本發(fā)明屬于分子生物學(xué)檢測領(lǐng)域，特別是涉及一種用于評(píng)估腫瘤免疫治療效果的分子檢測方法及引物組合物及試劑盒。
背景技術(shù)：
：癌癥免疫治療是繼手術(shù)、放射治療、化學(xué)治療之后的又一種對(duì)治療癌癥有明確效果的癌癥治療方法，它是通過激活人體自身免疫系統(tǒng)來抵御、殺死腫瘤細(xì)胞，是未來癌癥治療發(fā)展的方向。不同患者使用不同的免疫療法均會(huì)表現(xiàn)出不同的信息，這就需要對(duì)癌癥免疫治療患者進(jìn)行特異性的免疫系統(tǒng)評(píng)估以監(jiān)控癌癥免疫治療效果。如pd-1抗體是當(dāng)前備受矚目，廣為關(guān)注的一類腫瘤療法，也是腫瘤免疫療法中的主力軍。pd-1免疫療法的作用機(jī)制是針對(duì)pd-1或pd-l1設(shè)計(jì)特定的蛋白質(zhì)抗體，阻止pd-1和pd-l1的識(shí)別過程，部分恢復(fù)具有抗原特異性的細(xì)胞毒性t細(xì)胞(cd8+tcell)功能，從而使之可以殺死腫瘤細(xì)胞。流式細(xì)胞儀(fc)做為一項(xiàng)被廣泛應(yīng)用，并能快速地對(duì)均質(zhì)化的細(xì)胞樣品進(jìn)行多參數(shù)檢測的儀器，我們可以通過fc來檢測cd8+t細(xì)胞的pd1表達(dá)量。通過對(duì)比治療前后t細(xì)胞上pd-1的表達(dá)，我們可以判斷pd-1抗體藥是否對(duì)患者起到了效果。t細(xì)胞基因座上大量的v(可變區(qū))、d(多變區(qū))、j(連接區(qū))基因片段在t細(xì)胞受體的形成中會(huì)產(chǎn)生各種多樣性重組。這種v-d-j基因的重組賦予了每一種t細(xì)胞自己獨(dú)特的t細(xì)胞受體(tcr)，從而使得每一個(gè)tcr的序列能有效的成為一個(gè)t細(xì)胞克隆的唯一生物標(biāo)志物。因此對(duì)t細(xì)胞tcr基因的序列組成進(jìn)行測序，可以很好的定位每一種t細(xì)胞。通過tcr測序這種分子檢測方法檢測到cd8+t細(xì)胞的多樣性狀態(tài)和克隆性。低多樣性表示一個(gè)人的t細(xì)胞的免疫多樣性少，這種免疫狀態(tài)通常具有較高感染率和高死亡率，也反映了對(duì)各種疾病的抵御能力和被治愈能力較低，同時(shí)，其t細(xì)胞克隆性增殖也較高。相反，如果t細(xì)胞多樣性越高的話，說明免疫系統(tǒng)越有能力抵御外來疾病，這是因?yàn)楦叩膖細(xì)胞多態(tài)性可以防止“抗原逃逸”。并且通過對(duì)比治療前后的t細(xì)胞多態(tài)性和克隆性，從而判斷病患的免疫系統(tǒng)是否被免疫治療所激活。癌癥免疫治療效果監(jiān)控可為患者提供一個(gè)快速的，非侵入性的免疫系統(tǒng)評(píng)估。并能幫助醫(yī)療工作者和癌癥病人早期預(yù)測癌癥免疫治療的效果，讓病患能在對(duì)抗癌癥的斗爭中更有效的選擇治療手段，避免了浪費(fèi)癌癥病人治療的時(shí)間和金錢。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了解決以上技術(shù)問題，用于評(píng)估腫瘤免疫治療效果的分子檢測方法，通過對(duì)有活性的cd8+t細(xì)胞的pd-1分子進(jìn)行檢測以及高通量測序構(gòu)建t細(xì)胞的tcr文庫，以及構(gòu)建的cdna接頭和單對(duì)引物，以及文庫制備方法，通過從接頭的上游引物到c區(qū)的下游引物，獲得tcr的多態(tài)性和克隆性。解決以上技術(shù)問題的本發(fā)明中的一種用于評(píng)估腫瘤免疫治療效果的分子檢測方法，其特征在于：包括如下步驟：(一)獲取人血液樣本10ml于edta抗凝管；(二)利用淋巴細(xì)胞分離液ficoll-1077(美國sigma公司#10771)進(jìn)行外周血單核細(xì)胞(pbmc)的分離；淋巴細(xì)胞分離液的作用在于可以從全血里分離淋巴細(xì)胞，因?yàn)閠細(xì)胞為我們檢測對(duì)象，t細(xì)胞屬于淋巴細(xì)胞的一種，分離后的細(xì)胞群所獲得的rna是除去了紅細(xì)胞、血小板等細(xì)胞的rna的。所以建庫使用的總rna內(nèi)含t細(xì)胞rna模板純度更高。(三)利用流式細(xì)胞儀檢測cd8+t細(xì)胞pd-1分子的表達(dá)量；所用的抗體為：anti-cd3、anti-cd8、anti-pd1和anti-4-1bb(美國biolegend公司，anti-cd8fitc，#300906；anti-cd3apc，#300312；pd-1，#329906；4-1bb，#309820.)冰上操作步驟：用80μl的stainingbuffer將細(xì)胞沉淀重懸(106細(xì)胞)。同時(shí)制備對(duì)照管(5個(gè)1.5ml管)：1)在一空白管中加入95μlstainingbuffer(pbs+5％fbs美國gibco#26140079)作為不染色的同型對(duì)照，其余的對(duì)照管中分別加入90μlstainingbuffer作為單染對(duì)照，每管中加入5μl細(xì)胞懸液。2)在單染對(duì)照管中分別加入5ul的anti-cd3、anti-cd8、anti-pd1和anti-4-1bb抗體(美國biolegend公司，anti-cd8fitc，#300906；anti-cd3apc，#300312；pd-1，#329906；4-1bb，#309820.)。如下表1：表1樣品染色：準(zhǔn)備抗體混合液(單個(gè)樣品中anti-cd3、anti-cd8、anti-pd1和anti-4-1bb各5μl)，并在樣品中加入抗體混合液(20μl)并溫和混勻。如下表2：表2sample1sample2sample3sample4細(xì)胞懸液(μl)80808080cd3+cd8+pd1+4-1bb(μl)20202020總體積(μl)100100100100避光冰浴25min。用200μlstainingbuffer清洗，1500rpm離心10min。棄上清，加入200μlstainingbuffer重新清洗一遍。用300μlstainingbuffer重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至facs管。放置冰上并避光，送樣上機(jī)進(jìn)行facs檢測cd3+cd8+4-1bb+細(xì)胞的pd-1表達(dá)量。(四)利用流式細(xì)胞儀分離cd8+t細(xì)胞；(五)利用trizol的方法提取cd8+t細(xì)胞的總rna，所用試劑為rnazolrt(美國mrc公司#rn190)；trizol的方法具體步驟如下：收獲細(xì)胞，轉(zhuǎn)移入1.5ml離心管中，加入1mltrizol，混勻，室溫靜置5min。加入0.2ml氯仿，振蕩15s，靜置2min。加入0.5ml異丙醇，將管中液體輕輕混勻，室溫靜置10min。4℃離心，12000g×10min，棄上清。加入1ml75％乙醇，輕輕洗滌沉淀。4℃離心，7500g×5min，棄上清。自然風(fēng)干，加入50ul的depch2o溶解，得到淋巴細(xì)胞總rna。(六)rna反轉(zhuǎn)錄成cdna，并同時(shí)在cdna5’端添加接頭,用于后面pcr擴(kuò)增時(shí)5’端引物結(jié)合；在反轉(zhuǎn)錄時(shí)，同時(shí)添加接頭，可以最小化rna在多步反應(yīng)過程中的丟失。rna在操作中穩(wěn)定性極差，非常容易降解，少量的步驟可以最大程度上減少降解，同時(shí)也節(jié)約了可用于擴(kuò)增的cdna制備時(shí)間。接頭就是cdna5‘端的核酸接頭，即下面提到的“tcr5’oligo接頭”。(七)pcr1:通過單對(duì)引物的方式擴(kuò)增重組tcrcdna；(八)pcr2和純化：為pcr1產(chǎn)物(擴(kuò)增后的tcr序列)添加illumina高通量測序儀的上機(jī)接頭和標(biāo)簽，同時(shí)為增加更多的上機(jī)基因量再次擴(kuò)增；pcr反應(yīng)結(jié)束后，利用磁珠進(jìn)行dna純化。pcr產(chǎn)物一般都含有過量的引物、taqdna酶及dntp。這些成分的存在將直接影響到后續(xù)的文庫質(zhì)檢、測序反應(yīng)等過程，純化可以去除這些影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)的副產(chǎn)物。同時(shí)，純化的過程也是一個(gè)片段大小篩選的過程，本發(fā)明中的dna片段是在700bp左右，可利用不同體積的磁珠與pcr產(chǎn)物混合，磁珠/dna不同的體積比例可以吸附不同大小的片段，利用上述磁珠體積，可以成功去掉pcr擴(kuò)增時(shí)的錯(cuò)誤(誤差)片段和引物雙聚體，讓我們的測序上機(jī)文庫只有我們的測序目標(biāo)dna片段，使得測序結(jié)果更加準(zhǔn)確，減少誤差。如圖3所示，通過文庫質(zhì)檢只發(fā)現(xiàn)了一個(gè)片段的峰。(九)進(jìn)行高通量測序：將所得的cdna文庫通過illuminamiseq平臺(tái)進(jìn)行測序，測序模式為pe300，并通過生物信息學(xué)分析高通量測序結(jié)果；選擇測序模式pe300，文庫變性濃度為2nm，上機(jī)濃度為20pm。對(duì)比病人治療前后超過10％的克隆群的克隆性變化。查看在免疫治療后，是否相同的t細(xì)胞克隆群是否有更多的克隆性增殖。如果有，說明免疫治療對(duì)其免疫系統(tǒng)是起到了一定作用的。所述步驟(六)中，具體步驟如下：按照以下比例混合每一個(gè)rna樣本：試劑體積1x(μl)，rna8，tcr3’oligo(dt)引物(10μm)1，孵化于72℃3分鐘，接著4℃1分鐘；制備pcr反應(yīng)緩沖液。所述混合pcr反應(yīng)緩存液與rna樣本，按照下面反應(yīng)程序開始cdna反轉(zhuǎn)錄：42℃60分鐘；70℃10分鐘；4℃永久。所述pcr反應(yīng)緩沖液：所述步驟(七)中，按照以下比例制備反應(yīng)體系：pcr1反應(yīng)程序?yàn)?95℃3分鐘；95℃30秒；65℃1分鐘，25循環(huán)；72℃1分鐘；4℃永久。所述步驟(八)中，按照以下比例制備反應(yīng)體系：pcr2反應(yīng)程序?yàn)?94℃3分鐘；94℃30秒；55℃30秒，15循環(huán)；72℃20分鐘，72℃1分鐘，4℃永久。所述步驟(八)中，具體純化步驟如下：(一)添加80μlampurexpbeads進(jìn)入pcr2反應(yīng)產(chǎn)物，混勻；(二)在室溫孵化10分鐘；(三)放置磁珠-pcr2產(chǎn)物混合物試管于磁力架上，等待所有磁珠吸附于磁力架上后，用移液器吸去所有上清液，丟棄；(四)添加150μl70％乙醇于磁珠上，孵化30秒，用移液器吸去所有上清液，丟棄；(五)重復(fù)第四步2次；(六)打開試管蓋，等待5分鐘，待磁珠風(fēng)干，沒有任何乙醇?xì)埩粲谠嚬軆?nèi)；(七)把試管從磁力架上取下，并添加50μl去核酸酶水，利用移液器吹打懸浮磁珠；(八)把試管放回磁力架，等待所有磁珠都吸附于磁力架后，轉(zhuǎn)移上清液于新的試管中，上清液里就包含了純化之后的pcr2產(chǎn)物。本發(fā)明中一種用于評(píng)估腫瘤免疫治療效果的分子檢測引物組合物，其特征在于：所述引物組合物包括tcr3’oligo(dt)引物，tcr5’oligo接頭，tcrc區(qū)引物和標(biāo)簽上下游引物；其中每一種引物的序列如下：tcr3’oligo(dt)引物：5’ttttttttttttttttttttga3’；tcr5’oligo接頭：5’atgcatcggatcttcagcatgaacttrgrgrg3’；tcr5’端接頭引物：5’gtctcgtgggctgggcgatgtgtatgagagacagcatgcatcggatcttcagcatga3’；tcrc區(qū)引物：5’tcgtcgccagcgtcggaagtgtataagagacagtcgcagcgtcagatgtgtataagagacag3’；標(biāo)簽上游引物：5’caagcagaagacggcatacgagat[index1]gtctcgtgggctgg3’；標(biāo)簽下游引物：5’aatgatacggcgaccaccgagatctacac[index2]tcgtcgccagcgtc3’。其中，所述index1為atctatcg、tcaggtga、cactagtt、gaattgcc、atgtacaa、gattcagt、ctgttcgt或tatacggc中的一種；index2為tagctact、attatagc、cccgtact、gggtataa、agcaggtg、tatacgta、cacctagt或gttgctac中的一種。本發(fā)明中一種用于評(píng)估腫瘤免疫治療效果的分子檢測試劑盒，其特征在于：所述試劑盒含有如權(quán)利要求1或2所述的引物組合。所述試劑盒還包括pcr緩沖液、q5high-fidelity2xmastermix、去核酸酶水、ampurexpbeads和70％乙醇。本發(fā)明中的引物組合能有效的擴(kuò)增tcr基因的全序列。使tcr二代測序文庫構(gòu)建效率高效，試劑盒為用戶提供了簡單便捷的使用方法，效率穩(wěn)定。本發(fā)明基于流式細(xì)胞儀技術(shù)和高通量測序技術(shù)，tcr測序單對(duì)引物的文庫構(gòu)建方法，通過在獲得cd8+t細(xì)胞rna后，在進(jìn)行rna至cdna反轉(zhuǎn)錄的同時(shí)，給cdna的5’端添加一個(gè)接頭，從而通過這個(gè)已知序列的接頭設(shè)計(jì)tcr擴(kuò)增上游引物，再配合tcr基因3’端c區(qū)基因(不變區(qū))設(shè)計(jì)下游引物，從而達(dá)到擴(kuò)增整個(gè)tcr序列全長基因的目的。本發(fā)明中通過檢測出來cd8+t細(xì)胞的pd-1分子表達(dá)量和cd8+t細(xì)胞的多態(tài)性、克隆性來判斷腫瘤病人免疫治療的效果。目前并未有其他方法可以評(píng)價(jià)腫瘤免疫治療的有效性。本發(fā)明提供了一種如第一方面所述的基于高通量測序構(gòu)建tcr文庫的cdna接頭和單對(duì)pcr引物或第二方面所述基于高通量測序構(gòu)建tcr文庫的構(gòu)建方法在檢測cd8+t細(xì)胞的多態(tài)性和克隆性中的應(yīng)用。本發(fā)明提供基于高通量測序構(gòu)建tcr文庫的接頭，引物及方法的有益效果為：1.獲得了人tcr全轉(zhuǎn)錄組序列；2.獲得了人特異性cdr1、cdr2和cdr3序列；3.獲得了人t細(xì)胞的多態(tài)性和克隆性，以便作為評(píng)價(jià)腫瘤免疫治療的效果的依據(jù)。本發(fā)明在高通量測序平臺(tái)的基礎(chǔ)上，通過對(duì)人tcr基因測序結(jié)果進(jìn)行全面的生物信息學(xué)分析，獲得了tcr在vdj重組時(shí)的基因偏好性，vdj基因組合信息，tcr克隆種類信息，tcr多樣性信息，cdr1、cdr2、cdr3的核酸序列和氨基酸序列信息，基因上的突變信息，等。正是這些因素形成數(shù)量龐大且種類多樣的tcr組庫。提供詳細(xì)的測序后生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析，并且對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)提供有效的質(zhì)量監(jiān)控，能最大程度減少實(shí)驗(yàn)誤差及錯(cuò)誤。通過對(duì)tcr的測序評(píng)估可以快速的，非侵入性的幫助醫(yī)療工作者和癌癥病人早期預(yù)測癌癥免疫治療的效果，讓病患能在對(duì)抗癌癥的斗爭中更有效的選擇治療手段，避免了浪費(fèi)癌癥病人治療的時(shí)間和金錢。通過簡單的采集血液樣本，利用流式細(xì)胞儀對(duì)受試者的cd8+t細(xì)胞表面蛋白(pd-1)進(jìn)行分子分析以及t細(xì)胞受體基因進(jìn)行二代測序和生物信息學(xué)臨床分析后，獲得的pd-1表達(dá)量、cd8+t細(xì)胞的多態(tài)性和克隆性，從而給出一個(gè)目前的免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤免疫治療的應(yīng)激情況，評(píng)價(jià)免疫治療的效果。附圖說明圖1本發(fā)明中rna反轉(zhuǎn)錄cdna示意圖圖2為本發(fā)明中利用兩次pcr擴(kuò)增tcrcdna并添加測序上機(jī)接頭示意圖圖3為本發(fā)明中測序文庫質(zhì)檢結(jié)果。圖4為本發(fā)明中tcr測序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析比對(duì)，找出每條序列的信息(部分)圖5為本發(fā)明中tcr測序結(jié)果3d森林圖。展示受試者tcr的多樣性和克隆性情況，每一條柱代表一種tcr克隆，克隆性增值的tcr表示了白血病癌細(xì)胞的增值情況，增值的這一條tcr序列就可作為免疫治療效果的生物標(biāo)志物，在治療后對(duì)比統(tǒng)一克隆，看是否有更多的克隆性增值。圖6為本發(fā)明中，對(duì)比腫瘤病人pd-1抗體藥免疫治療前后t細(xì)胞pd-1的變化。圖7為本發(fā)明中，對(duì)比腫瘤病人pd-1抗體藥免疫治療前后t細(xì)胞克隆性的變化。(x軸：v基因；y軸：j基因；z軸：tcr克隆數(shù))具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，以下引物由美國invitrogen公司合成:實(shí)施例1運(yùn)用本發(fā)明中的引物組合物和試劑盒，從而基于高通量測序用于評(píng)估腫瘤免疫治療效果的分子檢測，包括如下步驟：(一)獲取人血液樣本10ml于edta抗凝管；(二)利用淋巴細(xì)胞分離液ficoll-1077(美國sigma公司#10771)進(jìn)行外周血單核細(xì)胞(pbmc)的分離；(三)利用流式細(xì)胞儀分離cd8+t細(xì)胞；所用的抗體為：anti-cd3、anti-cd8和anti-4-1bb(美國biolegend公司，anti-cd8fitc，#300906；anti-cd3apc，#300312；pd-1，#329906；4-1bb，#309820.)(四)利用trizol的方法提取cd8+t細(xì)胞的總rna，所用試劑為rnazolrt(美國mrc公司#rn190)；(五)rna反轉(zhuǎn)錄成cdna，并在cdna5’端添加接頭用于后面pcr擴(kuò)增時(shí)5’端引物結(jié)合，具體步驟如下，所使用到的試劑：tcr3’oligo(dt)引物(10μm)5x反轉(zhuǎn)錄緩沖液(250mmtris-hcl(ph8.3),375mmkcl,15mmmgcl2)二硫蘇糖醇，dtt(20mm)美國thermoscientific#r0861dntpmix(10mm)美國invitrogen#18427088rnaseout(40u/μl)美國invitrogen#10777019tcr5’oligo接頭(10μm)superscriptiirt(200u/μl)美國invitrogen#18064022按照以下比例混合每一個(gè)rna樣本：試劑體積1x(μl)rna8tcr3’oligo(dt)引物(10μm)1孵化于72℃3分鐘，接著4℃1分鐘。按照以下比例制備pcr反應(yīng)緩沖液試劑體積1x(μl)5x反轉(zhuǎn)錄緩沖液3.5dtt(20mm)1dntp(10mm)1rnaseout1tcr5’oligo接頭(10μm)1superscriptiirt1混合pcr反應(yīng)緩存液與rna樣本，按照下面反應(yīng)程序開始cdna反轉(zhuǎn)錄42℃60分鐘70℃10分鐘4℃永久反應(yīng)結(jié)束后，就可獲得已在5’端添加了接頭的總cdna(如圖)(六)pcr1。通過“單對(duì)”引物的方式擴(kuò)增重組tcrcdna，具體步驟如下：所使用到的試劑：q5high-fidelity2xmastermix(美國neb#m0492l)tcr5’端接頭引物(上游引物)tcrc區(qū)引物(下游引物)去核酸酶水(美國thermoscientificam9914g)按照以下比例制備反應(yīng)體系：pcr1反應(yīng)程序?yàn)?(七)pcr2(標(biāo)簽pcr)。為pcr1產(chǎn)物(擴(kuò)增后的tcr序列)添加illumina高通量測序儀的上機(jī)接頭和標(biāo)簽，同時(shí)為增加更多的上機(jī)基因量再次擴(kuò)增。具體步驟如下：所使用到的試劑：q5high-fidelity2xmastermix(美國neb#m0492l)標(biāo)簽上游引物標(biāo)簽下游引物去核酸酶水(美國thermoscientificam9914g)按照以下比例制備反應(yīng)體系：pcr2反應(yīng)程序?yàn)?(八)pcr2產(chǎn)物純化。上述pcr反應(yīng)結(jié)束后，利用磁珠進(jìn)行dna純化，具體步驟如下：所使用到的試劑：agencourtampurexpbeads(美國beckman#a63882)具體純化步驟如下：1.添加80μlampurexpbeads進(jìn)入pcr2反應(yīng)產(chǎn)物，混勻。2.在室溫孵化10分鐘。3.放置磁珠-pcr2產(chǎn)物混合物試管于磁力架上，等待所有磁珠吸附于磁力架上后，用移液器吸去所有上清液，丟棄。4.添加150μl70％乙醇于磁珠上，孵化30秒，用移液器吸去所有上清液，丟棄。5.重復(fù)第四步2次。6.打開試管蓋，等待5分鐘，待磁珠風(fēng)干，沒有任何乙醇?xì)埩粲谠嚬軆?nèi)。7.把試管從磁力架上取下，并添加50μl去核酸酶水，利用移液器吹打懸浮磁珠。8.把試管放回磁力架，等待所有磁珠都吸附于磁力架后，轉(zhuǎn)移上清液于新的試管中。上清液里就包含了純化之后的pcr2產(chǎn)物。(九)進(jìn)行高通量測序。將所得的cdna文庫通過illumina平臺(tái)(美國illumina公司)進(jìn)行測序，測序模式為pe300，并通過生物信息學(xué)分析高通量測序結(jié)果。材料及試劑說明肺鱗癌癥患者：來源河南省人民醫(yī)院；腫瘤免疫治療藥：美國默沙東pd-1抑制劑keytruda；患者知情同意。非特殊說明，本發(fā)明采用的試劑均為市售商品，本發(fā)明實(shí)施例采用的數(shù)據(jù)庫均為公開的在線數(shù)據(jù)庫。具體地，本發(fā)明反轉(zhuǎn)錄5’端接頭序列、引物序列如下(5’-3’)：反轉(zhuǎn)錄步驟tcr3’oligo(dt)引物：5’ttttttttttttttttttttga3’tcr5’oligo接頭：5’atgcatcggatcttcagcatgaacttrgrgrg3’pcr1步驟tcr5’端接頭引物：5’gtctcgtgggctgggcgatgtgtatgagagacagcatgcatcggatcttcagcatga3’tcrc區(qū)引物：5’tcgtcgccagcgtcggaagtgtataagagacagtcgcagcgtcagatgtgtataagagacag3’pcr2步驟標(biāo)簽上游引物：5’caagcagaagacggcatacgagat[index1]gtctcgtgggctgg3’標(biāo)簽下游引物：5’aatgatacggcgaccaccgagatctacac[index2]tcgtcgccagcgtc3’rg＝rna核苷酸標(biāo)簽引物中下劃線部分為illumina測序標(biāo)簽序列，內(nèi)序列可更換為下表序列，用于同時(shí)檢測多個(gè)樣本時(shí)，利用不同的index1/index2組合和生物信息學(xué)算法區(qū)分各個(gè)樣本測序結(jié)果。引物設(shè)計(jì)：針對(duì)rna反轉(zhuǎn)錄時(shí)在tcr5’端添加的接頭序列和tcrc區(qū)基因進(jìn)行分析，采用oligo7.36和primerpremier6.0對(duì)引物二聚體以及莖環(huán)錯(cuò)配進(jìn)行分析，在tcr5’端人工接頭設(shè)置了上游引物，針對(duì)c基因下游設(shè)計(jì)反向引物，擴(kuò)增tcr全長轉(zhuǎn)錄子區(qū)域序列，其中包含了tcr的fr1,cdr1,fr2,cdr2,fr3,cdr3,fr4區(qū)域。實(shí)施例2本發(fā)明實(shí)施例1提供了一種t淋巴細(xì)胞受體(tcr)rna樣品的制備方法，包括如下步驟：收集新鮮的外周血樣本10毫升(ml)，按照ficoll-1077(美國sigma公司#10771)的說明書操作，獲得相對(duì)較純的外周血單核細(xì)胞(pbmc)；采用trizol的方法提取cd8+t細(xì)胞的總rna，所用試劑為rnazolrt(美國mrc公司#rn190)，所獲得的總rna，利用2.0fluorometer(美國thermofisherscientific公司#q32866)，配合rnahsassaykit試劑盒(美國thermofisherscientific公司#q32852)測定rna濃度，然后反轉(zhuǎn)錄rna；實(shí)施例3本發(fā)明實(shí)施例2提供了一種用于評(píng)估腫瘤免疫治療效果的分子檢測方法，包括如下步驟：利用流式細(xì)胞儀檢測cd8+t細(xì)胞pd-1分子的表達(dá)量；所用的抗體為：anti-cd3、anti-cd8、anti-pd1和anti-4-1bb(美國biolegend公司，anti-cd8fitc，#300906；anti-cd3apc，#300312；pd-1，#329906；4-1bb，#309820.)具體步驟如下：冰上操作：用80μl的stainingbuffer將細(xì)胞沉淀重懸(106細(xì)胞)。同時(shí)制備對(duì)照管(5個(gè)1.5ml管)：1)在一空白管中加入95μlstainingbuffer作為不染色的同型對(duì)照，其余的對(duì)照管中分別加入90μlstainingbuffer作為單染對(duì)照，每管中加入5μl細(xì)胞懸液。2)在單染對(duì)照管中分別加入5ul的anti-cd3、anti-cd8、anti-pd1和anti-4-1bb抗體。如下表3：表3樣品染色：準(zhǔn)備抗體混合液(單個(gè)樣品中anti-cd3、anti-cd8、anti-pd1和anti-4-1bb各5μl)，并在樣品中加入抗體混合液(20μl)并溫和混勻。如下表4：表4sample1sample2sample3sample4細(xì)胞懸液(μl)80808080cd3+cd8+pd1+4-1bb(μl)20202020總體積(μl)100100100100避光冰浴25min。用200μlstainingbuffer清洗，1500rpm離心10min。棄上清，加入200μlstainingbuffer重新清洗一遍。用300μlstainingbuffer重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至facs管。放置冰上并避光，送樣上機(jī)進(jìn)行facs檢測cd3+cd8+4-1bb+細(xì)胞的pd1表達(dá)量。對(duì)比治療前后cd3+cd8+4-1bb+細(xì)胞的pd1表達(dá)量的變化，如圖6所示：治療后，外周血cd3+t細(xì)胞數(shù)量相對(duì)治療前增加了5倍。cd8+t細(xì)胞(毒性t細(xì)胞)占總t細(xì)胞的百分比也有所增加，且占總淋巴細(xì)胞的百分比由治療前的3.26％增加到了18.11％。表達(dá)pd1的毒性t細(xì)胞，也從治療前的99.9％降低為43.3％。說明pd-1抗體藥免疫治療方法對(duì)t細(xì)胞的凋亡抑制起到了一定的作用。以實(shí)施例1所得的rna為反轉(zhuǎn)錄模板，按照上述“第二方面”中第六部分中的試劑和步驟獲得加上了tcr5’端接頭的cdna。再按照上述“第二方面”中第七、八部分中的試劑和步驟進(jìn)行pcr1、pcr2(標(biāo)簽pcr)和pcr2的產(chǎn)物(文庫)純化。文庫純化結(jié)束后，利用agilent2100bioanalyzer(美國agilent公司#g2939aa)檢測文庫的純度和大小，使用的試劑盒是agilentdna1000kit(美國agilent公司#5067-1504)，檢測結(jié)果如圖3所示，文庫大小在738bp左右，并且文庫純度相當(dāng)高，并未見到其他非特異性擴(kuò)增序列。利用2.0fluorometer(美國thermofisherscientific公司#q32866)，配合dsdnahsassaykit試劑盒(美國thermofisherscientific公司#q32851)測定dna文庫濃度，并送公司進(jìn)行高通量測序(采用illuminamiseq，2*300pair-end)。采用本發(fā)明的tcr5’端接頭、引物以及文庫構(gòu)建后，高通量測序得到大約幾百萬條tcr序列。測序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析(生物信息分析采用bowtie2aligner(ver.2.1.0)，tcr數(shù)據(jù)庫匹配來源于國際免疫基因信息系統(tǒng)www.imgt.org)，部分分析比對(duì)結(jié)果如下圖4、5所示。通過生物信息學(xué)分析，可以準(zhǔn)確的知道每條tcr序列的信息，氨基酸信息，條數(shù)以及所占比例。經(jīng)過tcr對(duì)比分析，本發(fā)明獲得了高通量測序序列tcr代表性克隆的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果，結(jié)果如圖4和5所示，圖5為tcr的重組基因v-j組合使用情況、t細(xì)胞多態(tài)性和克隆性可視化圖。由圖7可知，通過本發(fā)明的tcr5’端接頭、pcr引物以及測序文庫制備方法獲得的近百萬條的tcr序列中，可以提示受檢者的cd8+t細(xì)胞在和治療前出現(xiàn)的具有克隆性增值的t細(xì)胞群治療后仍然存在，其中最大的和第二大的克隆性增值t細(xì)胞群分別從治療前的16.02％增長到了28.01％和10.65％增長到了13.74％，提示pd-1抗體藥抑制了能識(shí)別到腫瘤細(xì)胞的cd8+t細(xì)胞的凋亡，為免疫系統(tǒng)能有效的消滅腫瘤細(xì)胞提供了幫助。上述結(jié)果表明，利用本發(fā)明的方法構(gòu)建tcr文庫能夠覆蓋tcr基因的多樣性信息，提高低拷貝數(shù)t細(xì)胞克隆的檢出率，并且利用流式細(xì)胞儀的pd-1表達(dá)量的檢測結(jié)果和t細(xì)胞的克隆性結(jié)果，可以用于評(píng)估腫瘤免疫治療的效果。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。序列表sequencelisting<110>孫濤<120>一種用于評(píng)估腫瘤免疫治療效果的分子檢測方法及引物組合物及試劑盒<160>20<170>patentinversion3.3<210>1<211>32<212>dna<213>人工合成<220><223>tcr5’oligo接頭<400>1atgcatcggatcttcagcatgaacttrgrgrg32<210>2<211>22<212>dna<213>人工合成<220><223>tcr3’oligo(dt)引物<400>2ttttttttttttttttttttga22<210>3<211>57<212>dna<213>人工合成<220><223>tcr5’端接頭<400>3gtctcgtgggctgggcgatgtgtatgagagacagcatgcatcggatcttcagcatga57<210>4<211>62<212>dna<213>人工合成<220><223>tcrc區(qū)引物<400>4tcgtcgccagcgtcggaagtgtataagagacagtcgcagcgtcagatgtgtataagagacag62<210>5<211>46<212>dna<213>人工合成<220><223>標(biāo)簽上游引物<400>5caagcagaagacggcatacgagatatctatcggtctcgtgggctgg46<210>6<211>46<212>dna<213>人工合成<220><223>標(biāo)簽上游引物<400>6caagcagaagacggcatacgagattcaggtgagtctcgtgggctgg46<210>7<211>46<212>dna<213>人工合成<220><223>標(biāo)簽上游引物<400>7caagcagaagacggcatacgagatcactagttgtctcgtgggctgg46<210>8<211>46<212>dna<213>人工合成<220><223>標(biāo)簽上游引物<400>8caagcagaagacggcatacgagatgaattgccgtctcgtgggctgg46<210>9<211>46<212>dna<213>人工合成<220><223>標(biāo)簽上游引物<400>9caagcagaagacggcatacgagatatgtacaagtctcgtgggctgg46<210>10<211>46<212>dna<213>人工合成<220><223>標(biāo)簽上游引物<400>10caagcagaagacggcatacgagatgattcagtgtctcgtgggctgg46<210>11<211>46<212>dna<213>人工合成<220><223>標(biāo)簽上游引物<400>11caagcagaagacggcatacgagatctgttcgtgtctcgtgggctgg46<210>12<211>46<212>dna<213>人工合成<220><223>標(biāo)簽上游引物<400>12caagcagaagacggcatacgagattatacggcgtctcgtgggctgg46<210>13<211>51<212>dna<213>人工合成<220><223>標(biāo)簽下游引物<400>13aatgatacggcgaccaccgagatctacactagctacttcgtcgccagcgtc51<210>14<211>51<212>dna<213>人工合成<220><223>標(biāo)簽下游引物<400>14aatgatacggcgaccaccgagatctacacattatagctcgtcgccagcgtc51<210>15<211>51<212>dna<213>人工合成<220><223>標(biāo)簽下游引物<400>15aatgatacggcgaccaccgagatctacaccccgtacttcgtcgccagcgtc51<210>16<211>51<212>dna<213>人工合成<220><223>標(biāo)簽下游引物<400>16aatgatacggcgaccaccgagatctacacgggtataatcgtcgccagcgtc51<210>17<211>51<212>dna<213>人工合成<220><223>標(biāo)簽下游引物<400>17aatgatacggcgaccaccgagatctacacagcaggtgtcgtcgccagcgtc51<210>18<211>51<212>dna<213>人工合成<220><223>標(biāo)簽下游引物<400>18aatgatacggcgaccaccgagatctacactatacgtatcgtcgccagcgtc51<210>19<211>51<212>dna<213>人工合成<220><223>標(biāo)簽下游引物<400>19aatgatacggcgaccaccgagatctacaccacctagttcgtcgccagcgtc51<210>20<211>51<212>dna<213>人工合成<220><223>標(biāo)簽下游引物<400>20aatgatacggcgaccaccgagatctacacgttgctactcgtcgccagcgtc51當(dāng)前第1頁12