專(zhuān)利名稱(chēng)：一種能夠大規(guī)模并快速高純度地誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)決定成造血干細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是指一種能夠大規(guī)模并快速高純度地誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)決定成造血干細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
脂肪源性干細(xì)胞(Adipose-derived stem cell, AD-MSCs)的主要來(lái)源白色脂肪(white adipose tissue, WAT)在體內(nèi)分布廣泛,儲(chǔ)量豐富。細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)證明，骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone-marrow mesenchymal stem cell, BMSCs)僅占成人骨髓的
0.2 X IO^5-0.1 X 10_5，而脂肪組織中所獲得的干細(xì)胞克隆形成率是BMSCs的100-500倍。骨髓中BMSCs的比例和增值能力均會(huì)隨著年齡的增長(zhǎng)和骨質(zhì)疏松的發(fā)生率而下降，但脂肪組織中ADSCs數(shù)量不隨供者年齡增加而減少。ADSC體外擴(kuò)增和自我更新能力強(qiáng)，原代培養(yǎng)約5-7天后，細(xì)胞融合超過(guò)90%，一個(gè)月出現(xiàn)3個(gè)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，能較穩(wěn)定傳代20代以上；體外培養(yǎng)時(shí)對(duì)血清無(wú)特殊選擇性，無(wú)需添加物即可良好的生長(zhǎng)，液氮凍存和長(zhǎng)期傳代后的ADSCs細(xì)胞生長(zhǎng)和表型均無(wú)改變。ADSCs具有多向分化能力，在不同誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，ADSCs能夠定向分化成成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、胰腺內(nèi)分泌樣細(xì)胞、肝臟細(xì)胞和視神經(jīng)細(xì)胞等多種組織細(xì)胞。但至今不清楚它們是否能轉(zhuǎn)化為造血干細(xì)胞(HSCs)。造血干細(xì)胞是治療血液病尤其是白血病的最有效方法。白血病和其它腫瘤疾病一樣，近年來(lái)在中國(guó)有著顯著增長(zhǎng)的趨勢(shì)，并呈現(xiàn)低齡化的特點(diǎn)。白血病占惡性腫瘤的5%，發(fā)病以?xún)和颓嗄昃佣?。治療白血病的最有效的方法就是造血干?xì)胞治療。但目如的治療手段是通過(guò)尋找配型的骨髓或 造血干細(xì)胞，患者家屬以及社會(huì)的相關(guān)部門(mén)動(dòng)用一切可調(diào)動(dòng)的資源尋找配型適合的造血干細(xì)胞，能配上的微乎其微。因此催生了國(guó)家干細(xì)胞庫(kù)的設(shè)立，但每個(gè)庫(kù)通常要花費(fèi)2億元左右，其經(jīng)濟(jì)成本之高可想而知，但從技術(shù)上乃不能完全排除免疫排斥和致瘤可能。此外，由于干細(xì)胞的數(shù)量有限，無(wú)分化擴(kuò)增技術(shù)的缺少，使最終優(yōu)質(zhì)的醫(yī)療結(jié)果得不到保證。上述種種原因急需人們?nèi)グl(fā)現(xiàn)新的產(chǎn)生造血干細(xì)胞的來(lái)源和研制新的無(wú)分化擴(kuò)增造血干細(xì)胞的技術(shù)和方法。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)不同類(lèi)型的造血細(xì)胞中小RNA的表達(dá)顯著不同，而且這種不同在細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。例如，miR-181和B-淋巴細(xì)胞的發(fā)育有關(guān)，miR-142和miR-223與T-淋巴細(xì)胞的發(fā)育有關(guān)，miR-221和miR-222與人的紅細(xì)胞生成有關(guān)，miR-223和小鼠的粒細(xì)胞分化相關(guān)，而miR-10，miR-126和miR-17與巨核細(xì)胞減少有關(guān)。除此之外，人們還發(fā)現(xiàn)某些小RNA，如miR-128和miR-181，能起到阻止造血干細(xì)胞分化的作用。盡管已經(jīng)發(fā)現(xiàn)某些miRNA，例如miR-130a和miR-10a，通過(guò)作用H0XA1基因和MAFB基因的轉(zhuǎn)錄因子基因從而誘導(dǎo)細(xì)胞分化
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提出一種能夠大規(guī)模并快速高純度地誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)決定成造血干細(xì)胞的方法，解決了現(xiàn)有技術(shù)造血干細(xì)胞治療中的細(xì)胞配型困難、免疫排斥和造血干細(xì)胞數(shù)量限制的技術(shù)瓶徑的問(wèn)題。本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的:一種能夠大規(guī)模并快速高純度地誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)決定成造血干細(xì)胞的方法，包括下列步驟:1)制備均質(zhì)的間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)基；2)多種小RNA分子的組合；3)核酸多肽納米粒的組裝和轉(zhuǎn)染；4)轉(zhuǎn)決定后的造血干細(xì)胞誘導(dǎo)擴(kuò)增培養(yǎng)基；5)激活多種造血相關(guān)的基因。作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述培養(yǎng)基是指在無(wú)血清的高糖DMEM/F12培養(yǎng)基中添的EGF, FGF-2, IPDGF, IGF 和 TGF-β 五因子。作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述培養(yǎng)基是指在無(wú)血清的高糖DMEM/F12培養(yǎng)基中添的shh, SCF，ΤΡ0, Flt3L, Deltal, IGFBP, Angiopoietin, MBP4, LIF, TGF-β 十因子。作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述多種小RNA分子是指miR-138-1，miR-138-2, miR-433以及靶向EIDlmRNA不同位點(diǎn)的siR-EIDl分子的序列。所述祀向EIDlmRNA不同位點(diǎn)的siR-EIDl分子的序列見(jiàn)表2。作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述轉(zhuǎn)決定后的造血干細(xì)胞培養(yǎng)是指在造血干細(xì)胞誘導(dǎo)擴(kuò)增培養(yǎng)基中以5X 105/ml的細(xì)胞密度進(jìn)行培養(yǎng)至少3天。核酸多肽納米粒的組裝是指不同的小RNA分子與多肽轉(zhuǎn)染試劑按實(shí)例3配比、程序和時(shí)間的配制過(guò)程，通過(guò)每天一次共二次的轉(zhuǎn)染以達(dá)到最佳的誘導(dǎo)效率。作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述激活多種造血相關(guān)的基因是指Runxl，Bmil, HoxB4, Gatal, Gata2, Gfil, Sall4, Pu.1, Scl, Md, C-myc, C-myb, Kcl4, Cxcr4,和 Crb,但不局限于這些基因。間充干細(xì)胞培養(yǎng)基配方可制造成不同的培養(yǎng)試劑盒，其中包括不同間充質(zhì)干細(xì)胞增殖所需要的細(xì)胞增殖因子、細(xì)胞分化抑制劑。 造血干細(xì)胞誘導(dǎo)擴(kuò)增培養(yǎng)基配方可制造成不同的培養(yǎng)試劑盒，其中包括造血干細(xì)胞增殖所需要的細(xì)胞增殖因子、細(xì)胞分化抑制劑。具體配方成分見(jiàn)表3。使用本發(fā)明的方法獲得的誘導(dǎo)造血干細(xì)胞，可用于血液病如再生障礙性貧血和白血病的治療。下面結(jié)合具體實(shí)例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。實(shí)例1.間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)和擴(kuò)增脂肪/骨髓/臍帶的獲取在捐獻(xiàn)者同意的前提下進(jìn)行的。人脂肪來(lái)源干細(xì)胞的采集、分離和培養(yǎng):脂肪抽吸物被分為2種成分:一種是密度小的脂質(zhì)成分，另一種是密度大的水性成分，為液體部分。液體成分被用作脂肪來(lái)源干細(xì)胞的來(lái)源。無(wú)菌條件下將獲取的脂肪組織用同體積的PBS液反復(fù)沖洗3到5次，加入0.1% I型膠原酶，37°C水浴振蕩、消化60min，然后以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化。IOOOg離心lOmin，棄上清液及懸浮的殘存組織，重懸細(xì)胞，加入2倍體積的紅細(xì)胞裂解液(NH4C1154mmol/L+KHC0310mmol/L+EDTA0.lmmol/L)靜置lOmin，離心、 棄上清液。用適量的PBS液清洗3次，200目篩網(wǎng)過(guò)濾，細(xì)胞懸液用細(xì)胞記數(shù)板記數(shù)，按每平方厘米1-3 X IO5細(xì)胞接種于150cm2的培養(yǎng)瓶，加20mL無(wú)血清的高糖 DMEM/F12 培養(yǎng)基，添加 20ng/ml EGF, 20ng/ml FGF-2, 10ng/mlPDGF-BB, 5ng/ml IGF和0.5ng/ml TGF- β混合均勻，置于37°C、5%的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。本發(fā)明公開(kāi)的培養(yǎng)基是一種快速擴(kuò)增無(wú)分化的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液，它能培養(yǎng)出高度一致的無(wú)分化的間充質(zhì)干細(xì)胞，為后續(xù)的產(chǎn)生造血干細(xì)胞提供了可靠的保證。相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)特征及增殖情況，36 48h后首次換液，以后每72h換液I次。待細(xì)胞融合超過(guò)培養(yǎng)瓶底80%時(shí)，常規(guī)胰酶消化傳代。人脂肪來(lái)源干細(xì)胞的鑒定:取第3或4代細(xì)胞以0.25%胰酶消化后，流式細(xì)胞術(shù)分析研究發(fā)現(xiàn) ADSCs 主要表達(dá) CD44、CD73、CD90、CD105、CD166、CD29、CD49e 和 HLA-ABC，而不表達(dá)⑶34、⑶3、⑶19、⑶45、⑶14、⑶31、⑶62L、⑶95L和HLA-DR (見(jiàn)

圖1)。這個(gè)結(jié)果和其他的MSCs幾乎一致。但ADSCs與BMSCs也有差別:大部分BMSCs表達(dá)CDlO和CD106，而表達(dá)CDlO的ADSCs僅占5% 20% ;幾乎所有的ADSCs表達(dá)CD49f和CD54，而B(niǎo)MSCs極少表達(dá)。實(shí)例2.miRNAs序列、結(jié)構(gòu)和合成通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)和相關(guān)的預(yù)測(cè)軟件(Target Scan)，我們篩選和鑒定了三種miRNAs(見(jiàn)圖2)。第一個(gè)miRNA是miRNA-138-1，其序列相對(duì)應(yīng)的短的發(fā)卡DNA序列如下:CCCUGGCAUGGUGUGGUGGGGCAGCUGGUGUUGUGAAUCAGGCCGUUGCCAAUCAGAGAACGGCUACUUCACAACACCAGGGCCACACCACACUACAGG.
第二個(gè)miRNA是miRNA-138_2，其序列相對(duì)應(yīng)的短的發(fā)卡DNA序列如下:CGUUGCUGCAGCUGGUGUUGUGAAUCAGGCCGACGAGCAGCGCAUCCUCUUACCCGGCUAUUUCACGACACCAGG⑶UGCAUCA第三個(gè)miRNA是miRNA_433，其序列相對(duì)應(yīng)的短的發(fā)卡DNA序列如下:CCGGGGAGAAGUACGGUGAGCCU⑶CAUUAUUCAGAGAGGCUAGAUCCUCUGUGUUGAGAAGGAUCAUGAUGGGCUCCUCG ⑶⑶ UCUCCAGG這些miRNAs都可以通過(guò)化學(xué)合成的方法獲得，為了加強(qiáng)穩(wěn)定性這些小RNA的組成單體可進(jìn)行全部或部分不同的化學(xué)修飾， 如甲氧或乙氧修飾。本發(fā)明中的miRNAs活性成分的制備方法如下:將4種不同的核苷酸單體經(jīng)RNA/DNA合成儀按特定的設(shè)計(jì)序列合成三種不同的小RNA單鏈，這些小RNA單鏈序列如上所示。合成好的小RNA單鏈再經(jīng)過(guò)分離純化除去其它成分，進(jìn)行退火形成三個(gè)特征的miRNAs。將這三種miRNA分子冷凍濃縮成干粉作為配方中的小核酸活性成分，在低溫下保存，干粉包括miRNA-138-1、miRNA-138-2和miRNA_433，這些miRNA中均含有一個(gè)EIDl基因的種子片段。將它們分別與含有EIDl的3‘UTR區(qū)序列的熒光素酶質(zhì)粒(pRL-TK)共轉(zhuǎn)染脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，轉(zhuǎn)染36小時(shí)后熒光素酶活性分析結(jié)果顯示這些小RNA分子(包括siR-EIDl, shR-EIDl和sRNA_M)均能有效的下調(diào)把基因EIDl(見(jiàn)圖3)，使不同的組蛋白乙酰化和多種轉(zhuǎn)錄因子乙酰化，從而激活了間充質(zhì)干細(xì)胞，使其更容易向其他干細(xì)胞轉(zhuǎn)化。為了加強(qiáng)小RNA的干擾效應(yīng)，我們采用了這三種小RNA (sRNA-M)的結(jié)合戰(zhàn)略，最終的小核酸活性成分是在miRNA-138-1、miRNA-138-2和miRNA_433合成后根據(jù)干粉重量的1:1:1比例要求加以混合配制。實(shí)例3.小核酸多肽納米粒的制備和細(xì)胞轉(zhuǎn)染
分別將上述小核酸活性成分的混合物和透皮穿膜肽(從北京吉利奧生物技術(shù)發(fā)展有限公司購(gòu)買(mǎi))構(gòu)溶解在醫(yī)用級(jí)去離子水中，混合均勻lOmin，根據(jù)核酸與多肽的重量百分比:即1:10到1:100，在攪拌狀態(tài)下再將小核酸活性成分的溶液緩慢滴加透皮穿膜肽的溶液中，繼續(xù)攪拌使小核酸活性成分和透皮穿膜肽能充分混合，靜止20分鐘，讓其充分自組裝成納米顆粒，備用。為了提高小RNA誘導(dǎo)人間質(zhì)干細(xì)胞向造血干細(xì)胞轉(zhuǎn)決定的效率，本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)化了具體的誘導(dǎo)方案，這里公開(kāi)的8種誘導(dǎo)配方見(jiàn)表I。從中可見(jiàn)方案3中的第二種誘導(dǎo)配方的效率最高，即通過(guò)每天一次共二次的轉(zhuǎn)染，能使80%的人間質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)決定成造血干細(xì)胞。比我們?cè)瓉?lái)的誘導(dǎo)方法大為改進(jìn)，使通過(guò)此技術(shù)能獲得臨床級(jí)的造血干細(xì)胞成為可能。進(jìn)一步將可用于血液病如再生障礙性貧血和白血病的治療表1.人間質(zhì)干細(xì)胞向造血干細(xì)胞轉(zhuǎn)決定的誘導(dǎo)方案
權(quán)利要求
1.一種能夠大規(guī)模并快速高純度地誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)決定成造血干細(xì)胞的方法，其特征在于，包括下列步驟: 1)制備均質(zhì)的間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)基； 2)多種小RNA分子的組合； 3)核酸多肽納米粒的組裝和轉(zhuǎn)染； 4)轉(zhuǎn)決定后的造血干細(xì)胞誘導(dǎo)擴(kuò)增培養(yǎng)基； 5)激活多種造血相關(guān)的基因。
2.按權(quán)利要求1所述的一種能夠大規(guī)模并快速高純度地誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)決定成造血干細(xì)胞的方法，其特征在于:所述培養(yǎng)基是指在無(wú)血清的高糖DMEM/F12培養(yǎng)基中添的EGF, FGF-2, PDGF-BB, IGF 和 TGF- β 五因子。
3.按權(quán)利要求1所述的一種能夠大規(guī)模并快速高純度地誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)決定成造血干細(xì)胞的方法，其特征在于:所述培養(yǎng)基是指在無(wú)血清的高糖DMEM/F12培養(yǎng)基中添的shh, SCF，TPO, Flt3L, Deltal, IGFBP, Angiopoietin, MBP4, LIF, TGF-β 十因子。
4.按權(quán)利要求 1所述的一種能夠大規(guī)模并快速高純度地誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)決定成造血干細(xì)胞的方法，其特征在于:所述多種小RNA分子是指miR-138-l，miR-138-2，miR-433以及靶向EIDlmRNA不同位點(diǎn)的siR-EIDl分子的序列。
5.按權(quán)利要求1所述的一種能夠大規(guī)模并快速高純度地誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)決定成造血干細(xì)胞的方法，其特征在于:所述轉(zhuǎn)決定后的造血干細(xì)胞培養(yǎng)是指在造血干細(xì)胞誘導(dǎo)擴(kuò)增培養(yǎng)基中以5X 105/ml的細(xì)胞密度進(jìn)行培養(yǎng)至少3天。
6.按權(quán)利要求1所述的一種能夠大規(guī)模并快速高純度地誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)決定成造血干細(xì)胞的方法,其特征在于:所述激活多種造血相關(guān)的基因是指Runxl, Bmil, HoxB4, Gatal, Gata2, Gfil, Sall4, Pu.1, Scl, Md, C-myc, C-myb, Kcl4, Cxcr4,和 Crb0
7.按權(quán)利要求1所述的一種能夠大規(guī)模并快速高純度地誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)決定成造血干細(xì)胞的方法，其特征在于:所述的間充干細(xì)胞培養(yǎng)基配方可制造成不同的培養(yǎng)試劑盒，其中包括不同間充質(zhì)干細(xì)胞增殖所需要的細(xì)胞增殖因子、細(xì)胞分化抑制劑。
8.按權(quán)利要求1所述的一種能夠大規(guī)模并快速高純度地誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)決定成造血干細(xì)胞的方法，其特征在于:所述造血干細(xì)胞擴(kuò)增用培養(yǎng)基配方包括0-1 μ g/ml Sonichedgehog、0_lμ g/ml DeltaUO-1 μ g/ml FGF2、0_1μ g/ml IGFBP、0_1μ g/ml SCF、0_1μ g/ml Angiopoietin、0_lμ g/mlTP0、0_lμ g/ml MBP、0_1μ g/ml LIF>0-1μ g/ml TGF-β 、0-100 μ M MTEPA、l_5mM NAC。
全文摘要
本發(fā)明提出了一種能夠大規(guī)模并快速高純度地誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)決定成造血干細(xì)胞的方法，包括下列步驟1)制備均質(zhì)的間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)基；2)多種小RNA分子的組合；3)核酸多肽納米粒的組裝和轉(zhuǎn)染；4)轉(zhuǎn)決定后的造血干細(xì)胞誘導(dǎo)擴(kuò)增培養(yǎng)基；5)激活多種造血相關(guān)的基因，解決了現(xiàn)有技術(shù)造血干細(xì)胞治療中的細(xì)胞配型困難、免疫排斥和造血干細(xì)胞數(shù)量限制的技術(shù)瓶徑的問(wèn)題。
文檔編號(hào)C12N15/87GK103088065SQ20131002887
公開(kāi)日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2013年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月25日
發(fā)明者殷勤偉, 黃兵 申請(qǐng)人:黃兵