專利名稱：一株芽孢桿菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于微生物技術領域，特別涉及一株芽孢桿菌及其應用。
背景技術：
水體富營養(yǎng)化已成為困擾世界各國的普遍性環(huán)境問題。浮游藻類的大量繁殖導致水華的頻繁爆發(fā)，嚴重影響了人類的生活、生產(chǎn)和身體健康，造成了世界范圍內(nèi)的生態(tài)災害，因此，探索控制水華發(fā)生的有效途徑已迫在眉睫。目前，治理水體富營養(yǎng)化主要是采用物理和化學方法，但這兩種方法不僅會消耗大量的財力和物力，而且會在一定程度上破壞生態(tài)環(huán)境。溶藻菌作為水華和赤潮的防治生物，日益受到國內(nèi)外環(huán)境工作者的廣泛關注。國外對溶藻菌的研究已有數(shù)十年的歷史，自Geitler報道一種寄生在剛毛藻上的粘細菌以來，陸續(xù)有溶藻菌的相關報道，研究重點也逐漸從單一溶藻菌的篩選及溶藻特性研究過渡到菌一藻種群生態(tài)學及分子調(diào)控機理等方面。目前，國內(nèi)對溶藻細菌的研究還處于初始·階段，因此，尋找高效溶藻菌對溶藻菌的深入研究及應用具有重要意義。水華魚腥藻是導致水體富營養(yǎng)化的主要藻種之一，其分布廣，能夠產(chǎn)生藻毒素，直接和間接危害人類，然截止目前，利用微生物方式控制水華魚腥藻的研究甚是罕見。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一株芽孢桿菌，它可以影響水華魚腥藻的生長效應和光合色素，從而起到溶藻作用。本發(fā)明所提供的是芽孢桿菌(Bacillus) SSAL-1，保藏號為CGMCC No. 6194。本發(fā)明從農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)(南方)重點實驗室黃化的水華魚腥藻液中分離篩選并獲得一株對水華魚腥藻具有良好溶藻效應的細菌，經(jīng)鑒定為芽孢桿菌，命名為SSAL-I，分類命名為芽孢桿菌(Bacillus)。本發(fā)明芽孢桿菌SSAL-I具有以下微生物學特性該菌株為革蘭氏陽性芽孢桿菌，桿狀，芽孢為橢圓形，大多中央生菌落呈近白色。本發(fā)明的芽孢桿菌SSAL-I能夠有效地降解水華魚腥藻，對水體富營養(yǎng)化的控制提供了科學依據(jù)，為微生物治理水華的研究提供了重要基礎。在一定條件下，芽孢桿菌SSAL-I對水華魚腥藻的降解效果隨菌株濃度的增大而增加，當芽孢桿菌SSAL-I的濃度為35%時，對水華魚腥藻葉綠素a的抑制率可高達96%。保藏信息本發(fā)明的芽孢桿菌(Bacillus) SSAL-I保存在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCOJia :北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏日期2012年6月6日，保藏編號CGMCC No. 6194。


圖I為芽孢桿菌SSAL-I在1000X下的染色顯微圖2為芽孢桿菌SSAL-I對水華魚腥藻細胞數(shù)的影響示意圖；圖3為芽孢桿菌SSAL-I對水華魚腥藻干重的影響示意圖；圖4為芽孢桿菌SSAL-I對水華魚腥藻色素吸收光譜的影響示意圖；圖5為芽孢桿菌SSAL-I對水華魚腥藻葉綠素a的影響示意圖。
具體實施例方式以下舉例說明本發(fā)明，但是并不用于限定本發(fā)明的保護范圍。實施例I芽孢桿菌SSAL-I的分離、純化及其鑒定I)、芽孢桿菌SSAL-I的分離及純化
以農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)(南方)重點實驗室黃化的水華魚腥藻液作為溶藻細菌的分離源，采用涂布平板法及分區(qū)劃線法多次純化分離，將分離獲得的25株細菌分別置于IOOmLLB液體培養(yǎng)基中，于180r · mirT1，37°C下培養(yǎng)24h，然后分別取800 μ L滴加到水華魚腥藻固體平板上，通過溶藻斑的大小考察、比較各菌的溶藻效果，最終篩選出具高溶藻效應的菌株SSAL-1，其在顯微鏡下的結構如圖I所示。經(jīng)鑒定為芽孢桿菌，命名為SSAL-I，分類命名為芽孢桿菌(Bacillus)。將其接入斜面培養(yǎng)基，于冰箱4°C保存；將擴大培養(yǎng)制成的菌懸液加入到滅菌的甘油中，甘油的最終濃度為25%，放入_80°C的冰箱保藏。其中，上述的LB液體培養(yǎng)基組分及配比為酵母提取物，5g ;胰蛋白胨，IOg ；NaCl,IOg ;蒸餾水IOOOmL ；LB液體培養(yǎng)基的pH值為7. 0-7. 2。上述的水華魚腥藻固體培養(yǎng)基組分及配比為磷酸氫二鉀(K2HPO4)，O. 075g ;硫酸鎂(MgSO4 · H2O), O. 125g ;碳酸鈣(CaCO3)，
O.IOOg ;檸檬酸鐵(1%水溶液)，0· 5mL ;檸檬酸(1%水溶液)，0· 5mL ;鑰酸(1%水溶液)，5滴；氫氧化鈉(1%水溶液)，I. 5mL ;瓊脂粉，15g ;蒸餾水，1000mL。2)、芽孢桿菌SSAL-I的生理生化鑒定經(jīng)鑒定可知該菌株為革蘭氏陽性芽孢桿菌，桿狀，芽孢為橢圓形，大多中央生菌落呈近白色。使用弓 I 物 7f(5，-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3，)和1540r (5’ -AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’)構筑得到SSAL-I菌株的DNA序列，該序列具有序列表中序列I的核苷酸序列。經(jīng)序列比對表明，經(jīng)鑒定為芽孢桿菌，命名為SSAL-I，分類命名為芽孢桿菌(Bacillus)。該芽孢桿菌SSAL-I已于2012年6月6日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱06110，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號)，保存號為 CGMCCNo. 6194。實施例2芽孢桿菌SSAL-I對水華魚腥藻生長效應和光合色素的影響I)、芽孢桿菌SSAL-I對水華魚腥藻生長效應的影響水華魚腥藻培養(yǎng)參照藻類生長抑制實驗的標準方法(國家環(huán)保部)，采用水生111號無氮培養(yǎng)液培養(yǎng)，pH為7. 5。培養(yǎng)溫度30±2°C，連續(xù)24h光照，光照強度3000±2001x，
靜置培養(yǎng)，每天定期搖動3次。在水華魚腥藻濃度為5X10^1 X IO5個/mL時，分別向IOOmL藻液中加入芽孢桿菌SSAL-I (菌體濃度約為IO9個/mL)，處理濃度(v/v)梯度為5%、10%、15%、20%、25%、30%和35%，每組樣設3個重復。制備與實驗組相同的一系列不同配比的培養(yǎng)液(LB培養(yǎng)液水生111號無氮培養(yǎng)液)，分別用于培養(yǎng)溶藻菌和水華魚腥藻形成對照組。以細胞計數(shù)法測定藻體細胞數(shù)量、并測定水華魚腥藻干重。細胞計數(shù)方法從接種計時起，每隔24h取樣，用計數(shù)框進行細胞計數(shù)。用移液器取經(jīng)過超聲波破碎儀打碎過的藻液0. ImL于計數(shù)框中，在低倍鏡下觀察，放大倍數(shù)40X10，隨機取五個視野，數(shù)出所看到的細胞數(shù)，取其平均值。N=IOXaXSif/Sft ；a —每個視野內(nèi)細胞平均值；Sif —計數(shù)框面積；Sft —視野面積；N —每mL中細胞個數(shù)。水華魚腥藻干重測定方法取定量的藻液，離心得藻，加入稱量皿，在80°C烘至恒重。不同濃度的芽孢桿菌SSAL-I對水華魚腥藻的細胞數(shù)的影響的測定結果如圖2所示，結果表明水華魚腥藻細胞的去除效果與芽孢桿菌SSAL-I的濃度呈現(xiàn)出一定的濃度一相關性，即隨著芽孢桿菌SSAL-I濃度的增長，對水華魚腥藻細胞的去除作用越強。當芽孢桿菌SSAL-I菌體濃度為5%、10%、15%、20%、2 5%、30%和35%時，培養(yǎng)24h對水華魚腥藻細胞的去除率分別為57%、65%、81%、86%、87%、89%和90%，培養(yǎng)168h后分別變?yōu)?6%、86%、89%、91%、91%、92%和92%，與對照相比，呈現(xiàn)顯著差異(P〈0. 05)。不同濃度的芽孢桿菌SSAL-I對水華魚腥藻的干重的影響的測定結果如圖3所示，結果表明純LB液體培養(yǎng)基的投入對水華魚腥藻干重亦會產(chǎn)生影響，當LB液體培養(yǎng)基濃度依次為5%、10%、15%、20%、25%、30%和35%時，培養(yǎng)24h后的水華魚腥藻干重相應增加，分別為 7. 25,9. 09、10. 69、11. 16、12. 53、13. 38 和 13. 84mg/mL,而投加不同濃度(5% 35%)的芽孢桿菌SSAL-I后，分別為2. 97,3. 27,2. 24、I. 79、I. 34和I. 52mg/mL。通過排除LB液體培養(yǎng)基本身對水華魚腥藻生長的影響因素，可見，隨著菌體濃度從5%依次升至35%，芽孢桿菌SSAL-I對水華魚腥藻干重的抑制率依次為59%、64%、79%、84%、86%、90%和89%。2)、芽孢桿菌SSAL-I對水華魚腥藻光合色素的影響以Bhandari and Sharma法連續(xù)掃描400 750nm波長范圍內(nèi)色素吸收光譜，并對水華魚腥藻葉綠素a含量進行測定。葉綠素a的提取測定取水華魚腥藻藻液IOmL過0. 45 的混合纖維素膜，將帶藻細胞的膜冷凍過夜，取出后迅速用SmL熱乙醇于熱水浴中萃取2min，將萃取液超聲破碎5-20min后，于暗處靜置2_6h，離心(5000r/min，4°C ) 5min后取上清液3. 5mL置于比色皿中，于665nm和750nm處測吸光值，計算酸化前的光密度值(E665b=Abs665b-Abs750b),然后滴加 200 u L 的 lmol/L 鹽酸酸化，5min 后于波長 665nm 和 750nm處再測吸光值，計算酸化后的光密度值(E665a = Abs665a-Abs75tlaX采用熱乙醇為萃取溶劑，A=Il. 5，K=2. 43，比色皿光程為Icm
2 7.9 X ( E s6 — Em,> ) X V Ii I.綠桌 a (pg/mL) =-其中，V表示提取液體積(mL)，V表示樣品的體積(L)。不同濃度的芽孢桿菌SSAL-I對水華魚腥藻色素吸收光譜的影響的測定結果如圖4所示，結果表明不同濃度的芽孢桿菌SSAL-I作用于水華魚腥藻時，其色素光譜吸收曲線變化表現(xiàn)出一致性。在59^35%濃度芽孢桿菌SSAL-I菌株處理下，各光譜吸收曲線已非常不明顯，各處峰值模糊甚微，表明芽孢桿菌SSAL-I大大地抑制了藻體色素的種類和含量。葉綠素a是光能的捕獲者，也是葉綠體膜內(nèi)光傳導者，因此葉綠素a含量的多少，充分反映出藻體光合成能力的強弱。不同濃度的芽孢桿菌SSAL-I對水華魚腥藻葉綠素a的影響的測定結果如圖5所示(A、B、C、D、E、F、G、H分別代表溶藻菌濃度為0%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%)，結果表明芽孢桿菌SSAL-I對葉綠素a的抑制作用隨著菌體濃度的增加而增強。菌體濃度為5%、10%、15%、20%、25%、30%和35%，對芽孢桿菌SSAL-I而言，24h對葉綠素a的抑制率分別為61%、68%、82%、88%、89%、90%和91%，168h后依次升至92%、94%、94%、94%、94%、95% 和 96%。本發(fā)明的芽孢桿菌SSAL-I能夠有效地降解水華魚腥藻，對水體富營養(yǎng)化的控制提供了科學依據(jù)，為微生物治理水華的研究提供了重要基礎。在一定條件下，芽孢桿菌SSAL-I對水華魚腥藻的降解效果隨菌株濃度的增大而增加，當芽孢桿菌SSAL-I的濃度為35%時，對水華魚腥藻葉綠素a的抑制率可高達96%。
以上公開的僅為本申請的幾個具體實施例，但本申請并非局限于此，任何本領域的技術人員能思之的變化，都應落在本申請的保護范圍內(nèi)。序列表〈110〉上海交通大學〈120〉一株芽孢桿菌及其應用<160>1<170>PatentIn version3. 5<210>1<211>1572<212>DNA〈213〉芽孢桿菌(Bacillus) SSAL-I〈400〉Icagagtttga tcctggctga tcctggctca gagtttgatc ctggctcagg atgaacgctg 60gcggcgtgcc taatacatgc aagtcgagcg aatggattaa gagcttgctc ttatgaagtt 120agcggcggac gggtgagtaa cacgtgggta acctgcccat aagactggga taactccggg 180aaaccggggc taataccgga taacattttg aaccgcatgg ttcgaaattg aaaggcggct 240tcggctgtca cttatggatg gacccgcgtc gcattagcta gttggtgagg taacggctca 300ccaaggcaac gatgcgtagc cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg actgagacac 360ggcccagact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac 420ggagcaacgc cgcgtgagtg atgaaggctt tcgggtcgta aaactctgtt gttagggaag 480aacaagtgct agttgaataa gctggcacct tgacggtacc taaccagaaa gccacggcta 540actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc gttatccgga attattgggc 600gtaaagcgcg cgcaggtggt ttcttaagtc tgatgtgaaa gcccacggct caaccgtgga 660gggtcattgg aaactgggag acttgagtgc agaagaggaa agtggaattc catgtgtagc 720ggtgaaatgc gtagagatat ggaggaacac cagtggcgaa ggcgactttc tggtctgtaa 780ctgacactga ggcgcgaaag cgtggggagc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg 840ccgtaaacga tgagtgctaa gtgttagagg gtttccgccc tttagtgctg aagttaacgc 900attaagcact ccgcctgggg agtacggccg caaggctgaa actcaaagga attgacgggg 960gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagca acgcgaggaa ccttaccagg 1020tcttgacatc ctctgacaac cctagagata gggcttctcc ttcgggagca gagtgacagg 1080tggtgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg 1140
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aggtgggaca gatgattggg gtgaagtcgt aacaaggtagccgtatcgga aggtgcggct1560ggatcacctc ct157權利要求
1.一株芽孢桿菌(及 &77心)SSAL-I，保藏號為CGMCC No. 6194。
2.權利要求I所述的芽孢桿菌SSAL-I在降解水華魚腥藻中的應用。
全文摘要
本發(fā)明屬于微生物技術領域，特別涉及一株芽孢桿菌及其應用。本發(fā)明提供一株芽孢桿菌(Bacillus)SSAL-1，保藏號為CGMCC No.6194。本發(fā)明的芽孢桿菌SSAL-1能夠有效地降解水華魚腥藻，在一定條件下，芽孢桿菌SSAL-1對水華魚腥藻的降解效果隨菌株濃度的增大而增加，當芽孢桿菌SSAL-1的濃度為35%時，對水華魚腥藻葉綠素a的抑制率可高達96%。
文檔編號C12R1/07GK102816718SQ20121028095
公開日2012年12月12日 申請日期2012年8月8日 優(yōu)先權日2012年8月8日
發(fā)明者沈健英, 孫秀敏 申請人:上海交通大學