專利名稱：一種果蔬組織及其相關(guān)制品中還原型抗壞血酸和異抗壞血酸的分離測量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分析領(lǐng)域，涉及一種果蔬組織及其相關(guān)制品中還原型抗壞血酸和異抗壞血酸的分離測量的方法。
背景技術(shù)：
維生素C (以下簡稱Vc)，又叫抗壞血酸，是一種己糖衍生物。維生素C具有很高的醫(yī)用價值，是維持機體正常生命活動所必需的一類小分子有機化合物，可參與體內(nèi)氧化還原反應(yīng)和氧化還原信號傳遞與調(diào)節(jié)，Vc具有解毒作用，人體若嚴(yán)重缺乏會引起壞血病。人體自身不能合成維生素C，必須從食物中攝取。維生素C廣泛存在于新鮮水果、蔬菜中。因此在果蔬Vc代謝、氧化還原信號傳遞等生理過程的研究及種質(zhì)資源研究、品種育種、貯藏加工和果品質(zhì)量監(jiān)測中，經(jīng)常需要測定Vc含量。Vc包括還原型Vc、氧化型Vc和異抗壞血 酸，新鮮果品中以還原型Vc為主?，F(xiàn)有的Vc測定方法主要是全量測定法(測定還原型Vc和氧化型Vc的總含量，如突光法和2，4- 二硝基苯餅法等)和還原型Vc測定法(如2，6- 二氯親酌■滴定法、電位滴定法、碘滴定法、鑰藍比色法、碘酸鉀萃取分光光度法等)兩類。這些方法操作繁雜、容易受到果蔬組織中一價銅離子、亞鐵離子、單寧、半胱氨酸、谷胱甘肽、維生素E、色素等物質(zhì)的影響，分析測量不精確，而且不能很好的區(qū)分還原型抗壞血酸、氧化型抗壞血酸和異抗壞血酸。近幾年發(fā)展起來的用氣相色譜、液相色譜分析鑒定抗壞血酸的方法能夠克服傳統(tǒng)化學(xué)方法的不足，尤其是高效液相色譜被廣泛的應(yīng)有到抗壞血酸的分析測量中，通過對材料的衍生化處理，高效液相色譜能精確的分析鑒定還原型抗壞血酸和氧化型抗壞血酸。盡管這些方法能夠精確的分析鑒定抗壞血酸，但是這些方法都比較費時，抗壞血酸是一種不穩(wěn)定的活潑分子，離體條件下極易被氧化降解，造成分析測量的誤差。一種可靠的抗壞血酸測量方法應(yīng)該能夠準(zhǔn)確的測量植物組織中抗壞血酸的含量，同時要能夠鑒定還原型抗壞血酸、氧化型抗壞血酸和異抗壞血酸。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種果蔬組織及其相關(guān)制品中抗壞血酸和異抗壞血酸的分離測量的方法。本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)一種果蔬組織及其相關(guān)制品中抗壞血酸和異抗壞血酸的分離測量的方法，包括如下步驟(I)備料以新鮮的果蔬組織或其制品為原料，在液氮中研磨成勻漿；(2)提取以料液比1:5-10 (g/ml)的比例加入提取還原液，35_40°C提取60分鐘，得到含有抗壞血酸提取液，提取液經(jīng)過離心機以5000r/min的速度進行固液分離，獲得上清液；殘渣用相同的條件重復(fù)提取一次，合并兩次上清液；
(3)上清液用0. 45微米尼龍膜過濾，過濾液作為色譜分析的待測樣品；(4)取5-lOy L的上述樣品上色譜柱進行分離測量，色譜條件是采用TSKgel-Amide-80色譜柱(4. 6mmX 100mm)，流動相為乙睛(B相)和0. 1%的酸溶液(A相)，梯度洗脫條件0-7min B相A相體積比為90:10，7_8min B相A相體積比為20:80，8-13min B 相:A 相體積比為 20:80，13_14min B 相:A 相體積比為 90:10，14_20min B 相:A相體積比為90:10 ;流速為0. 6-0. 8mL/min，柱溫為25_30°C，檢測波長為244nm ；(5)利用外標(biāo)法根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品還原性抗壞血酸和異抗壞血酸的含量。所述的提取還原液是由4-7% (g/100ml)偏磷酸，2mM磷酸三-(￠-氯乙基)酯(TCEP)和2mM乙二銨四乙酸鈉組成。所述的0. 1% (V/V)的酸溶液所用的酸包括甲酸、乙酸或三氟乙酸。
有益效果本發(fā)明提供一種可靠的抗壞血酸測量方法，能夠有效的分離水果、蔬菜及其相關(guān)制品中還原型抗壞血酸和異抗壞血酸,準(zhǔn)確的測量植物組織中還原型抗壞血酸和異抗壞血酸的含量。傳統(tǒng)的維生素C的測量方法不能將抗壞血酸和異抗壞血酸有效的分開，因此測量結(jié)果受到異抗壞血酸的干擾。本發(fā)明開發(fā)采用的正相親水色譜柱的分離條件，能夠有效的將還原型抗壞血酸和異抗壞血酸分離開來(圖1)，并利用外標(biāo)法對樣品中的含量進行定量分析。該放方法簡便易行，可廣泛的應(yīng)用于水果、蔬菜及其相關(guān)的制品的抗壞血酸分析測試中。


圖I供試樣品的色譜分離圖(峰I為異抗壞血酸，峰2為還原性抗壞血酸)。圖2為還原性抗壞血酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖3為異壞血酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實施例方式下面通過對具體實施例的描述，對本發(fā)明作進一步詳細說明。取帶皮鮮梨4g，在液氮中研磨成勻漿后轉(zhuǎn)移到20mL含有6. 25%偏磷酸、2mM磷酸三-(P -氯乙基)酯和2mM乙二銨四乙酸鈉的提取還原液中，35°C條件下提取60min,經(jīng)過5000r/min轉(zhuǎn)速離心，分離獲得上清液，殘渣用相同的條件重復(fù)提取一次，合并兩次上清液，以0.45微米的尼龍膜過濾上清液。取5 ii L過濾液，上親水相互作用色譜分析。親水相互作用色譜采用TSKgel-Amide-80色譜柱(4. 6mmX 100mm)，流動相為乙睛(B)和0. 1%的三氟乙酸溶液(A)，梯度洗脫條件0-7min(B:A=90:10，V/V), 7-8min (B:A=20:80, V/V)，8-13min(B:A=20:80,V/V)，13_14min (B:A=90:10，V/V)，14_20min (B:A=90:10，V/V);流速為0. 7mL/min，柱溫為30°C，檢測波長為244nm。色譜分離圖如圖I所示，峰I為異抗壞血酸，峰2為抗壞血酸。準(zhǔn)確稱取0. 0020g經(jīng)60°C干燥的還原性抗壞血酸(Sigma Co.)，用上述提取液溶解定容至IOOOml容量瓶中作為標(biāo)準(zhǔn)母液，分別取l、2、3、4、5、6、7、8、9、10ml標(biāo)準(zhǔn)母液放入IOml容量瓶，并用上述提取液定容。將配制好的上述不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液經(jīng)0. 45 y m膜過濾后上親水相互作用色譜分析，并根據(jù)吸收峰面積與濃度關(guān)系制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖2。準(zhǔn)確稱取0. 0020g異抗壞血酸(Sigma Co.)按同樣的方法制備標(biāo)準(zhǔn)曲線,見圖3。根據(jù)所測供試樣品的色譜分離圖(圖1)，及標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2、圖3)，計算供試樣品中還原型抗壞血酸和異抗壞血酸的含量分別為23. 5mg/100gFff,0. 93mg/100gFW。
權(quán)利要求
1.一種果蔬組織及其相關(guān)制品中還原性抗壞血酸和異抗壞血酸的分離測量的方法，其特征在于包括如下步驟 (1)備料以新鮮的果蔬組織或其制品為原料，在液氮中研磨成勻漿； (2)提取以料液比1:5-10的比例加入提取還原液，35-40°C提取60分鐘，得到含有抗壞血酸提取液，提取液經(jīng)過離心機以5000r/min的速度進行固液分離，獲得上清液；殘渣用相同的條件重復(fù)提取一次，合并兩次上清液； (3)上清液用0.45微米尼龍膜過濾，過濾液作為色譜分析的待測樣品； (4)取5-10y L的上述樣品上色譜柱進行分離測量，色譜條件是采用TSKgel-Amide-80色譜柱，流動相為B相乙睛和A相0. 1%的酸溶液，梯度洗脫條件0_7min B相A相體積比為90:10, 7_8min B相A相體積比為20:80,8_13min B相A相體積比為20:80，13-14min B相:A相體積比為90:10，14_20min B相:A相體積比為90:10 ;流速為0. 6-0. 8mL/min，柱溫為25_30°C，檢測波長為244nm ； (5)利用外標(biāo)法根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品還原性抗壞血酸和異抗壞血酸的含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種果蔬組織及其相關(guān)制品中抗壞血酸和異抗壞血酸的分離測量的方法，其特征在于步驟(2)中所述的提取還原液由4-7%偏磷酸，2mM磷酸三-(￠-氯乙基)酯和2mM乙二銨四乙酸鈉組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種果蔬組織及其相關(guān)制品中抗壞血酸和異抗壞血酸的分離測量的方法，其特征在于步驟(4)所述的0. 1%的酸溶液所用的酸為甲酸、乙酸或三氟乙酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種果蔬組織及其相關(guān)制品中還原型抗壞血酸和異抗壞血酸的分離測量的方法。包括以新鮮的果蔬組織或其制品為原料，在液氮中研磨成勻漿,通過提取還原液提取、過濾得到含維生素C的待測樣品，以TSKgel-Amide-80親水柱為色譜，以乙睛和0.1%的酸溶液為流動相，在244nm下對抗壞血酸和異抗壞血酸進行分析。本發(fā)明所述的方法重復(fù)性好，簡便易行，能有效的分離測量抗壞血酸和異抗壞血酸，可廣泛的應(yīng)用于水果、蔬菜及其相關(guān)制品的抗壞血酸分析測試。
文檔編號G01N30/02GK102749394SQ20121018472
公開日2012年10月24日 申請日期2012年6月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月6日
發(fā)明者吳俊 , 張全軍, 張紹鈴, 張虎平, 秦改花, 陶書田, 黃文江, 齊開杰 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)