用于鑒定病原體的寡核苷酸微陣列的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于鑒定病原體的寡核苷酸微陣列。具體地，本發(fā)明涉及一種用于檢測來自患者的生物樣品中兩種或更多種病原體的目標核酸的方法。本發(fā)明還描述了一種用于檢測檢驗樣品中病原體的目標核酸的試劑盒。所述試劑盒包括至少一對引物和含有至少一種探針的寡核苷酸微陣列。
【專利說明】用于鑒定病原體的寡核苷酸微陣列
[0001]本申請是申請日為2006年12月29日，申請?zhí)枮?00680053490.5的，發(fā)明名稱為“用于鑒定病原體的寡核苷酸微陣列”的發(fā)明專利申請的分案申請。
[0002]本申請要求于2005年12月30日提交的美國臨時專利申請60/755，504的權(quán)益。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003]本發(fā)明涉及用于檢測檢驗樣品中病原體存在情況的檢驗試劑盒和方法。檢驗樣品可以獲自患者或者來自可能含有病原體的食物或飲料的來源。
【背景技術(shù)】
[0004]諸如腦炎、腦膜炎、腦(脊)膜炎、肺炎、腸胃炎、心內(nèi)膜炎、尿道感染的疾病由病原體感染引起。病原體包括不同的細菌、病毒、真菌和原生動物。不同的致病性感染往往具有類似的癥狀，這致使難以提供感染或疾病的起因的確診。例如，腦炎和腦(脊)膜炎患者一般都會出現(xiàn)發(fā)燒、頭痛和驚厥。快速而準確地鑒定引起這些癥狀的病原體對于確定開出什么藥方至關(guān)重要。當前用于鑒定病原體的診斷方法包括:鏡檢、微生物培養(yǎng)、血清免疫測試和聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)。這些方法需要經(jīng)過嚴格訓練的人員而且非常費時。
[0005]按照常規(guī)的PCR方法，將含有起模板作用的基因的檢驗樣品與設(shè)計成用于擴增具有特定長度的至少一種基因的至少一對PCR引物混合。通過使所擴增的PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳并使其染色，就可使PCR產(chǎn)物顯現(xiàn)。按照PCR方法，根據(jù)所顯現(xiàn)的PCR產(chǎn)物長度來鑒定檢驗樣品中所含的基因。在同一樣品中可以擴增多對引物以便更有效地篩選多種基因。
[0006]然而，隨著引物試劑中所含PCR引物的數(shù)量增多，在電泳凝膠上的“噪聲”也隨之增多。當由于非特異性退火產(chǎn)生PCR產(chǎn)物時，“噪聲”就會出現(xiàn)。出于此原因，當使用PCR反應(yīng)時，難以確定不只是僅少數(shù)基因存在。
[0007]此外，有必要設(shè)計好引物，以使經(jīng)PCR反應(yīng)擴增出的PCR產(chǎn)物在分辨率有限的電泳凝膠上可以辨別。要設(shè)計出可產(chǎn)生適當?shù)目煞直鍼CR產(chǎn)物且噪聲低的引物并不容易并且耗時。因此，嚴格的基于PCR/電泳的方法對于篩選大量基因表達是低效的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明涉及用于檢測生物樣品或檢驗樣品中的目標核酸的方法和檢驗試劑盒。使用寡核苷酸微陣列快速地高通量篩選病原體的存在情況。寡核苷酸微陣列含有已知病原體的各種聚核苷酸(探針)，并且以一個雜交測定來鑒別病原體。
[0009]一方面，本發(fā)明涉及一種簡易而快速地確定生物樣品或檢驗樣品中是否存在含有目標核酸的多核苷酸的方法。
[0010]另一方面，本發(fā)明涉及一種用于檢測生物樣品或檢驗樣品中病原體的目標核酸的方法，所述方法包括:利用與不止一種病原體中的保守區(qū)結(jié)合的一對或更多對引物來擴增樣品中的目標核酸；使擴增的目標核酸與寡核苷酸微陣列接觸；且檢測目標核酸與探針的結(jié)合情況，其中與特定病原體探針結(jié)合則表明樣品中存在該病原體。所述微陣列包括含與不同病原體互補的多核苷酸序列的兩種或以上的探針或者探針組。
[0011]又一方面，本發(fā)明涉及一種辨別樣品中的大腸桿菌(E.COli)和沙門氏菌的方法。所述方法包括:利用與大腸桿菌和沙門氏菌中的保守區(qū)結(jié)合的一對或更多對引物擴增樣品中的核酸；使擴增的目標核酸與寡核苷酸微陣列接觸；且檢測核酸與作為指示樣品中存在大腸桿菌和/或沙門氏菌的探針的結(jié)合情況。所述微陣列包括含與大腸桿菌和沙門氏菌中的可變區(qū)互補的多核苷酸序列的兩種或以上探針。
[0012]在另一方面，本發(fā)明涉及一種用于檢測在生物樣品或檢驗樣品中病原體的目標核酸的試劑盒，所述試劑盒包括:至少一對引物和寡核苷酸微陣列，所述微陣列包含固定化在固相支持體上的至少一種探針。
[0013]根據(jù)以下的說明且結(jié)合附圖，并通過例示闡明本發(fā)明原理，本發(fā)明的其他方面和優(yōu)點將顯而易見。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1A和圖1B顯示了 16SrDNA的細菌DNA序列的保守引物區(qū)和可變探針區(qū)。
[0015]圖2A和圖2B顯 示了 18SrDNA的真菌DNA序列的保守引物區(qū)和可變探針區(qū)。
[0016]圖3是本發(fā)明實施方案的圖式概述。
【具體實施方式】
[0017]1.病原體
[0018]術(shù)語“病原體”指的是疾病因子或致病因子。術(shù)語病原體最通常是指感染性生物體。它們包括但不限于:細菌、病毒、真菌和原生動物。本發(fā)明的方法和試劑盒可用于鑒定已經(jīng)引起傳染病或食物中毒的病原體和微生物。病原體的實例包括但不限于:立克次氏體、衣原體、支原體、螺旋體、鏈球菌、沙門氏菌(Salmonella)、葡萄球菌、支原體、單核細胞增生李斯特氏菌(L.monocytogenes)、腦膜炎奈瑟氏菌(N.meningtides)、大腸桿菌、流感嗜血桿菌(H.1nfluenzae)、布氏疏螺旋體(B.burgdorferi)、鉤端螺旋體、變形菌、厭氧菌(anaecrobacter)、結(jié)核分支桿菌(M.tuberculosis)、腸球菌、脊髓灰質(zhì)炎病毒1、腸道病毒71、腸道病毒70、艾柯病毒2、艾柯病毒4、艾柯病毒6、艾柯病毒9、艾柯病毒11、艾柯病毒12、艾柯病毒26、柯薩奇病毒Al 3、柯薩奇病毒Al 5、柯薩奇病毒A18、柯薩奇病毒A20、柯薩奇病毒A21、柯薩奇病毒B3-A、柯薩奇病毒B3-C、HSV-1和HSV-2。
[0019]2.生物樣品和檢驗樣品
[0020]文中所用的術(shù)語“生物樣品”是指取自生物體或生物體的組分(例如細胞)的樣品。在一個實施方案中，生物體是哺乳動物。在另一個實施方案中，生物體是人類。樣品可以是任何生物組織或生物液體。通常生物樣品取自患者。這些樣品包括但不限于:組織、細胞、血液、血清、腦脊液、尿、細胞裂解物、血漿、糞便、唾液、血細胞、細針活檢樣品、腹膜液和胸膜液，或來自以上樣品的細胞。生物樣品同樣包括組織切片，例如用于組織學用途的冰凍切片。
[0021 ] 在某些實施方案中，本發(fā)明涉及一種方法，其中生物樣品選自組織、細胞、血液、血清、腦脊液、尿、細胞裂解物、血漿、糞便、唾液、血細胞、細針活檢樣品、腹膜液和胸膜液，或來自以上樣品的細胞。
[0022]本文所用的術(shù)語“檢驗樣品”是指取自非活體來源的樣品。檢驗樣品的來源包括但不限于:食物、飲料、土壤、地下水、海水和湖底沼澤水。在這些檢驗樣品中通常含有病原體和被病原體感染的細胞。
[0023]根據(jù)是否存在特定病原體的目標核酸來鑒定生物樣品和檢驗樣品的病原體。在某些實施方案中，目標核酸包括:病原體的基因組材料、線粒體0嫩、成嫩41?嫩、1111?嫩、病毒RNA、質(zhì)粒DNA以及它們的片段。
[0024]根據(jù)癥狀和感染途徑，病原體被分類成眾多組別。為了對應(yīng)多個組別，制備出多種目標核酸檢測試劑和寡核苷酸微陣列。使用目標核酸檢測試劑和寡核苷酸微陣列，它們根據(jù)癥狀而選擇。因此，可以在根據(jù)癥狀和感染途徑所預測的病原體之中高度準確地鑒定出真正的病原體。
[0025]3.目標核酸
[0026]目標核酸是待檢驗的病原體所固有的多核苷酸。此多核苷酸是遺傳材料，其包括:基因組DNA/RNA、線粒體DNA、rRNA、tRNA、mRNA、病毒RNA和質(zhì)粒DNA。通過檢測病原體特有的目標核酸的存在情況，可以推斷病原體自身的存在情況。類似地，存在對病原體的屬特異性的目標核酸則表明了存在該屬成員。
[0027]術(shù)語“核苷酸序列”或“核酸”或“多核苷酸”可交換使用并且指的是核苷酸的雜聚物或這些核苷酸的序列。“寡核苷酸”指的是約50個或以下核苷酸的多核苷酸。這些術(shù)語同樣指的是DNA或RNA，它們可以是單鏈或雙鏈的，并且可以相對于cDNA而言代表正義鏈或負義鏈。本文的序列中， A是腺嘌呤，C是胞嘧啶，T是胸腺嘧啶，G是鳥嘌呤，而N是A、C、G或T(U)?？梢灶A期，若多核苷酸是RNA，那么本文所提供的序列中的T(胸腺嘧啶)以U(尿嘧啶)來代替。
[0028]術(shù)語“互補的”或“互補性”指的是通過堿基配對多核苷酸的自然結(jié)合。例如，序列5’ -AGT-3’與互補的序列3’ -TCA-5’結(jié)合。兩條單鏈分子之間的互補性可以是“部分的”，致使只有某些核酸結(jié)合；或者可以是“完全的”，致使在單鏈分子之間存在完全互補性。核酸鏈之間的互補程度顯著地影響核酸鏈之間雜交的效率和強度。
[0029]本文所用的術(shù)語“純化的”或“基本上純化的”指的是:所指示的核酸或多肽以基本上不存在其他生物大分子(諸如多核苷酸、蛋白質(zhì)等)的情況下存在。
[0030]本文所用的術(shù)語“分離的”指的是:核酸與在該核酸天然來源中與其一起存在的至少一種其他組分分離。在一個實施方案中，所述核酸僅在(如果有的話)溶劑、緩沖劑、離子或正常地存在于核酸溶液中的其他組分存在的情況下存在。術(shù)語“分離的”和“純化的”不包括存在于它們的天然來源中的核酸。
[0031]本文所使用的“基本上等同的”或“基本上類似的”指的是:由于一個或更多個置換、缺失或添加而不同于參比序列的核苷酸序列，而所述置換、缺失或插入的實際結(jié)果并不導致參比序列與被試序列之間不利的功能相異。通常此基本上等同的序列有不超過約35%的不同(即與相應(yīng)的參比序列相比，基本上等同序列中個別核苷酸的置換、添加和/或缺失的數(shù)量除以基本上等同序列中核苷酸的總數(shù)量約等于0.35或更少)。這種序列被認為與所不序列具有65%的序列同一'丨生。在一個實施方案中,本發(fā)明的基本上等同的序列與參比序列有不超過30%不同(70%序列同一性)；在此實施方案的變體中，有不超過25%不同(75%序列同一'丨生)；在此實施方案的又一個變體中，有不超過20%不同(80%序列同一性)；在此實施方案的又一個變體中，有不超過10%不同(90%序列同一性)；在此實施方案的又一個變體中，有不超過5%不同(95%序列同一'丨生)。在一個實施方案中，所述核苷酸序列具有至少約65%的同一'丨生。在其它實施方案中,所述核苷酸序列具有至少約75%、80%、85%、90%、95%、98%或 99% 的同一性。
[0032]在某些方面，本發(fā)明涉及制備“目標核酸檢測試劑”。目標核酸檢測試劑可以或是目標核酸自身或是擴增的目標核酸。
[0033]使用常規(guī)的技術(shù)將目標核酸序列從生物樣品和檢驗樣品中分離。根據(jù)要分離的是什么類型的多核苷酸(DNA還是RNA)來確定所用的技術(shù)。分離技術(shù)也可以根據(jù)待調(diào)查的病原體的類型和生物/檢驗樣品的量來作出修改。
[0034]4.檢測試劑
[0035]在某些實施方案中，在與寡核苷酸微陣列雜交之前，目標核酸先被擴增以產(chǎn)生“目標核酸檢測試劑”。在其他實施方案中，在與寡核苷酸微陣列雜交之前，目標核酸不被擴增，這時“目標核酸檢測試劑”和目標核酸是等同的。在一個實施方案中，用一種或更多種標記分子標記目標核酸或所擴增的目標核酸。標記分子的附著有利于在與寡核苷酸微陣列雜交時檢測目標核酸或所擴增的目標核酸?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員所知熟的許多方法中的任一種摻入標記分子。在一個實施方案中，可以在制備樣品的目標核酸中的擴增步驟時，同時摻入標記分子。因此，例如使用包含標記分子的引物或核苷酸的聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)將提供含有所述標記分子的擴增產(chǎn)物。在某些實施方案中，標記分子包括:生物素、磁珠、熒光染料、放射性標記、酶、比色標記、有色玻璃或塑料珠。在一個實施方案中，如前文所述，使用含有標記分子的核苷酸(熒光素標記的UTP和/或CTP)進行轉(zhuǎn)錄擴增，致使標記摻入到所轉(zhuǎn)錄的核酸中。
[0036]作為選擇，標記分子可以直接加到原始目標核酸(例如:mRNA、polyA、mRNA、cDNA等)中。使標記分子附著核酸的方法為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知，這些方法包括:例如通過經(jīng)由激酶反應(yīng)使目標核酸磷酸化來進行切口平移或末端標記，隨后通過核酸接頭使樣品核酸與標記分子連接。
[0037]適用于本發(fā)明的可檢測標記分子包括:通過波譜學、光化學、生物化學、免疫化學、電學、光學或化學的方法可檢測的任何組合物。本發(fā)明的有用標記分子包括:生物素，用標記的鏈霉抗生物素綴合物染色；磁珠(例如Dynabeads?);熒光染料(例如熒光素、德克薩斯紅、羅丹明、綠色熒光蛋白等)；放射性標記(例如3H、1251、35S、14C或32P);酶(例如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶和在ELISA中通常使用的其他酶)；以及比色標記，諸如膠體金或有色玻璃或塑料(例如聚苯乙烯、聚丙烯、橡膠等)珠。教導使用這些標記的專利包括:美國專利號 3，817，837,3, 850，752,3, 939，350,3, 996，345,4, 277，437,4, 275，149 和 4，366，241。在一個實施方案中，標記分子是含摻入所擴增目標核酸中的標記分子的核苷酸。
[0038]含標記分子的核苷酸可以是用熒光物質(zhì)(Cy3、Cy5等)或生物素標記的核苷酸(單體)，因為它具有高檢測靈敏度而且易于操作。含標記分子的核苷酸被帶入通過PCR反應(yīng)擴增的多核苷酸中，并對擴增的多核苷酸進行標記。在用生物素標記核苷酸的情況下，被標記的多核苷酸通過酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)顯現(xiàn)。
[0039]在某些實施方案中，本發(fā)明包括:通過PCR擴增目標核酸的擴增步驟，以及檢測在PCR反應(yīng)擴增產(chǎn)物中是否存在含目標核酸的多核苷酸的基因檢測步驟。在基因檢測步驟中，例如使用寡核苷酸微陣列來檢測多核苷酸的存在情況。
[0040]5.目標核酸擴增步驟
[0041]在某些實施方案中，目標核酸檢測試劑通過擴增目標核酸來提供。在一個實施方案中，使用PCR擴增目標核酸檢測試劑。在目標核酸擴增步驟中，使用樣品提取物、用于擴增含目標核酸的多核苷酸的基因檢測引物試劑以及標記性核苷酸進行PCR反應(yīng)。樣品提取物是如下獲得的提取物:按照用于提取并純化DNA或RNA的已知的多核苷酸提取方法來提取并純化檢驗樣品中所含的多核苷酸。樣品提取物在PCR反應(yīng)中作為模板使用。
[0042]如果一種核酸與第二種核酸兩者在嚴格條件下與同一探針核酸雜交，則此核酸與第二種核酸基本上相同。基本上相同的核酸之間的同源性可以為80^^90^^95%或以上。
[0043]為了進行基因擴增步驟，讓樣品提取物、病原體鑒定引物試劑、被標記的核苷酸以及PCR反應(yīng)所必需的其他試劑和酶于一個反應(yīng)管中進行PCR反應(yīng)。通過RCR反應(yīng)擴增多核苷酸。
[0044]通常，理想的是在與寡核苷酸微陣列雜交之前擴增核酸樣品。合適的擴增方法包括但不限于:聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR) (Innis 等,PCR Protocols.A guide to Methods andApplication.Academic Press, Inc.San Diego, (1990))、連接酶鏈式反應(yīng)(LCR)(參見 Wu和Wallace, Genomics, 4:560(1989) ；Landegren 等,Science, 241:1077(1988)；和 Barringer等，Gene, 89:117 (1990) )、轉(zhuǎn)錄擴增(Kwoh 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 86:1173 (1989))、自動維持序列擴增(Guatelli 等,Proc.Nat.Acad.Sc1.USA, 87:1874 (1990))。在一個實施方案中，使用PCR擴增目標核酸。在另一個實施方案中，使用反轉(zhuǎn)錄酶(RT) -PCR擴增目標核酸。在又一實施方案中，使用Tth DNA聚合酶(可得自例如Promega(Cat.N0.M210A))進行PT-PCR。Tth DNA聚合酶是取自嗜熱真細菌嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus) HB-8的酶的重組體形式，是在74°C下復制DNA的熱穩(wěn)定酶，并且在95°C下表現(xiàn)出20分鐘的半衰期。Tth DNA聚合酶在鎂存在下催化核苷酸沿5’ 一 3’的方向聚合成雙鏈DNA，而在錳存在下使用RNA模板沿5’ 一 3’的方向使核苷酸聚合成DNA。Tth DNA聚合酶經(jīng)常用于PCR、RT_PCR、反轉(zhuǎn)錄以及在升高溫度下的引物延伸反應(yīng)。
[0045]本發(fā)明的擴增方法利用了以下酶活性:DNA聚合酶和依賴DNA的RNA聚合酶。用于本發(fā)明方法和組合物的DNA聚合酶能夠按照本發(fā)明的方法實施引物延伸。因此，所選聚合酶是能夠使核酸引物沿著目標核酸模板延伸的聚合酶，所述目標核酸模板至少主要由脫氧核糖核苷酸組成。聚合酶能夠從多核苷酸置換核酸鏈，其中所述多核苷酸是所述置換鏈與之結(jié)合的多核苷酸。
[0046]任何反轉(zhuǎn)錄酶皆可用于本發(fā)明的實施中，包括但不限于:Superscript RTII>“regular”MMLV-RT、AMV RT 或者它們的組合。
[0047]當樣品提取物中不存在預測的病原體時，以及當樣品提取物中不存在多核苷酸時，則在PCR產(chǎn)物中不存在擴增的多核苷酸，并且在隨后的檢測基因步驟中檢測不出多核苷酸。
[0048]當樣品提取物中存在預測的病原體時，來源于所述病原體的多核苷酸則在PCR反應(yīng)中充當模板。通過病原體鑒定引物試劑中的相應(yīng)擴增引物與模板結(jié)合，PCR反應(yīng)得以進行，由此擴增出含病原體所固有的目標核酸的多核苷酸。標記性核苷酸被帶入所擴增的多核苷酸(DNA)中，即被帶入PCR反應(yīng)產(chǎn)物中。由此PCR反應(yīng)產(chǎn)物被標記。
[0049]用于擴增目標核酸的引物根據(jù)從選自以下的病原體中分離的多核苷酸來設(shè)計:細菌、病毒、真菌和原生動物。在其他實施方案中，用于擴增目標核酸的引物根據(jù)從選自以下的病原體中分離的多核苷酸來設(shè)計:立克次氏體、衣原體、支原體、螺旋體、鏈球菌、沙門氏菌、葡萄球菌、支原體、單核細胞增生李斯特氏菌(L.monocytogenes)、腦膜炎奈瑟氏菌(N.meningtides)、大腸桿菌、流感嗜血桿菌(H.1nfluenzae)、布氏疏螺旋體(B.burgdorferi)、鉤端螺旋體、變形菌、厭氧菌、結(jié)核分支桿菌(M.tuberculosis)、腸球菌、脊髓灰質(zhì)炎病毒1、腸道病毒71、腸道病毒70、艾柯病毒2、艾柯病毒4、艾柯病毒6、艾柯病毒9、艾柯病毒11、艾柯病毒12、艾柯病毒26、柯薩奇病毒Al3、柯薩奇病毒Al5、柯薩奇病毒A18、柯薩奇病毒A20、柯薩奇病毒A21、柯薩奇病毒B3-A、柯薩奇病毒B3-C、HSV-1和HSV-2。在一些實施方案中，PCR利用了含從以上所列病原體的至少一種中分離的多核苷酸序列的引物。
[0050]在某些實施方案中，特定的引物 對能夠與不止一種病原體的多核苷酸退火。此引物對可退火至某些病原體中保守的區(qū)域。然而，引物對鄰接的核苷酸序列是可變區(qū)。使用此引物對使多種病原體的核酸序列能夠被擴增，而且還允許這些病原體在與寡核苷酸微陣列雜交時能夠得以辨別。當使用來自許多細菌和真菌的16S/18SrDNA基因的兩個相同區(qū)作為引物時，這兩個區(qū)通過PCR擴增提供了 197個堿基對(細菌)或248個堿基對(真菌)的DNA片段。在引物區(qū)之間的DNA片段中發(fā)現(xiàn)許多低保守區(qū)，這些低保守區(qū)提供了探針以根據(jù)其特定序列通過雜交來辨別病原體。參見出示了 16S rDNA的細菌DNA序列的圖1A和IB0出示了這兩個保守的引物區(qū)以及這兩個保守區(qū)之間的可變的探針區(qū)。圖2A和2B出示了真菌DNA序列的所述ISSrDNA片段中的引物區(qū)和探針區(qū)。
[0051]在一個實施方案中，PCR利用含選自SEQ ID NO: 1-12(表1)的多核苷酸的引物。引物對的一些組合包括:SEQ ID NO:1 和 2 ；SEQ ID NO:1 和 4 ；SEQ ID NO:1 和 6 ；SEQ ID NO: 3 和2 ；SEQ IDN0:3 和 4 ；SEQ IDN0:3 和 6 ；SEQ IDN0:5 和 2 ；SEQ IDN0:5 和 4 ；SEQ IDN0:5 和 6 ；SEQ ID NO: 5 6 ；SEQ ID NO: 7 8 ；SEQ ID NO:9 10 和 / 或 SEQ ID NO: 11 和 12。
[0052]表1
[0053]
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測來自患者的生物樣品中兩種或更多種病原體的目標核酸的方法，所述方法包括: 利用結(jié)合兩種或更多種不同病原體的保守區(qū)的至少第一和第二引物對來擴增樣品中的目標核酸；其中所述第一和第二引物對為分別對應(yīng)于革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌的SEQID NO: 1-2，和對應(yīng)于腸道病毒的SEQ ID NO:7-8 ； 使擴增的目標核酸與寡核苷酸微陣列接觸，所述微陣列包括含與兩種或更多種不同病原體互補的多核苷酸序列的兩種或以上的探針或兩個或以上的探針組，其中所述探針包括選自以下的多核苷酸序列:SEQ ID NO: 13-21，其對應(yīng)于鏈球菌、沙門氏菌、葡萄球菌、支原體、單核細胞增生李斯特氏菌(L.monocytogenes)、腦膜炎奈瑟氏菌(N.meningtides),和SEQ ID NO: 23-52，其對應(yīng)于大腸桿菌、流感嗜血桿菌(H.1nfluenzae)、布氏疏螺旋體(B.burgdorferi)、鉤端螺旋體、變形菌、厭氧菌、結(jié)核分支桿菌(M.tuberculosis)、腸球菌、脊髓灰質(zhì)炎病毒1、腸道病毒71、腸道病毒70、艾柯病毒2、艾柯病毒4、艾柯病毒6、艾柯病毒9、艾柯病毒U、艾柯病毒12、艾柯病毒26、柯薩奇病毒A13、柯薩奇病毒A15、柯薩奇病毒A18、柯薩奇病毒A20、柯薩奇病毒A21、柯薩奇病毒B3-A、柯薩奇病毒B3-C、HSV-1和HSV-2 ；和 檢測擴增的目標核酸與探針的結(jié)合情況，其中與探針結(jié)合則意味著在樣品中存在與所述探針互補的多核苷酸序列。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述目標核酸中的兩種是大腸桿菌和沙門氏菌，而所述探針選自用于沙門氏菌的SEQ ID NO: 14-17和用于大腸桿菌的SEQ ID NO: 23-26。
3.權(quán)利要求1的方法,其中所述生物樣品選自組織、細胞、血液、血清、腦脊液、尿、細胞裂解物、血漿、糞便、 唾液、血細胞、細針活檢樣品、腹膜液和胸膜液，或來自以上樣品的細胞。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述微陣列包括與普通癥狀有關(guān)的病原體的探針。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述微陣列包括與普通感染途徑有關(guān)的病原體的探針。
6.一種檢測取自患者的樣品中的大腸桿菌和/或沙門氏菌的目標核酸的方法，所述方法包括: 利用結(jié)合大腸桿菌和沙門氏菌中的保守區(qū)的一對或更多對引物擴增患者樣品中的核酸，其中至少一對引物是SEQ ID NO:1和2，其中其他的引物對選自SEQ ID NO: 1-6 ； 使擴增的目標核酸與寡核苷酸微陣列接觸，所述微陣列包括含與大腸桿菌和沙門氏菌中的可變區(qū)互補的多核苷酸序列的兩種或以上探針，其中至少一種探針選自對應(yīng)于沙門氏菌的SEQ ID NO: 14-17，且至少一種探針選自對應(yīng)于大腸桿菌的SEQ ID NO:23-26 ;和 檢測擴增的核酸與探針的結(jié)合情況，其中與選自SEQ ID NO: 14-17的至少一個探針的結(jié)合表示所述樣品中存在沙門氏菌，且與選自SEQ ID NO: 23-26的至少一個探針的結(jié)合表示所述樣品中存在大腸桿囷。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述其他的引物對選自下述引物對:SEQID NO:1和4 ；SEQIDN0:1和 6 ；SEQ IDN0:3 和 2 ；SEQ IDN0:3 和 4 ；SEQ IDN0:3 和 6 ；SEQ IDN0:5 和 2 ；SEQ IDNO: 5 和 4 ;以及 SEQ ID NO: 5 和 6。
8.一種用于檢測在檢測樣品中的至少一種病原體的目標核酸的試劑盒，所述試劑盒包括:結(jié)合兩種或更多種不同病原體的保守區(qū)的至少第一和第二引物對；其中所述第一和第二引物對為分別對應(yīng)于革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌的SEQ ID NO: 1-2，和對應(yīng)于腸道病毒的SEQ ID NO: 7-8 ； 寡核苷酸微陣列，所述微陣列包括含與兩種或更多種不同病原體互補的多核苷酸序列的兩種或以上的探針或兩個或以上的探針組，其中所述探針包括選自以下的多核苷酸序列:SEQ ID NO: 13-21，其對應(yīng)于鏈球菌、沙門氏菌、葡萄球菌、支原體、單核細胞增生李斯特氏菌、腦膜炎奈瑟氏菌，和SEQ ID NO:23-52，其對應(yīng)于大腸桿菌、流感嗜血桿菌、布氏疏螺旋體、鉤端螺旋 體、變形菌、厭氧菌、結(jié)核分支桿菌、腸球菌、脊髓灰質(zhì)炎病毒1、腸道病毒71、腸道病毒70、艾柯病毒2、艾柯病毒4、艾柯病毒6、艾柯病毒9、艾柯病毒11、艾柯病毒12、艾柯病毒26、柯薩奇病毒A13、柯薩奇病毒A15、柯薩奇病毒A18、柯薩奇病毒A20、柯薩奇病毒A21、柯薩奇病毒B3-A、柯薩奇病毒B3-C、HSV-1和HSV-2 ;和其中所述探針固定化在固相支持體上。
【文檔編號】C12Q1/14GK104017909SQ201410309119
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2006年12月29日 優(yōu)先權(quán)日:2005年12月30日
【發(fā)明者】Y.古, L.徐 申請人:霍尼韋爾國際公司