專(zhuān)利名稱(chēng)：具抗腫瘤活性的馬氏珠母貝全臟器糖蛋白、糖胺聚糖及其提取工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從馬氏珠母貝全臟器提取的糖蛋白、糖胺聚糖，及其提取工藝，上述糖蛋白、糖胺聚糖化合物具有抗腫瘤、抗凝等活性，可作為抗腫瘤藥的醫(yī)藥組合物。
惡性腫瘤嚴(yán)重危害人類(lèi)的健康，而抗癌化療藥都呈現(xiàn)出一定的毒性。從動(dòng)、植物中提取一些具有抗腫瘤活性的天然化合物，用于生產(chǎn)高效低毒的抗腫瘤藥物是抗腫瘤藥物研究的一個(gè)方向。珍珠為名貴中藥，有報(bào)道珍珠層粉對(duì)小鼠肉瘤S-180有抑制作用，作為育成珍珠和珍珠層的母體—珠母貝全臟器，是否也含有相同或相似作用的糖蛋白、糖胺聚糖化合物，未有研究報(bào)道。本研究組已證實(shí)馬氏珠母貝全臟器的提取物具有顯著的抗癌作用，其單獨(dú)應(yīng)用有顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖作用，與其它化療藥合用可顯著增敏化療藥的抑瘤作用，同時(shí)對(duì)抗其抑制免疫的不良反應(yīng)。
本發(fā)明的目的在于從馬氏珠母貝全臟器提取一種或數(shù)種具有抗癌活性的天然化合物，確定其化學(xué)本質(zhì)及結(jié)構(gòu)特征，了解其理化特性，為臨床醫(yī)學(xué)提供一種新的抗腫瘤藥物。
本發(fā)明涉及從馬氏珠母貝全臟器提取的糖蛋白、糖胺聚糖二類(lèi)化合物。這二類(lèi)化合物是從馬氏珠母貝全臟器提取，純化后經(jīng)化學(xué)組成測(cè)定、氣相色譜分析 紅外光譜分析、高效液相色譜分析鑒定證實(shí)其化學(xué)本質(zhì)及結(jié)構(gòu)特征的。
本研究組從馬氏珠母貝全臟器提取糖蛋白、糖胺聚糖的工藝為馬氏珠母貝全臟器凍融、鹽溶、有機(jī)溶劑沉淀或用等體積丙酮浸泡脫脂，濾除丙酮液后烘干粉碎，用胃酶、胰酶或胰酶、枯草桿菌中性蛋白酶酶解，滅酶后用硅藻土、活性碳(2∶3)脫色，經(jīng)有機(jī)溶劑(丙酮、乙醇、醋酸乙酯)沉淀后干燥成粉末；上述粉末用1.0％活性碳及0.5％硅藻土脫色，pH2.0及pH7.0除雜蛋白及透析脫鹽，透析液用60％乙醇-乙酸鈉沉淀及5％CTAB沉淀所得級(jí)分再經(jīng)60％乙醇-乙酸鈉沉淀及5％CTAB絡(luò)合，得一系列化合物。主要級(jí)分經(jīng)化學(xué)組成測(cè)定氨基己糖含量為52.5％，其中氨基半乳糖含量為34.3％，己糖醛酸含量為7.3％；經(jīng)醋酸纖維素薄膜電泳顯示為單一區(qū)帶，Rf在0.3～0.4之間；經(jīng)抗腫瘤試驗(yàn)結(jié)果顯示對(duì)體內(nèi)S-180肉瘤和艾氏腹水癌有顯著增敏陽(yáng)性對(duì)照藥的抑瘤作用，抑瘤率分別達(dá)61.96％與46.3％；對(duì)體外培養(yǎng)HL-60細(xì)胞有一定的殺傷作用；同時(shí)，抗凝血實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示提取物有一定的抗凝作用，抗凝效果為肝素的二百分之一。
上述兩種化合物作為醫(yī)藥組合物，特別是抗腫瘤的藥理活性，是通過(guò)下述實(shí)驗(yàn)證實(shí)的。
實(shí)施例一1、材料與方法馬氏珠母貝全臟器糖胺聚糖由權(quán)利要求書(shū)所述工藝提取而得。
臺(tái)盼蘭、5-Fu、替加氟。
KM小鼠由廣東醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)單位中心提供，普通級(jí)，體重20±2g，雌雄各半。
移殖性腫瘤S180肉瘤和艾氏腹水癌(EAC)由中山醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究中心提供，廣東醫(yī)學(xué)院藥理教研室腫瘤研究小組常規(guī)傳代培養(yǎng)。
無(wú)菌條件下，兩次實(shí)驗(yàn)分別抽取S180和艾氏腹水癌(EAC)腹水液，用N.S以1∶1稀釋(臺(tái)盼蘭染色計(jì)數(shù)為8.0×106個(gè)/ml和6.5×106個(gè)/ml)，無(wú)菌接種(每鼠0.2ml)于KM小鼠右腋下。接種后次日隨機(jī)分成生理鹽水組、陽(yáng)性對(duì)照組(5-FU或替加氟)、低劑量受試藥組(馬氏珠母貝全臟器糖胺聚糖)、高劑量受試藥組(馬氏珠母貝全臟器糖胺聚糖)、及陽(yáng)性對(duì)照藥與受試藥合用組共五組。每組小鼠分別灌胃給藥(0.1ml/10g體重)，連續(xù)10天，第11天處死，稱(chēng)體重，解剖取肉瘤稱(chēng)重。
2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果馬氏珠母貝全臟器糖胺聚糖對(duì)S180肉瘤和艾氏腹水癌(EAC)的抑瘤作用見(jiàn)表1、2。
表1.馬氏珠母貝全臟器糖胺聚糖對(duì)S180的抑瘤作用組別劑量 動(dòng)物數(shù)體重瘤重 抑瘤(mg/kg) 給藥前給藥后率(％)(1)N.S對(duì)照組1321.6±2.5 30.6±4.70.92±0.4(2)5-FU 25 1022.3±2.4 27.9±3.40.60±0.4334.5*(3)馬氏珠母貝全 50 1121.3±2.7 29.1±4.50.86±0.366.5臟器糖胺聚糖(4)馬氏珠母貝全 2001222.0±2.5 28.3±3.70.79±0.4714.1臟器糖胺聚糖(5)(2)+(3) 1222.2±2.7 26.6±1.80.35±0.1661.96**P＜0.05**P＜0.001表2.馬氏珠母貝全臟器糖胺聚糖對(duì)艾氏腹水癌(EAC)的抑瘤作用組別 劑量 動(dòng)物數(shù)體重瘤重 抑瘤(mg/kg) 給藥前 給藥后 率(％)(1)N.S對(duì)照組 1024.6±2.2 30.7±4.1 2.12±1.16(2)替加氟5 1024.3±2.7 32.8±6.8 1.58±0.8925.6(3)馬氏珠母貝全 5 1024.8±3.2 29.6±2.9 1.60±0.7724.5臟器糖胺聚糖(4)馬氏珠母貝全 101025.9±1.8 31.1±3.5 1.89±0.5710.1臟器糖胺聚糖(5)(2)+(3) 1024.3±3.0 29.1±4.8 1.14±0.7046.3**P＜0.05實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明馬氏珠母貝全臟器糖胺聚糖(50mg/kg)對(duì)S180肉瘤雖然抑瘤作用較弱(抑瘤率6.5％)，但可顯著增敏陽(yáng)性對(duì)照藥5-FU(25mg/kg，抑瘤率達(dá)34.5％，P＜0.05)的抑瘤作用，抑瘤率達(dá)61.9％(P＜0.001)；馬氏珠母貝全臟器糖胺聚糖(5mg/kg)對(duì)艾氏腹水癌(EAC)有抑瘤作用，抑瘤率達(dá)24.5％，而且與陽(yáng)性對(duì)照藥替加氟(5mg/kg，抑瘤率達(dá)25.6％，P＜0.05)有協(xié)同作用，抑瘤率達(dá)46.3％(P＜0.01)。且兩次實(shí)驗(yàn)前后各組小鼠體重變化與生理鹽水對(duì)照組無(wú)顯著差異，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。3、結(jié)論馬氏珠母貝全臟器糖胺聚糖對(duì)體內(nèi)S180肉瘤和艾氏腹水癌(EAC)有顯著增敏陽(yáng)性對(duì)照藥的抑瘤作用，抑瘤率分別達(dá)61.9％和46.3％。
實(shí)施例二1、材料與方法馬氏珠母貝全臟器糖胺聚糖由權(quán)利要求書(shū)所述工藝提取而得。
HL-60細(xì)胞由中山醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究中心提供，廣東醫(yī)學(xué)院藥理教研室腫瘤研究小組常規(guī)傳代培養(yǎng)。
于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，接種HL-60細(xì)胞懸液，接種細(xì)胞數(shù)為5.0×104個(gè)/ml，每組設(shè)3個(gè)平行孔，分別加入不同濃度的5-FU及馬氏珠母貝全臟器糖胺聚糖，空白組加入等量的培養(yǎng)基，置于37℃、5％CO2孵化箱培養(yǎng)24h，用臺(tái)盼蘭染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞。試驗(yàn)結(jié)果重復(fù)兩次。
2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果馬氏珠母貝全臟器糖胺聚糖對(duì)HL-60細(xì)胞的殺傷作用見(jiàn)表3。表3、馬氏珠母貝全臟器糖胺聚糖對(duì)HL-60細(xì)胞的殺傷作用組別劑量例數(shù) 成活細(xì)胞數(shù) 殺傷率(％)IC50(1)N.S對(duì)照組 培養(yǎng)基97.06(2)5-FU0.001 94.67±2.133.85(3)馬氏珠母貝全臟器1.0 94.33+1.7 38.671.72糖胺聚糖(4)馬氏珠母貝全臟器0.1 95.25±2.125.64糖胺聚糖(成活細(xì)胞數(shù)為×104個(gè)/ml)
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明馬氏珠母貝全臟器糖胺聚糖(1.0mg/ml，0.1mg/ml)在用藥24h時(shí)對(duì)HL-60細(xì)胞的殺傷率分別為38.7％和25.6％，IC50為1.72mg/ml。5-FU(0.01mg/ml)對(duì)HL-60細(xì)胞的殺傷率為33.85％，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。提示馬氏珠母貝全臟器糖胺聚糖對(duì)體外培養(yǎng)HL-60細(xì)胞具有一定的殺傷作用。
3、結(jié)論馬氏珠母貝全臟器糖胺聚糖劑量為1.0mg/ml及0.1mg/ml時(shí)對(duì)體外培養(yǎng)HL-60細(xì)胞殺傷率分別達(dá)38.7％和25.6％。
實(shí)施例三用前述方法對(duì)馬氏珠母貝全臟器糖蛋白進(jìn)行研究，也初步證明這種化合物有類(lèi)似的抗腫瘤活性。
實(shí)施例四用馬氏珠母貝全臟器糖胺聚糖、糖蛋白進(jìn)行了其它藥理學(xué)方面的研究，初步證明其有一定的抗凝作用，抗凝效果為肝素的二百分之一；也有對(duì)抗抗癌化療藥物抑制免疫的副作用的作用。
權(quán)利要求
1.一種具有抗腫瘤及抗凝等醫(yī)藥作用的醫(yī)藥組合物，其特征在于該組合物含有馬氏珠母貝(Pinctada martensi(Dunker))全臟器的提取物。
2.如權(quán)利要求1所述的醫(yī)藥組合物，其特征在于其中馬氏珠母貝全臟器提取物的化學(xué)本質(zhì)是馬氏珠母貝所含的糖蛋白、糖胺聚糖。
3.如權(quán)利要求1所述的醫(yī)藥組合物所含的馬氏珠母貝全臟器提取物，其特征是提取工藝以馬氏珠母貝全臟器為原料，經(jīng)凍融或鹽溶、有機(jī)溶劑(丙酮、乙醇、醋酸乙酯)沉淀得馬氏珠母貝全臟器糖蛋白；經(jīng)胃蛋白酶、胰蛋白酶、枯草桿菌中性蛋白酶水解，經(jīng)脫色、有機(jī)溶劑沉淀后用吸附、等電點(diǎn)沉淀、透析、醇沉、CTAB沉淀等法除雜，粗提物再經(jīng)醇沉、CTAB絡(luò)合法純化，得馬氏珠母貝全臟器糖胺聚糖制品。
4.如權(quán)利要求3所述的提取工藝，其特征在于原料是馬氏珠母貝(Pinctada martensi(Dunker))全臟器。
5.如權(quán)利要求3所述的提取工藝，其特征在于提取所得的馬氏珠母貝全臟器糖蛋白、糖胺聚糖具抗腫瘤活性及抗凝等藥理活性。
6.如權(quán)利要求3所述的提取工藝，其特征是按此工藝提取所得的一系列化合物中有若干級(jí)分具有抗腫瘤活性。
7.如權(quán)利要求3所述的提取工藝，其特征在于水解所用酶是胃蛋白酶、胰蛋白酶、枯草桿菌中性蛋白酶。
8.如權(quán)利要求3所述的提取工藝，其特征在于凍融、鹽溶或酶解后用有機(jī)溶劑(丙酮、乙醇、醋酸乙酯)沉淀，然后用1.0％活性碳及0.5％硅藻土吸附，PH2.0及PH7.0等電點(diǎn)除蛋白及透析脫鹽，透析液用60％乙醇-乙酸鈉沉淀及5％CTAB沉淀，所得級(jí)分再經(jīng)60％乙醇-乙酸鈉沉淀及5％CTAB絡(luò)合，得一系列化合物。
9.如權(quán)利要求3所述的提取工藝，其特征在于純化中CTAB絡(luò)合法中用1.0ml Nacl解離。
全文摘要
具抗腫瘤活性的馬氏珠母貝全臟器糖蛋白、糖胺聚糖及其提取工藝。本發(fā)明公開(kāi)了從馬氏珠母貝全臟器提取的糖蛋白、糖胺聚糖化合物作為醫(yī)藥組合物的用途。含馬氏珠母貝全臟器提取的糖蛋白、糖胺聚糖的醫(yī)藥組合物具有十分顯著的抑制腫瘤作用,及抗凝和對(duì)抗化療的免疫抑制等醫(yī)藥作用,研究表明由馬氏珠母貝全臟器提取的這兩類(lèi)化合物是一種新型的有醫(yī)療作用的化合物。本發(fā)明公開(kāi)了提取馬氏珠母貝全臟器糖蛋白、糖胺聚糖的提取工藝。
文檔編號(hào)A61K35/56GK1321469SQ0010519
公開(kāi)日2001年11月14日 申請(qǐng)日期2000年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2000年4月30日
發(fā)明者吳紅棉, 陳方, 雷曉凌, 吳鐵, 洪鵬志 申請(qǐng)人:湛江海洋大學(xué), 廣東醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥科技開(kāi)發(fā)中心