檢測脂蛋白相關(guān)磷脂酶a2的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫試劑盒及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了檢測脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫試劑盒及其制備方法。本發(fā)明所提供的檢測脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫試劑盒，包括包被有抗脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2單克隆抗體的化學(xué)發(fā)光板，其特征在于：還包括樣品處理液；所述樣品處理液主要由A液和B液組成；所述A液含有7.5g/L氯化銨、1.2g/L酪蛋白和1.2g/L硬脂酸鈉；所述B液含有0.5M?Tris-Hcl，PH7.6。為最大限度減低Lp-PLA2發(fā)光檢測噪音，本發(fā)明的試劑盒中還包括獨特的血液樣品處理劑配方，有助于淬滅非特異性光源，大大增強檢測光與本底雜光的差別，增加檢測特異性。
【專利說明】檢測脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫試劑盒及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫技術(shù)檢測領(lǐng)域，尤其涉及檢測脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫試劑盒及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2 (Lp-PLA2)是磷酸脂酶A2超家族中的非鈣離子依賴型磷酸脂酶，最初發(fā)現(xiàn)其可以降解血小板活化因子，曾被稱為血小板活化因子乙酰水解酶。1995年首次被克隆，其編碼基因(PLA2G7)，有12個外顯子，染色體定位于6p21.2212，由441個氨基酸殘基組成的一種絲氨酸脂酶，相對分子質(zhì)量為50X 103(50kDa)。Lp_PLA2以生物膜磷脂為天然底物優(yōu)先作用于氧化磷脂sn22位上短脂酰鏈中的酯鍵，使水溶性強的磷脂產(chǎn)生游離脂肪酸和溶血磷脂參與磷脂的代謝。
[0003]循環(huán)中Lp-PLA2主要來源于血細胞，如單核細胞、巨噬細胞、T淋巴細胞和肥大細胞受炎癥刺激時少量分泌，并受炎性介質(zhì)的調(diào)節(jié)，如、2干擾素和脂多糖抑制其分泌，血小板活化因子促進其分泌。聯(lián)合應(yīng)用原位雜交和免疫組織化學(xué)技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，兔和人動脈粥樣硬化斑塊中的巨噬細胞可表達更高水平的Lp-PLA2mRNA和蛋白。人血漿中的Lp_PLA2與脂蛋白顆粒結(jié)合的形式存在，其中2/3與低密度脂蛋白(low density lipop rotein, LDL)結(jié)合，主要是小而密的LDL結(jié)合，其中帶負電荷的LDL中的Lp-PLA2含量和活性更高，促進內(nèi)皮細胞趨化因子釋放，促進炎癥反應(yīng)。1/3與高密度脂蛋白(high density lipoprotein, HDL)和極低密度脂蛋白(very low density lipop rotein, VLDL)結(jié)合。Lp-PLA2與人類HDL結(jié)合少的原因，可能是由于人Lp-PLA2氨基端的高度糖基化阻礙了其與HDL的結(jié)合 ?
[0004]目前實驗研究及流行病學(xué)研究結(jié)果揭示了Lp-PLA2生成多種促炎產(chǎn)物，參與從動脈粥樣斑塊形成到斑塊不穩(wěn)定的各個階段，具有促進炎癥反應(yīng)作用，可能成為新的心腦事件獨立預(yù)測因子。血漿Lp-PLA2測量是一個有價值的方法，可用來鑒別或預(yù)測具有心腦血管疾病高風(fēng)險事件的個體。
[0005]目前為止，沒有見到利用Lp-PLA2與心腦血管疾病之間的相關(guān)關(guān)系來制備檢測人Lp-PLA2的水平的試劑盒的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明根據(jù)上述領(lǐng)域存在的空白和需求，提供了檢測脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫試劑盒及其制備方法。
[0007]本發(fā)明的一個目的是提供檢測脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫試劑盒。
[0008]本發(fā)明所提供的檢測脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫試劑盒，包括包被有抗脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2單克隆抗體的化學(xué)發(fā)光板，還包括樣品處理液；所述樣品處理液主要由A液和B液組成；所述A液含有7.5g/L氯化銨、1.2g/L酪蛋白和1.2g/L硬脂酸鈉；所述 B 液含有 0.5M Tris-Hcl, PH7.6。
[0009]所述試劑盒還包括樣品稀釋液；所述樣品稀釋液由如下方法制備得到:將100ml山羊血清、20ml重量百分比濃度為1%的硫柳汞、10ml0.1M鐵氰化鉀、0.5ml吐溫-20、10mll0mg/ml的慶大霉素、以及余量為PH7.40.01M PBS緩沖液定容至1000ml，即得到所述
樣品稀釋液。
[0010]所述試劑盒還包括濃縮洗滌液；所述濃縮洗滌液由如下方法制備得到:將
2.96gNaH2P04.2H20、29g Na2HP04.12H20、234g NaCl 和 20ml 吐溫-20，加雙蒸水定容至1000ml，即得到濃縮洗滌液。
[0011]所述試劑盒還包括化學(xué)發(fā)光底物液；所述化學(xué)發(fā)光底物液由化學(xué)發(fā)光底物液R1和化學(xué)發(fā)光底物液R2組成；所述化學(xué)發(fā)光底物液R1為3.0mmol/L魯米諾與0.3mmol/L對碘苯酚的混合液；化學(xué)發(fā)光底物液R2為7.5mmol/L的雙氧水。
[0012]所述試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)品溶液；所述標(biāo)準(zhǔn)品溶液為6個濃度梯度的脂蛋白相關(guān)磷脂酶 A2 抗原，所述濃度依次為:0ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、250ng/ml、500ng/ml 和 lOOOng/ml ο
[0013]所述試劑盒還包括高值對照液和低值對照液；所述高值對照液或低值對照液由向胎牛血清中添加重組脂蛋白相關(guān)磷脂酶Α2制備得到；所述高值對照的終濃度為700ng/ml ；所述低值對照的終濃度為300ng/ml。
[0014]本發(fā)明的另一個目的是提供所述檢測脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫試劑盒的制備方法。
[0015]本發(fā)明所提供的所述檢測脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫試劑盒的制備方法，包括如下步驟:
[0016](1)制備抗體包被液:0.36g NaH2P04.Η20，3.10g Na2HP04.2Η20，定容至 lL，pH7.6 ；
[0017](2)包被；
[0018](3)封閉；
[0019]其特征在于:還包括制備樣品處理液的步驟:將7.5g氯化銨、1.2g酪蛋白和1.2g硬脂酸鈉，加入純化水定容1L，即得到A液；PH7.6,0.5M Tris-HCl溶液為B液；將所述A液和B液分別獨立包裝，即得到所述樣品處理液。
[0020]所述包被的條件為2_8°C、18-24小時。
[0021]所述封閉的條件為4°C封閉12小時。
[0022]所述封閉采用的封閉液由如下方法制備得到:向PH值為7.0-7.5、濃度為10mM的Tris緩沖液中加入質(zhì)量百分比終濃度2%的蘇氨酸、質(zhì)量百分比終濃度1%的蔗糖、質(zhì)量百分比終濃度0.5%的β -巰基乙醇。
[0023]本發(fā)明采用抗Lp-PLA2單克隆抗體包被空白化學(xué)發(fā)光板，得到檢測Lp_PLA2的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫試劑盒的核心部件化學(xué)發(fā)光板。使用時，可按照常規(guī)化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測的方法配置其它所需試劑與所述化學(xué)發(fā)光板配合使用。本發(fā)明優(yōu)選提供試劑盒盒內(nèi)還放置有其它盛裝著化學(xué)發(fā)光酶鏈免疫反應(yīng)所需試劑的部分或全部試劑瓶的試劑盒方案，便于檢測反應(yīng)。該試劑盒可用于鑒別或預(yù)測具有心腦血管疾病高風(fēng)險事件的個體。從實施例可以看出，本發(fā)明試劑盒對于Lp-PLA2的最低檢測限可低至0.1ng/mL。[0024]為最大限度減低Lp-PLA2發(fā)光檢測噪音，本發(fā)明的試劑盒中還包括獨特的血液樣品處理劑配方，有助于淬滅非特異性光源，大大增強檢測光與本底雜光的差別，增加檢測特異性。
【具體實施方式】
[0025]本發(fā)明的檢測脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫試劑盒包括:
[0026]化學(xué)發(fā)光板(包被有抗脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2單克隆抗體的96微孔或48微孔的化學(xué)發(fā)光板)、樣品處理液(A液+B液)、其它盛裝著化學(xué)發(fā)光酶鏈免疫反應(yīng)所需試劑的試劑瓶——(抗Lp-PLA2酶結(jié)合物、標(biāo)準(zhǔn)品6瓶、Lp-PLA2高值對照、Lp-PLA2低值對照、樣品稀釋液、化學(xué)發(fā)光底物液R1、化學(xué)發(fā)光底物液R2、洗滌液(20x濃縮)各1瓶)、說明書一份，不干膠紙片2張。
[0027]抗脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2單克隆抗體(Lp-PLA2單克隆抗體)購自天津勝發(fā)生物技術(shù)有限公司。
[0028]實施例1、檢測脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫試劑盒制備及其檢測方法
[0029]一、制備檢測脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫試劑盒
[0030]1、樣本處理液的配制
[0031]樣品處理液配方:由A液和B液組成，其中A液為7.5g氯化銨，1.2g酪蛋白，1.2g硬脂酸鈉，加入純化水定容1L，即A液中含有7.5g/L氯化銨、1.2g/L酪蛋白和1.2g/L硬脂酸鈉液為 0.5M Tris-HCl 溶液(PH7.6)。
[0032]2、包被抗Lp-PLA2單克隆抗體為化學(xué)發(fā)光反應(yīng)板
[0033]以下抗體包被液的配方為:
[0034]0.36g NaH2P04.H20, 3.10g Na2HP04.2H20,定容至 1L, pH7.6。
[0035]酶標(biāo)板選乳白色不透明聚苯乙烯96孔化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)板(英國Porvair,96孔板)。
[0036]抗體檢測板的最佳制備條件為，使用包被單克隆抗體以最佳包被抗體濃度進行包被，用50mM pH值為7.6的磷酸鹽緩沖液配制成包被濃度為2 μ g/ml的Lp_PLA2單抗包被液，并將包被液負載于微孔板(100 μ 1/孔)，2-8°C包被18-24小時。
[0037]加入封閉液，300 μ 1/孔，4°C封閉12小時，隨后棄去封閉液拍干，室溫干燥4小時。干燥后的化學(xué)發(fā)光板，迅速真空封口包裝，將封裝好的板存于2-8°C。所述封閉采用的封閉液配方為:pH值為7.0-7.5，濃度為10mM的Tris緩沖液中加入質(zhì)量百分比終濃度2%的蘇氨酸、質(zhì)量百分比終濃度1%的蔗糖、質(zhì)量百分比終濃度0.5%的β -巰基乙醇。
[0038]3、標(biāo)準(zhǔn)品的制備:將重組全長Lp_PLA2抗原(美國abnova公司)用蛋白穩(wěn)定劑(北京科躍中楷生物技術(shù)有限公司)稀釋成6個梯度濃度，分別是:0ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、250ng/ml、500ng/ml 和 1000ng/ml。
[0039]4、樣品稀釋液、濃縮洗滌液的配制:
[0040]A、樣品稀釋液
[0041]山羊血清100ml (Biotopped, 100ml/瓶)
[0042]1%(重量比)硫柳汞 20ml (EYSIN，lkg)
[0043]0.1M 鐵氰化鉀 10ml (acros, 100g/ 瓶)[0044]吐溫-200.5ml (amres, 500ml/ 瓶)
[0045]lOmg/ml 慶大霉素 10ml (sigma, 500mg/ 瓶)
[0046]加0.01M PBS (PH7.4)定容至 1000ml，過濾除菌，4°C保存。
[0047]B、洗滌液(20倍濃縮)
[0048]NaH2P04.2Η202.96g (北京化學(xué)試劑公司，500g/ 瓶)
[0049]Na2HP04.12H2029g (北京化學(xué)試劑公司，500g/ 瓶)
[0050]NaC1234g (北京化學(xué)試劑公司，500g/瓶)
[0051]吐溫-2020ml(amres, 500ml/瓶)
[0052]加雙蒸水定容至1000ml，過濾除菌，4°C保存。
[0053]5、化學(xué)發(fā)光底物的制備
[0054]化學(xué)發(fā)光體系由發(fā)光劑(魯米諾，sigma)、增強劑(對碘苯酹,duly)及雙氧水(上海實驗試劑有限公司)構(gòu)成?；瘜W(xué)發(fā)光底物液由化學(xué)發(fā)光底物液R1和化學(xué)發(fā)光底物液R2組成。
[0055]化學(xué)發(fā)光底物液R1為3.0mmol/L魯米諾與0.3mmol/L對碘苯酹的混合液,化學(xué)發(fā)光底物液R2為7.5mmol/L的雙氧水。
[0056]6、高值對照和低值對照的制備
[0057]胎牛血清(gibco, 500ml/瓶)中添加一定量的重組Lp_PLA2抗原蛋白(美國abnova公司)，高值對照的終濃度為700ng/ml,低值對照的終濃度為300ng/ml,過濾除菌。
[0058]二、試劑盒的應(yīng)用及測操作程序
[0059](1)平衡:從冷藏環(huán)境中取出試劑及樣品，置于室溫(18_25°C )平衡約30分鐘。
[0060](2)樣品處理:將樣品處理液中的A液和B液混合，然后取充分混勻的待檢全血樣本25 μ 1加入200 μ 1樣品處理液中，震蕩混勻。
[0061](3)配液:將濃縮洗滌液用蒸餾水作20倍稀釋成工作濃度洗滌液，如產(chǎn)生結(jié)晶，應(yīng)待其于室溫溶解后再稀釋。
[0062](4)加樣:取96孔化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)板，預(yù)設(shè)置空白、低值對照、高值對照各3孔。每孔中先加入50 μ 1樣品稀釋液(空白對照每孔加入100 μ 1樣品稀釋液)；然后低、高值對照孔加入50μ 1低、高值對照，其余孔按設(shè)定各加入50μ 1待測樣品；加樣完畢后用不干膠封片封蓋反應(yīng)板，37°C振蕩孵育60分鐘。
[0063](5)洗板:甩去板孔中的液體，在吸水紙上拍干；用工作濃度洗滌液洗板6次，最后拍干。
[0064](6)加酶結(jié)合物:每孔加入100 μ 1酶結(jié)合物(辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗人Lp-PLA2抗體)，用不干膠封片封蓋反應(yīng)板,37°C孵育30分鐘。
[0065](7)洗板:同(5)。
[0066](8)加底物:每孔先后加入化學(xué)發(fā)光底物液R1、化學(xué)發(fā)光底物液R2各50 μ 1，避光顯色至少2分鐘。
[0067](9)測定:加發(fā)光底物液后2?30分鐘在化學(xué)發(fā)光儀上讀出各孔相對發(fā)光度(RLU)。用所獲得的每個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的發(fā)光強度平均值(Β)除以第一個標(biāo)準(zhǔn)溶液(0標(biāo)準(zhǔn))的發(fā)光強度值(Β0)再乘以100%，即百分發(fā)光值。計算公式為:百分發(fā)光值(%) = (Β/Β0)X100%。[0068](10)以Lp-PLA2標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度(ng/mL)的半對數(shù)值為x軸，百分發(fā)光值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。用同樣的辦法計算樣品溶液的百分發(fā)光值，相對應(yīng)每一個樣品的濃度則可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本中Lp-PLA2的含量。本發(fā)明中檢測結(jié)果的分析也可以采用回歸方程法，計算出樣品溶液濃度。本發(fā)明中檢測結(jié)果的分析還可以利用計算機專業(yè)軟件，此法更便于大量樣品的快速分析。
[0069]實施例2、含有樣品處理液的試劑盒與不含有樣品處理液的試劑盒比較
[0070]實驗組:樣品經(jīng)本發(fā)明樣品處理液處理
[0071]對照組:樣品未經(jīng)處理。
[0072]以上述實驗組和對照組進行對比試驗。對正常對照樣本100例，患心腦血管疾病樣本100例采用實驗組和對照組進行平行檢測，檢測方法參見上述實施例1，檢測程序和結(jié)果判斷嚴格按照各試劑說明書進行。檢測結(jié)果如表1、表2和表3所示:
[0073]表1對照組試劑盒測定結(jié)果
[0074]
【權(quán)利要求】
1.一種檢測脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫試劑盒，包括包被有抗脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2單克隆抗體的化學(xué)發(fā)光板，其特征在于:還包括樣品處理液；所述樣品處理液主要由A液和B液組成；所述A液含有7.5g/L氯化銨、1.2g/L酪蛋白和1.2g/L硬脂酸鈉；所述 B 液含有 0.5M Tris-Hcl, PH7.6。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于:所述試劑盒還包括樣品稀釋液；所述樣品稀釋液由如下方法制備得到:將100ml山羊血清、20ml重量百分比濃度為1%的硫柳汞、10ml0.1M鐵氰化鉀、0.5ml吐溫-20、10mll0mg/ml的慶大霉素、以及余量為PH7.40.01M PBS緩沖液定容至1000ml，即得到所述樣品稀釋液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于:所述試劑盒還包括濃縮洗滌液；所述濃縮洗滌液由如下方法制備得到:將2.96gNaH2P04.2H20、29g Na2HP04.12H20、234g NaCl 和 20ml 吐溫-20，加雙蒸水定容至1000ml，即得到濃縮洗滌液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于:所述試劑盒還包括化學(xué)發(fā)光底物液；所述化學(xué)發(fā)光底物液由化學(xué)發(fā)光底物液R1和化學(xué)發(fā)光底物液R2組成；所述化學(xué)發(fā)光底物液R1為3.0mmol/L魯米諾與0.3mmol/L對碘苯酚的混合液；化學(xué)發(fā)光底物液R2為7.5mmol/L的雙氧水。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于:所述試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)品溶液；所述標(biāo)準(zhǔn)品溶液為6個濃度梯度的脂蛋白相關(guān)磷脂酶 A2 抗原，所述濃度依次為:0ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、250ng/ml、500ng/ml 和 1000ng/ml ο
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測脂蛋白相關(guān)磷脂酶Α2的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于:所述試劑盒還包括高值對照液和低值對照液；所述高值對照液或低值對照液由向胎牛血清中添加重組脂蛋白相關(guān)磷脂酶Α2制備得到；所述高值對照的終濃度為700ng/ml ；所述低值對照的終濃度為300ng/ml。
7.權(quán)利要求1-6中任一所述檢測脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫試劑盒的制備方法，包括如下步驟:(1)制備抗體包被液:0.36g NaH2P04.Η20，3.10g Na2HP04.2H20，定容至 1L，pH7.6 ；(2)包被；(3)封閉；其特征在于:還包括制備樣品處理液的步驟:將7.5g氯化銨、1.2g酪蛋白和1.2g硬脂酸鈉，加入純化水定容1L，即得到A液；PH7.6、0.5M Tris-HCl溶液為B液；將所述A液和B液分別獨立包裝，即得到所述樣品處理液。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于:所述包被的條件為2-8°C、18-24小時。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于:所述封閉的條件為4°C封閉12小時。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于:所述封閉采用的封閉液由如下方法制備得到:向PH值為7.0-7.5、濃度為10mM的Tris緩沖液中加入質(zhì)量百分比終濃度2%的蘇氨酸、質(zhì)量百分比終濃度1%的蔗糖、質(zhì)量百分比終濃度0.5%的β -巰基乙醇。
【文檔編號】G01N33/531GK103645326SQ201310683802
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月13日
【發(fā)明者】吳凡, 焦守恕 申請人:同昕生物技術(shù)（北京）有限公司