīng)用表明與rt-pcr檢測技術(shù)的符合率在95%以上，與熒光定量rt-pcr檢測方法符合率100%。適合對pedv的快速診斷及科研試驗。

附圖說明

圖1是pedv接種vero細胞導(dǎo)致細胞出現(xiàn)萎縮脫落的病變。

圖2是pedv接種vero細胞的空斑形態(tài)。

圖3是pedv-e1雜交瘤細胞上清ifa染色結(jié)果。

具體實施方式

本發(fā)明主要是利用空斑純化技術(shù)，從豬流行性腹瀉病毒-豬傳染性胃腸炎-豬輪狀病毒的三聯(lián)活疫苗中純化獲得pedv弱毒，病毒通過梯度離心、免疫小白鼠和制備單克隆抗體核心技術(shù)，獲得抗pedvigg2a單克隆抗體雜交瘤細胞株及相應(yīng)單克隆抗體。利用單克隆抗體，通過系列條件優(yōu)化，首次建立化學發(fā)光診斷技術(shù)，用于防治ped疾病。以下說明本發(fā)明制備抗pedvigg2a單克隆抗體及建立的化學發(fā)光檢測方法在疫病診斷防控中應(yīng)用，選用理由及其具體操作方法：

實施例1

（一）純化培養(yǎng)ped病毒

利用空斑純化技術(shù)，通過vero細胞從豬流行性腹瀉-豬傳染性胃腸炎-輪狀病毒的三聯(lián)弱毒疫苗中，純化獲得pedv毒株。該病毒能致vero細胞出現(xiàn)典型的病理變化（見附圖1），病毒效價達10^-7.5/0.1ml,為制備pedv單克隆抗體奠定基礎(chǔ)。其空斑純化步驟如下：

1、用dmem沖洗長滿單層vero細胞的6孔板3遍；加入400μl倍比稀釋（10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7）的病毒液，并設(shè)置陰性對照加入400μldmem，37℃孵育45min，每15min搖勻以充分接觸；孵育后吸出病毒液，用dmem沖洗3遍，每孔加入4ml低熔點瓊脂混合液（2.0%低熔點瓊脂與2×dmem等比例混合，并加入1.5%的fbs）；待其凝固后，37℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)4-6d，注意觀察；空斑隨時間而慢慢變大，我們發(fā)現(xiàn)病毒在10^-6稀釋度時，其空斑形態(tài)最容易觀察和辨別，隨后棄覆蓋瓊脂，用0.5%結(jié)晶紫染色后，可以清晰的看到典型的pedv空斑(附圖2)。

2、挑取合適的空斑于400μldmem（無血清）中，凍融4次，將病毒液進行5輪的空斑純化。待空斑長置合適大小的時候，棄覆蓋瓊脂，用10%甲醛固定20min，0.5%結(jié)晶紫染液染色10min，pbs沖洗3遍，觀察并記錄空斑形態(tài)。

3、將5輪純化過的病毒液于vero細胞中擴大培養(yǎng)，收集病毒液進行pcr鑒定，確定病毒液是否存在其他嗜細胞系病毒。結(jié)果表明純化的病毒液中豬傳染性胃腸炎和輪狀病毒等其他嗜細胞系病毒檢測為陰性，而pedv檢測為陽性。說明試驗獲得單一pedv毒株。

(二)制備pedvigg2a單克隆抗體

1、ped抗原制備

將pedv接種于vero細胞單層，培養(yǎng)2～3d，當細胞病變達85%以上時，收獲細胞毒。細胞毒經(jīng)超聲裂解，10000r·min^-1離心60min，取上清液，45000r·min^-1離心180min，用0.01mol·l^-1pbs（ph7.2）懸浮沉淀，即為粗提病毒；取粗提抗原鋪依次墊于30%-60%蔗糖-pbs，33000r·min^-1離心150min，收集30-40%病毒目的條帶，重懸于pbs中，45000r·min^-1離心180min洗脫蔗糖，沉淀重懸于pbs中即為純化的病毒抗原，經(jīng)w-b和rt-pcr鑒定為pedv后，測定蛋白濃度為4mg/ml，用于免疫balb/c小鼠。

2、免疫balb/c小鼠

采用常規(guī)免疫方法進行長程免疫。將取純化病毒抗原(1mg/ml)與等體積弗氏完全佐劑乳化后，皮下多點注射6周齡babl/c鼠，0.2ml/只。初次免疫后第14天、28天和第42天，取抗原與弗氏不完全佐劑等量混勻乳化，進行二免、三免及四免，當血清elisa抗體效價達1:10000以上時，于融合前3天取純化抗原經(jīng)尾靜脈加強免疫，100μg/只。

3、細胞融合

即無菌取免疫小鼠脾臟，分散脾淋巴細胞，1000rpm離心10min，將細胞疏松后加nh4cl，冰浴10min，同上離心，疏松、重懸于10mldmem，收集sp2/o細胞，進行脾細胞和sp2/o細胞計數(shù)，取脾細胞和sp2/o細胞按6:1的比例混合，1200r·min^-1離心5min，疏松后1min內(nèi)緩緩加入1ml37℃預(yù)熱的peg進行細胞融合，捻轉(zhuǎn)5min，緩慢加入dmem，同上離心，疏松細胞后，重懸雜交瘤細胞于含20%牛血清的hat-dmem培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)脾細胞數(shù)量，加到96孔細胞培養(yǎng)板，0.1ml/孔，置37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第5天補加0.1ml含15%牛血清的ht-dmem，每天觀察生長情況，待細胞長至孔底的1/3，或培養(yǎng)液變黃時，上清進行抗體檢測。

4、pedv間接elisa方法的建立

pedv抗原用ph9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋，包被于elisa板條，100μl/孔，置37℃2h，0.01mpbst洗滌液洗滌3次后，以1.5％bsa-pbst封閉，300μl/孔，37℃2h，同上洗滌，加入雜交瘤細胞培養(yǎng)上清液，100μl/孔，37℃反應(yīng)1h，同上洗滌后加1:40000稀釋的羊抗鼠igg辣根過氧化物酶，100μl/孔，37℃反應(yīng)1h，同上洗滌后，加入opd，100μl/孔，37℃避光顯色15min，2mol／lh2so4終止反應(yīng)，在自動酶聯(lián)檢測儀上測定各孔的od490值，以p:n≥2.1時，判斷為雜交瘤細胞分泌抗體陽性。經(jīng)方陣滴定法測定，當抗原包被濃度為2.5μg/0.1ml/孔，血清稀釋度為1:2000或抗原包被濃度為3.5μg/0.1ml/孔，血清稀釋度為1:4000時，陽性血清od490值均達1.0，陰性血清的od490值較小，od490值均在0.08以下，p/n值達15以上，確定最佳抗原包被濃度為2.5-3.5μg/0.1ml/孔。

5、篩選陽性雜交瘤細胞株

用間接elisa篩選雜交瘤細胞生長孔特異性抗體，從檢出的陽性孔中，挑選od值高、細胞形態(tài)好生長旺盛且不與正常細胞培養(yǎng)物交叉的陽性孔，通過飼養(yǎng)細胞培養(yǎng)，進行有限稀釋法克隆。經(jīng)多次有限稀釋后，獲得1株能穩(wěn)定分泌抗pedv抗體的雜交瘤細胞株，命名為pedv-e1。這株細胞在體外連續(xù)培3個月，能穩(wěn)定分泌抗體，經(jīng)液氮凍存、復(fù)蘇后，細胞生長良好，且上清液抗體效價不變。

6、腹水制備

6.1babl/c小鼠誘導(dǎo)

8周齡balb/c小鼠腹腔注射滅菌的液體石蠟進行誘導(dǎo)，分籠飼養(yǎng)8天。取對數(shù)生長期的雜交瘤細胞，經(jīng)1500r/min離心5min沉淀細胞，用不含血清的dmem約1ml重懸，腹腔注射石蠟誘導(dǎo)的babl/c鼠，每只小鼠注射1×10⁶雜交瘤細胞。

6.2收集腹水

小鼠注射雜交瘤細胞約10天后觀察小鼠腹部，有產(chǎn)生腹水的小鼠腹部會明顯膨大。此時采用引流收集腹水，1000r/min，離心15min，收集上層淡黃色腹水，采用thermo公司生產(chǎn)的nabtmspinkits試劑盒進行純化，測定elisa效價和間接免疫熒光試驗（ifa）效價，做好標記，凍于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

6.3pedv感染細胞的制備及免疫熒光試驗(ifa)

將pedv接種于已長成單層的vero96孔細胞板，37℃5%co2培養(yǎng)至30%細胞出現(xiàn)病變時，棄上清，pbs洗滌1次，每孔加入預(yù)冷甲醇100μl，4℃固定30min，棄甲醇，pbs洗滌1次，涼干后，-30℃凍存?zhèn)溆?。同樣處理不接毒的vero細胞用于陰性對照。ifa檢測時，于上述細胞板中每孔加入30ul雜交瘤細胞培養(yǎng)上清液于37℃作用30min，用0.85%生理鹽水洗滌3次，每次5分鐘，甩干，加羊抗鼠igg-fitc每孔30ul，37℃作用30分鐘，洗滌同上，甩干，加50%pbs—甘油，每孔30ul，于倒置熒光顯微鏡下觀察ifa染色結(jié)果,具有熒光反應(yīng)（見附圖3）。

7、單抗特性分析

7.1單抗亞級份的測定

按照單克隆抗體分型試劑盒介紹的方法進行。經(jīng)過抗體亞型試劑盒鑒定，單抗在亞類鑒定中pedv-e1株屬于igg2a。

7.2細胞株穩(wěn)定性試驗

將具有分泌特性的雜交瘤細胞體外連續(xù)培養(yǎng)2個月，每15天檢測其上清液的抗體效價穩(wěn)定；將液氮凍存的陽性雜交瘤細胞每個月復(fù)蘇一次，連續(xù)3個月，測定上清抗體效價基本不變。

7.3單抗特異性的測定

單抗只能識別pedv；間接免疫熒光試驗（ifa）結(jié)果表明：單抗都不與vero細胞、prrsv、prv、pcv2和scfv發(fā)生反應(yīng)，說明單抗的特異性好。

7.4單抗elisa效價及單抗ifa價測定

應(yīng)用間接elisa檢測雜交瘤培養(yǎng)上清液和ifa腹水抗體的效價，雜交瘤細胞上清液用抗體稀釋液稀釋成2^-1～2^-10，腹水用抗體稀釋液按10倍稀釋成10^-2～10^-8。結(jié)果elisa效價pedv-e1株單抗的培養(yǎng)上清液為2^-5，腹水抗體效價為10^-5，ifa效價為10^-5。

8westernblot試驗

以pedv抗原進行sds-page電泳。轉(zhuǎn)印至nc膜用tbs-t封閉，4℃過夜，tbs-t洗膜3次，加1:100倍稀釋的腹水單克隆抗體，37℃作用2h，洗滌，加入羊抗鼠igg堿性磷酸酶標記抗體(1:10000)，室溫反應(yīng)2h，同上洗滌，置于底物顯色，結(jié)果表明pedv-e1是針對m蛋白的單克隆抗體。

(三)建立pedv化學發(fā)光檢測方法

1、化學發(fā)光的工作流程

本實驗采用酶促化學發(fā)光免疫檢測的方法，以pedv單克隆抗體作為包被抗體、以hrp標記的pedv單克隆抗體為標記抗體。具體工作流程如下：（1）包被：將pedv單克隆抗體包被于固相載體微孔板上,100ul/孔，37℃孵育2h或4℃過夜，洗滌3次；（2）封閉：覆蓋微孔板每孔加入2.5%bsa進行封閉，300ul/孔，4℃過夜，洗板3次;（3）加樣：依次加入樣品100ul/孔，濃度為80ug/ml（s5），37℃溫育1h，洗板3次；（4）加二抗：hrp酶標記的pedv單克隆抗體（以1:4000稀釋后的液體）100ul/孔，37℃40min，洗板6次；（5）加檢測底物：加入化學發(fā)光檢測thermoscientificsupersignalelisafemto底物液購自thermofisher）100ul/孔，避光反應(yīng)3分鐘；(6)檢測：用發(fā)光檢測儀測定發(fā)光計數(shù)。

2、化學發(fā)光工作條件的優(yōu)化

2.1包被液的選擇

按化學發(fā)光工作流程，選擇3種緩沖液，第一種為5%bsa磷酸鹽緩沖液，第2種為磷酸鹽緩沖液，第三種為碳酸鹽緩沖液。稀釋包被單克隆抗體，其它條件不變，根據(jù)單克隆抗體包被濃度80ug（s5）/0ug(s0)的值確定最佳包被液。結(jié)果以磷酸鹽緩沖液為包被緩沖液時，其s0點的發(fā)光值明顯低于其他包被液，且s5/s0的值明顯高于其他包被緩沖液，因此，選擇磷酸鹽緩沖液作為包被緩沖液。見下表1

表1不同包被緩沖液的s0、s5的發(fā)光值及s5/s0的值

2.2封閉液的選擇

按化學發(fā)光的工作流程，封閉液分別為2.5%bsa和5%bsa,2.5%明膠和5%明膠300ul/孔，其他2條件不變，根據(jù)實驗結(jié)果和s5/s0的值確定最佳稀釋液。結(jié)果以2.5%bsa磷酸鹽緩沖液作為稀釋液時，且s5/s0的值明顯高于其他組，因此，選擇2.5%bsa磷酸鹽緩沖液作為封閉液。見下表2。

表2不同封閉液的s0、s5的發(fā)光值及s5/s0的值

2.3包被抗體濃度的選擇

按化學發(fā)光的工作流程，包被液將單抗分別稀釋為1ug/ml，2ug/ml，4ug/ml，8ug/ml孔，其他條件不變，根據(jù)s5/s0的值確定最佳包被濃度。結(jié)果以4ug/ml作為單克隆抗體包被濃度時，其s0點的發(fā)光值明顯低于其他，且s5/s0的值明顯高于其他組，因此，選擇單克隆抗體包被濃度為4ug/ml。見下表3。

表3不同單克隆抗體包被濃度s0、s5的發(fā)光值及s5/s0的值

2.4酶標抗體工作濃度的選擇

按化學發(fā)光工作流程，將辣根過氧化物酶標的單抗分別以1:2000、1:4000和1:6000倍稀釋，其他條件不變，根據(jù)根據(jù)s5/s0的值確定最佳酶標記單抗的稀釋濃度。結(jié)果以酶標記單克隆抗體的濃度為1:4000時，其s0點的發(fā)光值明顯低于其他，s5/s0的值也較高，因此，選擇酶標記單克隆抗體的濃度為1:4000。見下表4。

表4不同酶標記單克隆抗體的濃度s0、s5的發(fā)光值及s5/s0的值

2.5酶標記單抗最佳工作時間的選擇

按化學發(fā)光的工作流程，根據(jù)上述確定的最佳工作條件，分別反應(yīng)30min、45min和60min，其他條件不變，根據(jù)s5/s0的值確定酶標記單抗的最佳工作時間。結(jié)果以酶標記單克隆抗體的工作時間為45min，且s5/s0的值明顯高于其他組，因此，選擇酶標記單克隆抗體的工作時間45min,見下表5。

表5不同酶標記單克隆抗體的工作時間s0、s5的發(fā)光值及s5/s0的值

2.6化學發(fā)光反應(yīng)體系及條件的確定

經(jīng)過以上一系列條件的優(yōu)化，確立了化學發(fā)光最佳反應(yīng)體系及反應(yīng)條件：采用磷酸鹽緩沖液為稀釋液體，以4ug/mlpedv單克隆抗體濃度包被于固相載體微孔板上100ul/孔，37℃孵育2h或4℃過夜，洗滌3次；封閉：以2.5%bsa作為封閉液體封閉覆蓋微孔板，300ul/孔，4℃過夜,洗板3次;加樣：依次加入樣品，100ul/孔37℃溫育1h,洗板3次；加二抗：hrp酶標記的pedv單克隆抗體（以1:4000稀釋后的液體）100ul/孔，37℃45min，洗板6次；

(5）加檢測底物：加入化學發(fā)光檢測thermoscientificsupersignalelisafemto底物液

（購自thermofisher）100ul/孔，避光反應(yīng)3min；(6)檢測：用發(fā)光檢測儀測定發(fā)光計數(shù)。

3、化學發(fā)光檢測方法特異性、敏感性及重復(fù)性的測定

3.1特異性的測定

根據(jù)建立的化學發(fā)光檢測方法，分別采用豬流行性腹瀉病毒（pedv）、豬瘟病毒(scfv)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(prrsv)、豬偽狂犬病毒(prv)、豬圓環(huán)病毒2型(pcv2)、豬傳染性胃腸病毒(tegv)及豬輪狀病毒(rv)為被檢測樣品，測定方法的特異性。結(jié)果只有pedv檢測到強的化學發(fā)光值421975,為陽性，其他病毒檢測為陰性，說明建立的化學發(fā)光方法具有很好的特異性。見下表6。

表6特異性測定

注：+表示陽性，表示-陰性

3.2敏感性的測定

根據(jù)建立的化學發(fā)光檢測方法，將pedv進行1:10、1:100、1:1000、1:10000依次倍比稀釋，測定檢測方法的敏感性。結(jié)果該方法能檢測到2.6ng的病毒含量，說明方法具有較好的靈敏性。見下表7。

表7敏感性測定

+表示陽性，表示-陰性

3.3重復(fù)性的測定

根據(jù)建立的化學發(fā)光檢測方法，將pedv樣品進行5次重復(fù)，測定檢測方法的重復(fù)性。結(jié)果化學發(fā)光強度基本一致，說明方法具有良好的重復(fù)性，見下表8。

表8重復(fù)性測定

注：+表示陽性，表示-陰性

4、化學發(fā)光方法的臨床初步應(yīng)用

通過檢測56份疑似病料進行檢測，并與常規(guī)rt-pcr檢測技術(shù)進行比較，符合率在95%以上，與熒光定量rt-pcr檢測技術(shù)進行比較，符合率為100%，說明建立的pedv化學方法檢測方法，適合對pedv的快速診斷，能為ped的快速診斷提供了良好的技術(shù)支撐。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。