專利名稱：一種鑒別鴨瘟病毒強毒與疫苗毒的pcr檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及動物醫(yī)學的科研和生產領域，特別涉及基于鴨瘟病毒強毒株與弱毒疫苗株UL2基因差異的PCR檢測方法
背景技術：
由鴨痕病毒(Duckplague virus, DPV)感染所致的鴨痕(Duck plague, DP),又稱鴨病毒性腸炎(Duck viral enteritis, DVE),是鴨、鵝、天鵝等雁形目動物的ー種急性接觸 性傳染病，其致病特征是血管損傷、組織出血、消化道和淋巴器官損傷。該病可導致商品水禽的產蛋量下降和死亡，在世界各養(yǎng)鴨地區(qū)都有分布，其預防和控制已直接關系到水禽養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展。我國鴨瘟的預防主要采用接種弱毒疫苗，而準確的診斷、監(jiān)測是有效預防和控制該病的基礎和前提。目前，報道的DPV的診斷和監(jiān)測方法有多種，如免疫熒光、聚合酶鏈式反應(PCR)及酶聯免疫吸附試驗(ELISA)等，但卻未見任何方法可將生產養(yǎng)殖中的鴨是因感染強毒鴨瘟病毒還是因已注射鴨瘟疫苗而呈現的陽性區(qū)分開。因此若已進行了鴨瘟病毒免疫的某養(yǎng)殖場出現鴨瘟病毒的診斷和監(jiān)測出現陽性時，現在的檢測方法無法判斷該鴨場是因感染強毒鴨瘟病毒還是因已注射鴨瘟疫苗而呈現的陽性。

發(fā)明內容
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種可鑒別鴨瘟病毒強毒與疫苗弱毒的PCR檢測方法。所用鴨瘟病毒模板是各種疑鴨瘟病毒感染的組織病料或已經在鴨胚成纖維細胞DEF上增殖后細胞病變(CPE)達60% 70%的DEF中提取，同時設立未接毒的DEF或其它相應組織材料的陰性對照。所獲得的DNA模板作10倍濃度梯度稀釋以檢測該方法靈敏性，同時對鴨病毒性肝炎病毒(DHV)、傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)、馬立克氏病毒(MDV)、番鴨細小病毒(MDPV)、鴨腫頭敗血癥病毒(DSHSV)、鵝細小病毒(GPV)、禽流感病毒(AIV)、鴨疫里默氏菌(RA)、鴨沙門氏菌(Sal. A)、巴氏桿菌(PM)和鴨大腸桿菌(E. coli)DNA進行PCR擴增以檢測該方法特異性，并設立空白対照。為實現上述目的，本發(fā)明的技術方案為ー種鑒別鴨瘟病毒強毒與疫苗弱毒的PCR檢測方法，具體步驟為a利用Primer Premier5. 0軟件，參考強弱韋株UL2基因序列(GenBank登錄號強毒 JQ647509，EU885419, JQ043216, JQ 248596，JQ 248597，JQ248598 ;弱毒 JQ347517，JQ347518，EF449516，EU082088)設計引物，由寶生物生物技術有限公司合成。上游引物PI : 5 ’ -ACGAGGGAGACCCAAATGAC-3 ’下游引物P2 :5 ’ -TTTATACTGTTCCACAAGGAAGTTG-3 ’b模板DNA的提取(I)材料的預處理感染DPV的單層細胞(如鴨胚原代成纖維細胞或CCL-141等)，當細胞病變(CPE)達60% 70%時，反復凍融3次，8000r/min 30min，取上清液備用。接種DPV的雞胚或鴨胚，胚死亡后按常規(guī)收取尿囊液，6000r/min IOmin,取上清備用。鴨組織樣品，取鴨組織器官樣品(心、肝、脾、肺、腎、腦、十二指腸、空腸或直腸等)約0. lg，加入滅菌純水I. Oml,使用勻衆(zhòng)器研磨，反復凍融3次,6000r/min IOmin,取上清備用。血液樣品取200ul全血與I. Oml滅菌純水混合,反復凍融3次,6000r/min IOmin,取上清備用。(2)DNA 的提?、?890 ill 上清液，加入 IOOiU 10 % SDS，10 yl (10mg/ml)蛋白酶K，混勻；56°C水浴lh，沸水浴lOmin，室溫冷卻加入400^1 Tris飽和酚，混勻，40C 10000r/min 5min 取上清，加入200 U I飽和酚和200 U I氯仿/異戊醇(24/1)，混勻，4°C 10000r/min 5min ;④取上清，加入 400 氯仿 / 異戊醇(24/1)，混勻，4°C IOOOOr/min5min !⑤取上清，加入1/10體積的3mol/L NaAC,2倍體積的冷無水こ醇，混勻，存放于-20°C至少40min ; 4°C 12000r/min 20min，棄上清加入200^1 75%凍こ醇洗滌沉淀，4°C 12000r/min 20min,棄上清，離心真空干燥，加入20 u ITE溶解沉淀，4°C 6000r/min30soc PCR擴增DPV UL2基因，同時設立陰性及空白對照，反應體系如下
權利要求
1. ー種鑒別鴨瘟病毒強毒與疫苗毒的PCR檢測方法，其特征是具體步驟為a設計擴增鴨瘟病毒UL2基因的特異性引物，引物序列為上游引物Pl :5’ -ACGAGGGAGACCCAAATGAC-3’，下游引物 P2 :5’ -TTTATACTGTTCCACAAGGAAGTTG-3’ ；b按常規(guī)方法提取樣品中的核酸； c. PCR檢測，同時設立陰性對照；PCR檢測體系具體為2X傻瓜PCR Mixtrue 12. 5 u L,Pl (20pmol/u L) lul, P2 (20pmol/u L) lul，模板溶液 I u L，最后用超純水補至 25 u L ；PCR檢測體系擴增參數具體為95°C預變性5min，95°C變性lmin，58. 3°C退火lmin，72°C延伸lmin，循環(huán)40次，最后72°C延伸IOmin ； d瓊脂糖凝膠上電泳，紫外燈照射觀察擴增片段的長度，若PCR擴增條帶為1018bp，則待測樣品含有鴨瘟病毒強毒，若PCR擴增條帶為490bp，則待測樣品含有鴨瘟病毒弱毒。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鑒別鴨瘟病毒強毒與疫苗毒的PCR檢測方法。所述方法為根據鴨瘟病毒強毒株與弱毒疫苗株UL2基因差異設計特異性的引物序列，提取待測樣品的DNA為模板，進行PCR反應；對PCR結果進行分析，若PCR擴增條帶為1018bp，則待測樣品含有鴨瘟病毒強毒，若PCR擴增條帶為490bp，則待測樣品含有鴨瘟病毒疫苗弱毒。本發(fā)明提供的針對鴨瘟病毒強毒與疫苗弱毒鑒定的檢測方法，具有簡便、快速、特異、靈敏和經濟的優(yōu)點，結果判斷方法簡便，適合于科研、臨床和基層實驗室使用，具有廣闊的應用前景。
文檔編號C12Q1/68GK102643932SQ201210116719
公開日2012年8月22日 申請日期2012年4月20日 優(yōu)先權日2012年4月20日
發(fā)明者尹雪琴, 汪銘書, 程安春, 陳孝躍 申請人:四川農業(yè)大學