專(zhuān)利名稱(chēng)：：檢測(cè)全血、尿中嗎啡類(lèi)生物堿的lc-ms/ms分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種檢測(cè)全血、尿中嗎啡類(lèi)生物堿的LC-MS/MS分析方法，具體涉及一種檢測(cè)全血、尿中3-β-D葡萄糖醛酸嗎啡、嗎啡、O6-單乙酰嗎啡和可待因的LC-MS/MS分析方法。
背景技術(shù)：
：隨著國(guó)際毒潮持續(xù)泛濫，境外毒品對(duì)我國(guó)的侵襲日益加劇，吸食或注射海洛因的人員也越來(lái)越多，因此對(duì)人體內(nèi)嗎啡類(lèi)生物堿的分析檢測(cè)的要求也越來(lái)越高。按照公安部《對(duì)吸食、注射毒品人員成癮標(biāo)準(zhǔn)界定》的規(guī)定，凡查獲吸食、注射毒品者，應(yīng)進(jìn)行毒癮司法鑒定和吸毒違法行為的認(rèn)定。其中，這兩個(gè)認(rèn)定的首位要素就是需要先對(duì)涉毒人員的血樣或尿液進(jìn)行檢測(cè)。為保證檢測(cè)的客觀性、準(zhǔn)確性和及時(shí)性，必須了解海洛因在人體內(nèi)的代謝過(guò)程。一般來(lái)說(shuō)，海洛因在人體內(nèi)代謝很快，幾乎檢測(cè)不到原體，很快被血脂酶去乙?；蒓6"單乙酰嗎啡，再進(jìn)一步代謝成去甲嗎啡和嗎啡。而嗎啡的主要代謝途徑則是其3位羥基與葡萄糖醛酸結(jié)合，從而使87%的嗎啡在72小時(shí)內(nèi)被代謝掉，而其中的75%則被代謝為3-β-D葡萄糖醛酸嗎啡形式。由于該3-β-D葡萄糖醛酸嗎啡水溶性強(qiáng)、極性大，提取、檢測(cè)都比較困難，因此鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。現(xiàn)有的關(guān)于GC-MS分析生物檢材中嗎啡類(lèi)生物堿的文獻(xiàn)報(bào)道，其檢材都必須要經(jīng)溶劑提取、衍生化等步驟，無(wú)法檢測(cè)生物檢材中嗎啡與葡萄糖醛酸的結(jié)合物-3-β-D葡萄糖醛酸嗎啡，因此不能滿(mǎn)足案件檢驗(yàn)的需要。近年來(lái)，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS/MS)技術(shù)發(fā)展迅速，它集液相色譜高效的在線(xiàn)分離能力與質(zhì)譜的高靈敏度、高選擇性于一體，正成為法醫(yī)毒物分析強(qiáng)有力的工具。與GC/MS相比，應(yīng)用范圍更廣，不受被分析物揮發(fā)性、極性、熱穩(wěn)定性的限制，也無(wú)需衍生化過(guò)程。多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式通過(guò)兩次離子選擇作用，鎖定目標(biāo)物的母離子-子離子對(duì)，大大提高了分析的專(zhuān)一性和靈敏度。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種檢測(cè)全血、尿中嗎啡類(lèi)生物堿的LC-MS/MS分析方法，具體是提供一種檢測(cè)全血、尿中3-β-D葡萄糖醛酸嗎啡、嗎啡、O6-單乙酰嗎啡和可待因的LC-MS/MS分析方法。本發(fā)明的LC-MS/MS分析方法，具體如下1.色譜及質(zhì)譜條件(LC-MS/MS)1)液相色譜(LC-MS)條件色譜柱XterraMSC183.5μm2.1X150mm(Waters公司)流動(dòng)相由A、B組成，其中A為含2mmol/L甲酸銨和0.05%(ν/ν)甲酸的水，B為含2mmol/L甲酸銨和0.05%(ν/ν)甲酸的乙腈，A、B的體積比為9010。柱溫45°C流速0·2mL/min進(jìn)樣量10μL2)質(zhì)譜(MS)條件檢測(cè)方式多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)掃描方式正離子掃描電噴霧電壓3200V霧化氣流速N2600L/hr錐孔反吹氣流速N250L/hr離子源溫度105°C碰撞氣氬氣3)MRM參數(shù)每個(gè)化合物選取兩個(gè)母離子_子離子對(duì)，結(jié)合保留時(shí)間定性，峰度強(qiáng)的子離子定量。2.樣品處理1)血樣全血用純凈水1l(v/v)稀釋后離心上樣(16000rpm，5min)。依次用ImL甲醇，ImL水活化oasisHLB柱(lcc/30mg)，精取全血稀釋液加入內(nèi)標(biāo)lOOng，混勻后上柱，用ImL含5%(ν/ν)甲醇的水淋洗柱子，然后用ImL甲醇洗脫，整個(gè)過(guò)程流速控制在約2mL/min。洗脫液在60°C水浴中空氣流下吹干，殘?jiān)?00μL流動(dòng)相溶解，轉(zhuǎn)移至自動(dòng)進(jìn)樣小瓶中進(jìn)樣，。2)尿樣依次用ImL甲醇，ImL水活化oasisHLB柱(lcc/30mg)，精密吸取1.0尿樣，加入內(nèi)標(biāo)lOOng，混勻后上柱，用ImL含5%(ν/ν)甲醇的水淋洗柱子，然后用ImL甲醇洗脫，整個(gè)過(guò)程流速控制在2mL/min左右。洗脫液在60°C水浴中空氣流下吹干，殘?jiān)肐OOyL流動(dòng)相溶解，轉(zhuǎn)移至自動(dòng)進(jìn)樣小瓶中進(jìn)樣。其中，固定相為C18。3.結(jié)果分析根據(jù)色譜圖和線(xiàn)性方程，計(jì)算各化合物的濃度。相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的LC-MS/MS分析方法，具有如下優(yōu)點(diǎn)1)可以快速的檢測(cè)出生物檢材中嗎啡與葡萄糖醛酸的結(jié)合物-3_β-D葡萄糖醛酸嗎啡。2)采用不同的淋洗和洗脫條件，即用ImL含5%(ν/ν)甲醇的水淋洗，ImL甲醇洗脫，使所得回收率最高。因此，樣品上樣后經(jīng)一步清洗后即用甲醇洗脫，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)步驟，節(jié)約了分析時(shí)間。吸食海洛因者的血樣通常比較粘稠，為了便于過(guò)柱，將全血用純凈水稀釋、離心后上樣。3)采用固相萃取方法進(jìn)行凈化，使定性和定量更準(zhǔn)確。本發(fā)明曾分別采用甲醇、乙腈直接稀釋沉淀蛋白進(jìn)樣，但由于溶劑效應(yīng)，幾個(gè)成分的色譜峰都集中在2min，無(wú)法有效分離；另外采用這種方法，基質(zhì)效應(yīng)影響明顯，每個(gè)實(shí)際樣品中各成分出峰時(shí)間都有所不同。圖1為實(shí)際案件血樣中3-β-D葡萄糖醛酸嗎啡、嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因及內(nèi)標(biāo)的MRM色譜圖。具體實(shí)施方式以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案。3-β-D葡萄糖醛酸嗎啡、內(nèi)標(biāo)嗎啡-d3購(gòu)自于Cerilliant公司，嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因購(gòu)自于中國(guó)藥品生物制品檢定所。乙腈、甲醇、甲酸、甲酸胺均為色譜純，購(gòu)自Merck公司，其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。WatersAlliance2695/QuattroPremierXE串聯(lián)四極桿液-質(zhì)聯(lián)用儀(美國(guó)Waters公司),配MassLynxV4.1軟件。oasisHLB柱購(gòu)自美國(guó)Waters公司。實(shí)施例1血樣中3_β-D葡萄糖醛酸嗎啡、嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因的檢測(cè)1.液相色譜條件色譜柱XterraMSC183.5μm2.1X150mm(Waters公司)流動(dòng)相為A和B，其中A為含2mmol/L甲酸銨和0.05%(ν/ν)甲酸的水，B為含2mmol/L甲酸銨和0.05%(ν/ν)甲酸的乙腈，A、B的體積比為9010。柱溫45°C流速0·2mL/min進(jìn)樣量10μL2.質(zhì)譜條件檢測(cè)方式多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)掃描方式正離子掃描電噴霧電壓3200V霧化氣流速N2600L/hr錐孔反吹氣流速N250L/hr離子源溫度105°C碰撞氣氬氣內(nèi)標(biāo)嗎啡-d33.MRM參數(shù)每個(gè)化合物選取兩個(gè)母離子_子離子對(duì)，結(jié)合保留時(shí)間定性，峰度強(qiáng)的子離子定量，各參數(shù)詳見(jiàn)表1。表1各化合物及內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜MRM參數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>4.樣品處理全血用純凈水1l(v/v)稀釋后離心上樣(16000rpm，5min)。依次用ImL甲醇，ImL水活化oasisHLB柱(lcc/30mg)，精取全血稀釋液加入內(nèi)標(biāo)lOOng，混勻后上柱，用ImL含5%(ν/ν)甲醇的水淋洗柱子，然后用ImL甲醇洗脫，整個(gè)過(guò)程流速控制在約2mL/min。洗脫液在60°C水浴中空氣流下吹干，殘?jiān)?00μL初始流動(dòng)相溶解，轉(zhuǎn)移至自動(dòng)進(jìn)樣小瓶中進(jìn)樣。5.結(jié)果分析1)最低檢測(cè)限以峰度弱的子離子峰強(qiáng)度信噪比S/N>5確定為最低檢測(cè)限(LOD)，各化合物的LOD見(jiàn)表2。表2各化合物的檢測(cè)限和線(xiàn)性關(guān)系<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>2)線(xiàn)性關(guān)系和精密度分別取不同量的對(duì)照品混合液(含3-β-D葡萄糖醛酸嗎啡、嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因)于具塞尖底試管中，吹干后加入空白全血稀釋液1.OmL，配成系列濃度的樣品，按樣品處理方法操作。以峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比(Y)對(duì)樣品中化合物的濃度(X)作圖，得回歸方程和相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表2，可以看出，各化合物的線(xiàn)性關(guān)系良好。高、中、低濃度日內(nèi)重復(fù)測(cè)定6次得日內(nèi)精密度，連續(xù)測(cè)定3天得日間精密度，結(jié)果見(jiàn)表3。表3各化合物的日內(nèi)及日間精密度<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>將上述方法應(yīng)用于一起實(shí)際案件的血樣分析，血樣中檢測(cè)出3-i3_D葡萄糖醛酸嗎啡、嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因成分的含量分別為2.634,0.335,0.055,0.132μg/mL,結(jié)果參見(jiàn)圖1。實(shí)施例2尿樣中3_β-D葡萄糖醛酸嗎啡、嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因的檢測(cè)1.液相色譜條件、質(zhì)譜條件、MRM參數(shù)同實(shí)施例1。2.樣品處理依次用ImL甲醇，ImL水活化oasisHLB柱(lcc/30mg)，精密吸取1.0尿樣，加入內(nèi)標(biāo)lOOng，混勻后上柱，用ImL含5%(ν/ν)甲醇的水淋洗柱子，然后用ImL甲醇洗脫，整個(gè)過(guò)程流速控制在2mL/min左右。洗脫液在60°C水浴中空氣流下吹干，殘?jiān)肐OOyL初始流動(dòng)相溶解，轉(zhuǎn)移至自動(dòng)進(jìn)樣小瓶中進(jìn)樣。3.結(jié)果分析1)色譜行為3-β-D葡萄糖醛酸嗎啡、嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因及內(nèi)標(biāo)在選定的液相色譜分析條件下，保留時(shí)間分別為1.98min、2.25min、3.58min、4.70min和2.26min，在8min內(nèi)完成分析，色譜行為良好。2)最低檢測(cè)限以峰強(qiáng)度較低的子離子峰強(qiáng)度信噪比S/N>5確定為最低檢測(cè)限(LOD)，各化合物的LOD見(jiàn)表4。表4各化合物的檢測(cè)限和線(xiàn)性關(guān)系<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>3)線(xiàn)性關(guān)系和精密度分別取不同量的對(duì)照品混合液(含3-β-D葡萄糖醛酸嗎啡、嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因)于具塞尖底試管中，吹干后加入空白尿樣l.OmL，配成系列濃度的樣品，按樣品處理方法操作。以峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比(Y)對(duì)樣品中化合物的濃度(X)作圖，得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)，見(jiàn)表4，各化合物線(xiàn)性關(guān)系良好。高、中、低濃度日內(nèi)重復(fù)測(cè)定6次得日內(nèi)精密度，連續(xù)測(cè)定3天得日間精密度，見(jiàn)表5。表5各化合物的日內(nèi)及日間精密度<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>將上述方法應(yīng)于一起實(shí)際案件的吸毒尿樣分析中，尿樣中檢出3-i3_D葡萄糖醛酸嗎啡、嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因成分的含量分別為2.603,0.044,0.331,0.531μg/mLo最后應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍中。權(quán)利要求一種檢測(cè)全血、尿中嗎啡類(lèi)生物堿的LC-MS/MS分析方法，其特征在于，所述LC-MS及MS的條件分別如下1)LC-MS色譜條件流動(dòng)相由A、B組成，其中A為含2mmol/L甲酸銨和0.05％(v/v)甲酸的水，B為含2mmol/L甲酸銨和0.05％(v/v)甲酸的乙腈，所述A、B的體積比為90∶10；柱溫45℃；流速0.2mL/min；進(jìn)樣量10μL；2)MS條件檢測(cè)方式多反應(yīng)監(jiān)測(cè)MRM；掃描方式正離子掃描；電噴霧電壓3200V；霧化氣流速N2600L/hr；錐孔反吹氣流速N250L/hr；離子源溫度105℃；碰撞氣氬氣；內(nèi)標(biāo)嗎啡-d3。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的LC-MS/MS分析方法，其特征在于，所述MRM參數(shù)是根據(jù)每個(gè)化合物選取兩個(gè)母離子_子離子對(duì)，結(jié)合保留時(shí)間定性，峰度強(qiáng)的子離子定量。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的LC-MS/MS分析方法，其特征在于，樣品采用以下方式進(jìn)行處理首先固相萃取，依次用甲醇、水活化柱子，精取全血稀釋液或尿樣加入內(nèi)標(biāo)，混勻后上柱，淋洗柱子，洗脫，洗脫液在空氣流下吹干，殘?jiān)昧鲃?dòng)相溶解，然后轉(zhuǎn)移至自動(dòng)進(jìn)樣小瓶中進(jìn)樣。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的LC-MS/MS分析方法，其特征在于，全血用純凈水11(ν/ν)稀釋后離心上樣。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的LC-MS/MS分析方法，其特征在于，固定相為C18。6.根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述的LC-MS/MS分析方法，其特征在于，所述嗎啡類(lèi)生物堿為3-β-D葡萄糖醛酸嗎啡、嗎啡、O6-單乙酰嗎啡和可待因。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)全血、尿中嗎啡類(lèi)生物堿的LC-MS/MS分析方法，所述LC-MS及MS的條件分別如下1)LC-MS色譜條件流動(dòng)相由A、B組成，其中A為含2mmol/L甲酸銨和0.05％(v/v)甲酸的水，B為含2mmol/L甲酸銨和0.05％(v/v)甲酸的乙腈，所述A、B的體積比為90∶10；柱溫45℃；流速0.2mL/min；進(jìn)樣量10μL；2)MS條件檢測(cè)方式多反應(yīng)監(jiān)測(cè)MRM；掃描方式正離子掃描；電噴霧電壓3200V；霧化氣流速N2600L/hr；錐孔反吹氣流速N250L/hr；離子源溫度105℃；碰撞氣氬氣；內(nèi)標(biāo)嗎啡-d3。所述嗎啡類(lèi)生物堿為3-β-D葡萄糖醛酸嗎啡、嗎啡、O6-單乙酰嗎啡和可待因。本發(fā)明采用固相萃取方法對(duì)樣品進(jìn)行凈化，使定性和定量更準(zhǔn)確；采用不同的淋洗和洗脫條件，使所得回收率最高，樣品上樣后經(jīng)一步清洗后即用甲醇洗脫，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)步驟，節(jié)約了分析時(shí)間。文檔編號(hào)G01N30/06GK101813675SQ201010146298公開(kāi)日2010年8月25日申請(qǐng)日期2010年4月13日優(yōu)先權(quán)日2010年4月13日發(fā)明者葉海英,張玉榮,梁晨,汪蓉申請(qǐng)人:上海市公安局刑事偵查總隊(duì)