本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域,具體而言,涉及一種用于檢測(cè)藥物性耳聾相關(guān)位點(diǎn)的非標(biāo)記探針。

背景技術(shù)：

耳聾是導(dǎo)致語(yǔ)言交流障礙的最常見的疾病之一，嚴(yán)重影響了患者的日常交流，降低患者的生活質(zhì)量。據(jù)世界衛(wèi)生組織（who）估計(jì)，全球有2.78億人患有中度以上的聽力障礙，且三分之二在發(fā)展中國(guó)家^[1]。耳聾可以由單一基因突變或多基因復(fù)合突變引起，也可由環(huán)境因素造成，或基因與環(huán)境共同作用而導(dǎo)致^[2]。由于部分人對(duì)耳毒性藥物如氨基糖苷類藥物有易感性，使用正常劑量或者微量的藥物就可造成聽力損傷^[3]。氨基糖甙類抗生素會(huì)在耳蝸毛細(xì)胞中的線粒體和溶酶體積聚，且代謝緩慢，從而對(duì)聽力產(chǎn)生傷害^[4]。線粒體12srrna基因突變和大多數(shù)的耳聾有關(guān)。1993年，prezant等人通過對(duì)患病家族線粒體基因序列分析,首次報(bào)道了線粒體12srrna上a1555g突變與藥物性耳聾的關(guān)系^[5]；2004年，zhao等人首次在一個(gè)漢族家系中發(fā)現(xiàn)了c1494t突變與藥物性耳聾的相關(guān)性^[6]。

目前的檢測(cè)方法主要采用測(cè)序法^[7]、pcr-rflp法^[8][9]、基因芯片法^[10]和高分辨率熔解曲線法^[11]。但是這些方法都有一些局限性。其中，測(cè)序法和基因芯片法都需要特定的儀器和試劑盒，價(jià)格昂貴，不利于推廣使用。pcr-rflp法必須先進(jìn)行pcr擴(kuò)增后再對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行開蓋處理，有可能產(chǎn)生污染而出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。高分辨率熔解曲線法野生型和突變型之間tm值之差較小，容易造成誤判。因此，目前迫切需要一種低成本、操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確明顯、易于推廣的技術(shù)，對(duì)藥物性耳聾相關(guān)位點(diǎn)12srrna的c1494t、a1555g突變進(jìn)行檢測(cè)。

[1]brownsd.hardisty-hughesre,mburup.quietasamouse：dissectingthemolecularandgeneticbasisofhearing[j].natrevgenet,2008,9(4):277-90.

[2]劉學(xué)忠,歐陽(yáng)小梅,yand,etal.中國(guó)人群遺傳性耳聾研究進(jìn)展.中華耳科學(xué)雜志,2006,4(2):81-89.

[3]周樂,徐克,唐少華.120例非綜合征性耳聾患者線粒體a1555g和c1494t突變分析[j].中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志,2014,12:100-101+108.

[4]丁大連,richardsalvi.氨基糖苷類抗生素耳毒性研究[j].中華耳科學(xué)雜志,2007(02):125-131.

[5]prezanttr,agapianjv,bohlmanmc,etal.mitochondrialribosomalrnamutationassociatedwithbothantibiotic-inducedandnon-syndromicdeafness.[j].naturegenetics,1993,4(3):289-294.

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[7]林文津,郭舜民,徐榕青,等.熒光定量pcr法檢測(cè)線粒體基因a1555g與c1494t突變[j].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2013,10(28):159-161.

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[9]luispablog,maríaeugeniaf,rosauracarone,etal.carrierfrequencyofthe35delganda1555gdeafnessmutationsintheargentineanpopulation.impactonthenewbornhearingscreening.[j].internationaljournalofpediatricotorhinolaryngology,2007,71(4):639–643.

[10]王國(guó)建,戴樸,韓東一,等.基因芯片技術(shù)在非綜合征性耳聾快速基因診斷中的應(yīng)用研究[j].中華耳科學(xué)雜志,2008(1):61-66.

[11]余劍敏,沈智君,肖薇薇.線粒體基因a1555g和c1494t突變檢測(cè)試劑盒臨床應(yīng)用研究[j].山西醫(yī)藥雜志,2011(12):1189-1190.。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有的相關(guān)位點(diǎn)檢測(cè)方法的缺陷，提供一種針對(duì)氨基糖甙類抗生素誘導(dǎo)的非綜合征型耳聾相關(guān)位點(diǎn)12srrnac1494t、a1555g突變檢測(cè)方法，以實(shí)現(xiàn)對(duì)這兩個(gè)位點(diǎn)簡(jiǎn)便準(zhǔn)確、低成本的檢測(cè)。

本發(fā)明是按如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種藥物性耳聾相關(guān)位點(diǎn)12srrnac1494t、a1555g突變的檢測(cè)方法，包括以下步驟：

a、在12srrna基因1494、1555位點(diǎn)的上下游分別合成一對(duì)引物，1494位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的引物對(duì)（引物1、2）之間的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為113bp，1555位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的引物對(duì)（引物3、4）之間的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為125bp。

b、分別針對(duì)1494和1555兩個(gè)位點(diǎn)設(shè)計(jì)合成一個(gè)非標(biāo)探針（1494位點(diǎn)對(duì)應(yīng)探針1,1555位點(diǎn)對(duì)應(yīng)探針2），其3’末端采用氨基封閉，使用evagreen染料進(jìn)行檢測(cè)；

c、提取待測(cè)標(biāo)本的dna，使用步驟a中1494位點(diǎn)或1555位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的引物、步驟b中1494位點(diǎn)或1555位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的探針，與其他pcr反應(yīng)體系成分混合，配制成單重檢測(cè)體系，加入待測(cè)標(biāo)本的dna，進(jìn)行pcr反應(yīng)，擴(kuò)增靶基因片段；

d、反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行一次高分辨率熔解曲線分析，根據(jù)熔解曲線中熔解峰的位置，對(duì)待測(cè)標(biāo)本dna的基因型進(jìn)行分析。

本發(fā)明方法的pcr反應(yīng)體系與常規(guī)pcr反應(yīng)體系相似，包括聚合酶（taq）、dntps、緩沖體系、引物、探針、飽和熒光染料及模板。每管均為單重反應(yīng)，僅檢測(cè)單個(gè)位點(diǎn)的情況，采用不對(duì)稱擴(kuò)增的方式，便于后續(xù)探針的雜交。

靶序列（seqidno.1）為：

1gagtagagtgcttagttgaacagggccctgaagcgcgtacacaccgcccg

51tcaccctcctcaagtatacttcaaaggacatttaactaaaacccctacgc

101atttatatagaggagacaagtcgtaacatggtaagtgtactggaaagtgc

151acttggacgaaccagagtgtagcttaacacaaagcacccaacttacactt

所述的引物序列為：

引物1（seqidno.2）：5’gagtagagtgcttagttgaacaggg3’；

引物2（seqidno.3）：5’cctctatataaatgcgtaggggtt3’；

引物3（seqidno.4）：5’ggacatttaactaaaacccctacg3’；

引物4（seqidno.5）：5’aagtgtaagttgggtgctttgtg3’；

所述的非標(biāo)記探針序列為：

探針1（seqidno.6）：5’cttgaggagagtgacgggcg3’；

探針2（seqidno.7）：5’cgacttgcctcctctatataaa3’；

本發(fā)明方法中的陰性對(duì)照可以選用雙蒸水。

本發(fā)明方法的pcr反應(yīng)在rochelightcyclernano熒光實(shí)時(shí)pcr儀，本發(fā)明中pcr反應(yīng)采用三步法，pcr擴(kuò)增溫度條件如下：95℃預(yù)變性5min，擴(kuò)增階段共60個(gè)循環(huán)，包括95℃變性15s，58℃退火20s，72℃延伸20s，循環(huán)結(jié)束后，72℃延伸5min。擴(kuò)增結(jié)束后直接進(jìn)行熔解曲線檢測(cè)，樣品先95℃變性60s，再迅速冷卻到45℃并保持60s，然后以0.05℃/s的升溫速率進(jìn)行熔解，檢測(cè)溫度范圍為45～95℃，熔解曲線使用pcr儀器對(duì)應(yīng)軟件進(jìn)行分析，分析時(shí)所選熒光通道為sybrgreeni。

本發(fā)明的基因分型采用高分辨率熔解曲線分析，曲線的熔解峰表示有一半雙鏈解鏈時(shí)的溫度，通常理解為單鏈與探針雜交時(shí)的tm值。其中1494位點(diǎn)野生型熔解峰在63℃，突變型熔解峰在67℃，溫度差為4℃；1555位點(diǎn)野生型熔解峰在53℃，突變型熔解峰在61℃，溫度差為8℃。

本發(fā)明還涉及一種通過高分辨率熔解曲線分析檢測(cè)氨基糖甙類抗生素誘導(dǎo)的非綜合征型耳聾相關(guān)位點(diǎn)12srrnac1494t、a1555g突變基因型的試劑盒，所述的試劑盒包括：

（1）擴(kuò)增c1494t和a1555g突變區(qū)域的兩組引物對(duì)；

所述的兩組引物對(duì)的核酸序列分別為：

擴(kuò)增c1494t引物對(duì)：

引物1（seqidno.2）：5’gagtagagtgcttagttgaacaggg3’；

引物2（seqidno.3）：5’cctctatataaatgcgtaggggtt3’；

擴(kuò)增a1555g引物對(duì)：

引物3（seqidno.4）：5’ggacatttaactaaaacccctacg3’；

引物4（seqidno.5）：5’aagtgtaagttgggtgctttgtg3’；

（2）兩條分別特異性結(jié)合由兩組引物對(duì)擴(kuò)增的片段的非標(biāo)記探針；

所述的非標(biāo)記探針的序列為：

探針1（seqidno.6）：5’cttgaggagagtgacgggcg3’；

探針2（seqidno.7）：5’cgacttgcctcctctatataaa3’。

（3）必要的核酸擴(kuò)增和雜交試劑。

本發(fā)明還涉及一組用于檢測(cè)氨基糖甙類抗生素誘導(dǎo)的非綜合征型耳聾相關(guān)位點(diǎn)12srrnac1494t、a1555g突變的引物組和非標(biāo)記探針，所述的引物組的核酸序列分別為：

擴(kuò)增c1494t引物對(duì)：

引物1（seqidno.2）：5’gagtagagtgcttagttgaacaggg3’；

引物2（seqidno.3）：5’cctctatataaatgcgtaggggtt3’；

擴(kuò)增a1555g引物對(duì)：

引物3（seqidno.4）：5’ggacatttaactaaaacccctacg3’；

引物4（seqidno.5）：5’aagtgtaagttgggtgctttgtg3’；

所述的非標(biāo)記探針的序列為：

探針1（seqidno.6）：5’cttgaggagagtgacgggcg3’；

探針2（seqidno.7）：5’cgacttgcctcctctatataaa3’。

本發(fā)明還涉及所述的試劑盒或所述的引物組和非標(biāo)記探針在檢測(cè)氨基糖甙類抗生素誘導(dǎo)的非綜合征型耳聾中的應(yīng)用。

本發(fā)明是針對(duì)藥物性耳聾相關(guān)位點(diǎn)12srrnac1494t、a1555g突變的臨床檢測(cè)而設(shè)計(jì)，具有快速準(zhǔn)確、檢測(cè)成本低等特點(diǎn)。突出特點(diǎn)在于利用了非標(biāo)記探針與不同基因型的片段雜交時(shí)有不同的tm值，通過高分辨率熔解曲線分辨tm值來將不同基因型分開。本發(fā)明的有益效果是：可以快速靈敏的擴(kuò)增出12srrna上藥物性耳聾相關(guān)位點(diǎn)1494和1555附近的靶序列，并且通過非標(biāo)記探針結(jié)合高分辨率熔解曲線分析實(shí)現(xiàn)分型，可以據(jù)此判斷患者是否攜帶這兩個(gè)易感突變，從而能夠?qū)Σ∪说挠盟庍M(jìn)行指導(dǎo)。檢測(cè)手段采用熒光實(shí)時(shí)pcr方法，具有很高的靈敏度；體系使用飽和染料，避免了不飽和染料熒光不穩(wěn)定導(dǎo)致的熔解峰位移現(xiàn)象；所采用的非標(biāo)記探針僅需對(duì)探針的3’末端進(jìn)行氨基封閉處理，而無需進(jìn)行熒光基團(tuán)的修飾，不僅減少了合成的時(shí)間，也降低了探針的合成成本；擴(kuò)增反應(yīng)和檢測(cè)全程閉管，避免了開管造成的交叉污染；擴(kuò)增與檢測(cè)均在同一儀器中進(jìn)行，操作簡(jiǎn)便快捷，利于在醫(yī)療機(jī)構(gòu)中推廣使用。

附圖說明

圖1、非標(biāo)記探針結(jié)合高分辨率熔解曲線進(jìn)行分型的原理圖，圖中顯示本發(fā)明中實(shí)際引物、探針在靶序列上的分布情況。

圖2、兩個(gè)位點(diǎn)典型野生型和突變型的分型結(jié)果圖，

2a、探針1與野生型、突變型的tm值，其中，野生型為63℃（藍(lán)色曲線），突變型為68℃（紅色曲線），△tm為5℃；

2b、探針2與野生型、突變型的tm值，其中，野生型為53℃（藍(lán)色曲線），突變型為61℃（紅色曲線），△tm為8℃。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1、藥物性耳聾相關(guān)位點(diǎn)12srrnac1494t、a1555g突變檢測(cè)試劑盒（非標(biāo)記探針法）的組成

（1）靶序列為人12srrna編碼基因上的一段，其中包含了待測(cè)的兩個(gè)位點(diǎn)，兩個(gè)位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物總共覆蓋200bp的一段序列，其中，1494位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的引物對(duì)（引物1、2）之間的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為113bp，1555位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的引物對(duì)（引物3、4）之間的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為125bp。每個(gè)非標(biāo)記探針的雜交區(qū)域位于相對(duì)應(yīng)的引物對(duì)之間，且覆蓋待測(cè)位點(diǎn)。

引物序列為：

引物1（seqidno.2）：5’gagtagagtgcttagttgaacaggg3’；

引物2（seqidno.3）：5’cctctatataaatgcgtaggggtt3’；

引物3（seqidno.4）：5’ggacatttaactaaaacccctacg3’；

引物4（seqidno.5）：5’aagtgtaagttgggtgctttgtg3’；

非標(biāo)記探針序列為

探針1（seqidno.6）：5’cttgaggagagtgacgggcg3’；

探針2（seqidno.7）：5’cgacttgcctcctctatataaa3’；

（2）試劑盒的配制過程如下：

配制pcr反應(yīng)液：

每人份單個(gè)位點(diǎn)反應(yīng)液：

實(shí)施例2、使用藥物性耳聾相關(guān)位點(diǎn)12srrnac1494t、a1555g突變檢測(cè)試劑盒（非標(biāo)記探針法）進(jìn)行雙盲實(shí)驗(yàn)考察

樣品采集

經(jīng)過測(cè)序證實(shí)突變類型的基因組標(biāo)本總計(jì)56份。樣品由中國(guó)優(yōu)生優(yōu)育協(xié)會(huì)遺傳與健康專家指導(dǎo)中心提供，為口腔黏膜樣本，采用qiaampdnaminikit試劑盒，按照說明書進(jìn)行dna的抽提。其中男13例，女43例，年齡2～59歲，包括漢族、蒙古族、維吾爾族等多個(gè)民族，采集了樣本提供者的耳聾程度、氨基糖甙類藥物史等信息。所有標(biāo)本提供者均簽署了知情同意書，操作均符合科研倫理。獲得樣品時(shí)僅有編號(hào)，并未獲得對(duì)應(yīng)的任何信息。獲得樣本后首先測(cè)定濃度進(jìn)行質(zhì)控，其中有4份樣品由于濃度過低無法進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，因而不納入考察，其余均為20ng/μl。

基因分型

按照上文中每人份反應(yīng)液的體積和順序，按照檢測(cè)的人數(shù)配制總管，配制完成后顛倒混勻，分裝至每個(gè)pcr反應(yīng)管中，分別加入待測(cè)模板，蓋好反應(yīng)管后放入rochelightcyclernano熒光實(shí)時(shí)pcr儀，采用以下程序進(jìn)行pcr反應(yīng)：95℃預(yù)變性5min，擴(kuò)增階段共60個(gè)循環(huán)，包括95℃變性15s，58℃退火20s，72℃延伸20s，循環(huán)結(jié)束后，72℃延伸5min。擴(kuò)增結(jié)束后直接進(jìn)行熔解曲線檢測(cè)，樣品先95℃變性60s，再迅速冷卻到45℃并保持60s，然后以0.05℃/s的升溫速率進(jìn)行熔解，檢測(cè)溫度范圍為45～95℃。熔解曲線使用pcr儀器對(duì)應(yīng)軟件進(jìn)行分析，分析時(shí)所選熒光通道為sybrgreeni。

結(jié)果

經(jīng)過篩查，在52份合格的樣品中，在1494位點(diǎn)上2個(gè)樣品檢測(cè)到突變型信號(hào)，其余為野生型；在1555位點(diǎn)上共有9個(gè)樣品檢測(cè)到突變型信號(hào)，其余均為野生型。將結(jié)果反饋至樣品提供方，其經(jīng)過核對(duì)后確認(rèn)，檢測(cè)結(jié)果與先前的測(cè)序的結(jié)論完全符合。

結(jié)論

非標(biāo)記探針法相較傳統(tǒng)的高分辨率熔解曲線法，采用較短的探針序列，從而將一個(gè)位點(diǎn)的兩個(gè)基因型之間tm值差距拉大，能夠更準(zhǔn)確的進(jìn)行分型。而與探針法相比，其無需熒光標(biāo)記的探針，從而降低了探針的合成成本，減少了合成的時(shí)間。同時(shí)，此法仍然使用熒光實(shí)時(shí)pcr儀，而無需特殊儀器，便于其推廣。以上結(jié)果表明，使用藥物性耳聾相關(guān)位點(diǎn)12srrnac1494t、a1555g突變檢測(cè)試劑盒（非標(biāo)記探針法）可以用于臨床檢測(cè)和風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)，具有較高的臨床應(yīng)用前景。

最后需要說明的是，以上實(shí)施例僅用于幫助本領(lǐng)域技術(shù)人員理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，并不用作對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。

sequencelisting

<110>復(fù)旦大學(xué)

<120>一種用于檢測(cè)藥物性耳聾相關(guān)位點(diǎn)的非標(biāo)記探針

<160>7

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>200

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

gagtagagtgcttagttgaacagggccctgaagcgcgtacacaccgcccgtcaccctcct60

caagtatacttcaaaggacatttaactaaaacccctacgcatttatatagaggagacaag120

tcgtaacatggtaagtgtactggaaagtgcacttggacgaaccagagtgtagcttaacac180

aaagcacccaacttacactt200

<210>2

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

gagtagagtgcttagttgaacaggg25

<210>3

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

cctctatataaatgcgtaggggtt24

<210>4

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

ggacatttaactaaaacccctacg24

<210>5

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

aagtgtaagttgggtgctttgtg23

<210>6

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

cttgaggagagtgacgggcg20

<210>7

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

cgacttgcctcctctatataaa22