專利名稱：一種篩選修復(fù)腦神經(jīng)元退化藥物的果蠅疾病模型及其構(gòu)建方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種篩選藥物的模型及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，特別涉及一種篩選修復(fù)腦神經(jīng)元退化藥物的果蠅疾病模型及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
神經(jīng)退行性腦疾病是以腦中樞系統(tǒng)發(fā)生退化性改變?yōu)榛A(chǔ)的重大腦疾病。隨著社會人口老齡化的發(fā)展，已成為影響人類健康的重要疾病之一。老年癡呆癥(Alzheimer’sdisease，AD)是一種神經(jīng)元退化的疾病。癥狀是隨著年齡的增長，患者失去學(xué)習(xí)和記憶的能力，因而失去生活自理能力。這種神經(jīng)性功能失調(diào)可以是先天遺傳的，也可以是后天誘發(fā)的。到目前為止，沒有任何理想的有效藥物問世。由于發(fā)病率高，在美國及其它發(fā)達(dá)國家用于照顧老年癡呆病患者的醫(yī)療費(fèi)用是最大的一筆醫(yī)藥保健開銷。同樣，對已進(jìn)入或即將進(jìn)入老年社會的國家也將是一個嚴(yán)重的社會和經(jīng)濟(jì)問題。
AD的一個突出特征是老年斑。老年斑(senile plagues，SP)是變性的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞外病灶。在每平方厘米的細(xì)胞組織中有接近四百萬老年斑，每個老年斑的直徑都在10-20μm之間，合起來占大腦容積的70％。SP的核心是淀粉樣蛋白(Amyloid-β peptide，Aβ42或Aβ40)沉積。Aβ淀粉樣蛋白為40-42的氨基酸殘基組成的序列，由淀粉樣前體蛋白(Amyloid precursor protein，APP)加工生成。加工過程涉及到三個水解酶，即α-水解酶，β-水解酶或γ-水解酶。其中β-水解酶在Aβ多肽結(jié)構(gòu)域的氨基末端切割A(yù)PP，從而生成一個更短的羧基末端片段。α-水解酶通過在Aβ多肽結(jié)構(gòu)域的中部切割生成一個更短的羧基末端片段，從而減少了Aβ多肽的生成量。這兩個羧基末端的片段是γ-水解酶的作用底物，切割前者生成Aβ多肽，切割后者生成P3。在細(xì)胞里面發(fā)生的一系列事件包括新合成的APP從高爾基體經(jīng)過小泡到達(dá)分泌細(xì)胞表面，在細(xì)胞表面α-水解酶切割A(yù)PP生成可溶性的APP，在細(xì)胞表面的成熟的APP也可以以內(nèi)吞形式進(jìn)入內(nèi)涵體和溶酶體，在β-水解酶和γ-水解酶的作用下生成Aβ多肽，很快生成的Aβ多肽就分泌到細(xì)胞外液里，Aβ能夠在突觸前膜和突觸后膜的信號位點(diǎn)調(diào)節(jié)膽堿能神經(jīng)元功能和增加的乙酰膽堿介導(dǎo)的信號識別作用，能夠降低APP的水平，增加sAPP的生成，sAPP具有調(diào)節(jié)NGF(nervous growth factor，NFT)受體對NGF的信號識別等作用。APP可以調(diào)節(jié)APP基因編碼的合成。γ-水解酶可能是由兩個PS基因(presenilin-1和preseilin-2，PS1和PS2)編碼合成的。APP基因突變位點(diǎn)位于或接近于切割A(yù)PP的三種水解酶的識別位點(diǎn)。AD相關(guān)的APP基因突變增加了β-水解酶和γ-水解酶的水解酶活性，前者的活性增加促進(jìn)了Aβ40和Aβ42成比例的增加，后者的活性增加促進(jìn)了Aβ42生成與分泌。這些突變的組織學(xué)效應(yīng)是Aβ42沉積的形成，從而導(dǎo)致老年斑的增加。目前認(rèn)為PS1的作用可能是調(diào)節(jié)γ-水解酶活性，也可能是調(diào)節(jié)膜蛋白(例如APP和Notch受體)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到其他細(xì)胞部位的運(yùn)輸。PS1(和PS2)的突變結(jié)果是增加了γ-水解酶活性或者減少了APP的通過高爾基體運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞表面，從而使APP滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中，同時可能伴隨著APP基因的突變，增加Aβ42的數(shù)量及其沉積。在老年性癡呆病等病理下或衰老條件下出現(xiàn)APP的過表達(dá)，APP加工異常導(dǎo)致Aβ的生成和分泌異常增加，細(xì)胞表面成熟APP的異常增加以及Aβ對乙酰膽堿信號通路的過于干擾等。上述Aβ代謝的生理過程每個環(huán)節(jié)的失調(diào)都可能導(dǎo)致疾病的發(fā)生?，F(xiàn)在我們知道老年性癡呆病，以及其他早發(fā)性的癡呆病與衰老的病理變化相同。對老年性癡呆病的分子機(jī)理以及防治措施的研究不但可以減少AD的患者數(shù)量，在延遲衰老方面也具有應(yīng)用價值，開發(fā)出AD治療藥物和延衰藥物。
到目前為止，諸如AD等神經(jīng)退行性疾病發(fā)生的確切分子機(jī)制仍然不清楚，相應(yīng)的診斷和防治都比較困難。原因之一是人類神經(jīng)退行性疾病的病因十分復(fù)雜；原因之二是因?yàn)閷膊』颊吆图棺祫游锬Ｐ腿缡竽Ｐ偷倪z傳分析較為困難。目前，對AD的研究和藥物研發(fā)策略分別在生化模型、細(xì)胞模型和轉(zhuǎn)基因動物模型上進(jìn)行。用轉(zhuǎn)基因鼠模型，雖然在進(jìn)化地位上與人的親緣關(guān)系較近，但卻存在生命周期長、成本代價昂貴，最致命的缺陷是與年齡相關(guān)的神經(jīng)元退化現(xiàn)象不明顯，因此作為進(jìn)行人腦疾病研究和藥物篩選具有一定的缺陷性。通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)，在生化水平上進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)來找到抑制Aβ蛋白沉積的藥物分子，然而這樣所識別的候選藥物在人體中的可溶性和穩(wěn)定性都存在問題，因此這種在試管中對靶目標(biāo)有作用效果的藥物在臨床上往往是無效的。
果蠅具有遺傳學(xué)和發(fā)育學(xué)的巨大優(yōu)勢，基因背景清晰，生命周期短，每代只需10天左右，因此藥物篩選工作相對其它動物模型而言具有快捷、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)、顯著縮短實(shí)驗(yàn)時間的優(yōu)越性。大量的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，從果蠅，小鼠到人，在進(jìn)化上具有嚴(yán)格的保守性。加之果蠅基因組計(jì)劃的完成也進(jìn)一步推動了果蠅疾病模型的研究進(jìn)展。通過在果蠅基因組中進(jìn)行人類疾病基因的同源檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)287個人類疾病基因中大約178個基因在果蠅中是保守的，約占62％。進(jìn)一步的歸類工作發(fā)現(xiàn)保守基因較多的基因種類為癌基因(65個基因中占47個，約為72％)和神經(jīng)性疾病基因(59個基因占38個，約為64％)。由于與人類疾病基因發(fā)生有關(guān)的疾病基因，尤其是癌基因和神經(jīng)性疾病基因在果蠅基因組中普遍存在保守基因，使我們利用果蠅模型不但可以分析人疾病基因的功能、疾病發(fā)生的細(xì)胞分子機(jī)制，同時利用果蠅生物學(xué)上的優(yōu)勢有利于我們探討人類單基因異常表達(dá)(如超表達(dá))和單基因突變所導(dǎo)致的組織學(xué)病變的細(xì)胞分子機(jī)制。此外，果蠅遺傳操作(如突變或轉(zhuǎn)基因)和轉(zhuǎn)基因表達(dá)(如熱休克或UAS-Gal4系統(tǒng))也相對較為方便。通過將果蠅體內(nèi)的同源基因進(jìn)行突變，或者將人的疾病基因轉(zhuǎn)入到果蠅體內(nèi)，并使其表達(dá)，就可以在果蠅模型上塑造諸如老年癡呆病等神經(jīng)退行性疾病，再現(xiàn)人腦疾病關(guān)鍵的病理特征。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種篩選修復(fù)腦神經(jīng)元退化藥物的果蠅疾病模型。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一種篩選修復(fù)腦神經(jīng)元退化藥物的果蠅模型，該模型的腦區(qū)神經(jīng)元過量表達(dá)人Aβ42淀粉樣蛋白，具有人Aβ42淀粉樣蛋白介導(dǎo)神經(jīng)毒性導(dǎo)致的神經(jīng)元退化。
所述果蠅模型是將雌性elav-Gal4處女蠅與雄性UAS-Aβ42轉(zhuǎn)基因果蠅進(jìn)行雜交得到的子工代果蠅。該果蠅模型的基因型為elav-Gal4/+；UAS-Aβ42/+。所述UAS-Aβ42轉(zhuǎn)基因果蠅是將5’端具有來自酵母上游激活序列(Upstream activatingsequence，UAS)的人Aβ42基因，整合到果蠅染色體基因組中得到的。
本發(fā)明的第二個目的是提供一種構(gòu)建篩選修復(fù)腦神經(jīng)元退化藥物的果蠅疾病模型的方法。
一種構(gòu)建篩選修復(fù)腦神經(jīng)元退化藥物的果蠅疾病模型的方法，是將雌性elav-Gal4的處女蠅與雄性UAS-Aβ42轉(zhuǎn)基因果蠅進(jìn)行雜交，得到的子I代果蠅過量表達(dá)人Aβ42蛋白，為篩選修復(fù)腦神經(jīng)元退化藥物的果蠅疾病模型。
所述UAS-Aβ42轉(zhuǎn)基因果蠅是將5’端具有來自酵母上游激活序列(Upstreamactivating sequence，UAS)的人Aβ42基因，整合到果蠅染色體基因組中得到的。
所述果蠅疾病模型的對照果蠅為elav-Gal4果蠅的處女蠅或雄蠅分別與UAS-Aβ40果蠅的雄蠅或處女蠅雜交后的子I代蠅，其基因型為elav-Gal4/+；UAS-Aβ40/+。
本發(fā)明的第三個目的是提供一種快捷篩選抗癡呆藥物的方法。
一種篩選修復(fù)腦神經(jīng)元退化藥物的方法，是將雌性elav-Gal4的處女蠅與雄性UAS-Aβ42轉(zhuǎn)基因果蠅進(jìn)行雜交，得到的子I代果蠅過量表達(dá)人Aβ42蛋白，壽命縮短、活動能力下降；在該子I代果蠅發(fā)育期的不同階段，飼喂待篩選藥物，篩選出延長果蠅壽命和修復(fù)神經(jīng)元退化甚至凋亡的藥物。
一般是將待篩選的藥物參雜在果蠅培養(yǎng)基中。具體的喂藥方式為親本蠅雜交后放入無藥的培養(yǎng)基中，然后將其子一代新生蠅(三日齡)轉(zhuǎn)入有藥培養(yǎng)基中，觀察果蠅壽命和行為的變化，可分為藥種類系列和同種藥的濃度系列進(jìn)行比較。
本發(fā)明所構(gòu)建的果蠅疾病模型的一個特點(diǎn)是在果蠅特定腦區(qū)神經(jīng)元過量表達(dá)人Aβ42淀粉樣蛋白，從而導(dǎo)致人Aβ42淀粉樣蛋白介導(dǎo)神經(jīng)毒性導(dǎo)致的神經(jīng)元退化。特點(diǎn)之二是該果蠅模型壽命縮短和活動能力下降，喂藥方式簡便，藥物篩選工作相對快捷，可以快速地進(jìn)行大量的藥物篩選。即在發(fā)育期的不同階段，通過飼喂不同藥物及不同濃度的藥物篩選出延長果蠅壽命和修復(fù)神經(jīng)元退化甚至凋亡的藥物。同時通過藥物篩選還可以確定出延長果蠅壽命，以及腦區(qū)神經(jīng)元修復(fù)的有效標(biāo)準(zhǔn)。
用轉(zhuǎn)基因果蠅模型來研究人腦疾病和開發(fā)有效藥物有其它系統(tǒng)不可比擬的優(yōu)勢。利用本發(fā)明的模型及方法，使快捷地對大量化合物和中草藥進(jìn)行篩選得以實(shí)現(xiàn)，可以據(jù)此開發(fā)出修復(fù)腦神經(jīng)元退化的高效藥物。


圖1為果蠅疾病模型用于藥物篩選時各種處理的外部形態(tài)。
圖2為用果蠅疾病模型快捷篩選抗癡呆藥物的技術(shù)流程圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、篩選修復(fù)腦神經(jīng)元退化藥物的果蠅疾病模型的構(gòu)建1、UAS-Aβ42轉(zhuǎn)基因果蠅的構(gòu)建將人Aβ42基因，利用常規(guī)生物工程技術(shù)，在其5’端連接上來自酵母的上游激活序列(Upstream activating sequence，UAS)，該上游激活序列為5’-CTCTCCGGATCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCG GAGACTCTAG C-3’，整合到果蠅染色體基因組中。
2、將雌性elav-Gal4的處女蠅與雄性UAS-Aβ42轉(zhuǎn)基因果蠅進(jìn)行雜交，得到基因型為elav-Gal4/+；UAS-Aβ40/+的子I代果蠅，該果蠅過量表達(dá)人Aβ42蛋白，即篩選修復(fù)腦神經(jīng)元退化藥物的果蠅疾病模型。
3、果蠅疾病模型的對照果蠅為elav-Gal4果蠅的處女蠅分別與UAS-Aβ40果蠅的雄蠅雜交后的子I代蠅，基因型為elav-Gal4/+；UAS-Aβ40/+。
實(shí)施例2、將果蠅疾病模型用于藥物篩選該果蠅疾病模型用于藥物篩選的具體的實(shí)施方法如圖1所示。在圖中A和B為轉(zhuǎn)基因果蠅處于不同發(fā)育階段的蛹其中每幅圖中上為對照蠅，基因型為elav-Gal4/+；下左為對照用蠅，基因型為elav-Gal4/+；UAS-Aβ40/+；下右為篩藥用轉(zhuǎn)基因果蠅，基因型為elav-Gal4/+；UAS-Aβ42/+。C和D為轉(zhuǎn)基因果蠅成蠅C為轉(zhuǎn)基因果蠅，不用藥，基因型為elav-Gal4/+；UAS-Aβ40/+；D為轉(zhuǎn)基因果蠅，用藥或不用藥，基因型為elav-Gal4/+；UAS-Aβ42/+。其中，果蠅模型子一代新生蠅(三日齡)轉(zhuǎn)入有藥培養(yǎng)基中，觀察果蠅壽命和行為的變化。如圖2所示該實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)和技術(shù)的關(guān)鍵特征是該果蠅模型壽命縮短，神經(jīng)元退化和機(jī)能減退；喂藥時間為雜交后即放在有藥的食物中；所用藥物可分為藥物種類系列和同種藥的濃度系列，依據(jù)本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)篩選出侯選藥物。
權(quán)利要求
1.一種篩選修復(fù)腦神經(jīng)元退化藥物的果蠅模型，其特征在于該模型的腦區(qū)神經(jīng)元過量表達(dá)人Aβ42淀粉樣蛋白，具有人Aβ42淀粉樣蛋白介導(dǎo)神經(jīng)毒性導(dǎo)致的神經(jīng)元退化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的果蠅模型，其特征在于所述果蠅模型是將雌性elav-Gal4處女蠅與雄性UAS-Aβ42轉(zhuǎn)基因果蠅進(jìn)行雜交得到的子I代果蠅。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的果蠅模型，其特征在于所述果蠅模型的基因型為elav-Gal4/+；UAS-Aβ42/+。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的果蠅模型，其特征在于所述UAS-Aβ42轉(zhuǎn)基因果蠅是將5’端具有來自酵母上游激活序列(Upstream activating sequence，UAS)的人Aβ42基因，整合到果蠅染色體基因組中得到的。
5.一種構(gòu)建篩選修復(fù)腦神經(jīng)元退化藥物的果蠅疾病模型的方法，是將雌性elav-Gal4的處女蠅與雄性UAS-Aβ42轉(zhuǎn)基因果蠅進(jìn)行雜交，得到的子I代果蠅過量表達(dá)人Aβ42蛋白，為篩選修復(fù)腦神經(jīng)元退化藥物的果蠅疾病模型。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述果蠅疾病模型的對照果蠅為elav-Gal4果蠅的處女蠅或雄蠅分別與UAS-Aβ40果蠅的雄蠅或處女蠅雜交后的子I代蠅，其基因型為elav-Gal4/+；UAS-Aβ40/+。
7.一種篩選修復(fù)腦神經(jīng)元退化藥物的方法，是將雌性elav-Gal4的處女蠅與雄性UAS-Aβ42轉(zhuǎn)基因果蠅進(jìn)行雜交，得到的子I代果蠅過量表達(dá)人Aβ42蛋白，壽命縮短、活動能力下降；在該子I代果蠅發(fā)育期的不同階段，飼喂待篩選藥物，篩選出延長果蠅壽命和修復(fù)神經(jīng)元退化甚至凋亡的藥物。
8.據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于待篩選的藥物參雜在果蠅培養(yǎng)基中。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種篩選修復(fù)腦神經(jīng)元退化藥物的果蠅疾病模型及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案為一種篩選修復(fù)腦神經(jīng)元退化藥物的果蠅模型，該模型的腦區(qū)神經(jīng)元過量表達(dá)人Aβ42淀粉樣蛋白，具有人Aβ42淀粉樣蛋白介導(dǎo)神經(jīng)毒性導(dǎo)致的神經(jīng)元退化。所述果蠅模型是將雌性elav－Gal4處女蠅與雄性UAS－Aβ42轉(zhuǎn)基因果蠅進(jìn)行雜交得到的子I代果蠅。用轉(zhuǎn)基因果蠅模型來研究人腦疾病和開發(fā)有效藥物有其它系統(tǒng)不可比擬的優(yōu)勢。利用本發(fā)明的模型及方法，使快捷地對大量化合物和中草藥進(jìn)行篩選得以實(shí)現(xiàn)，并可以據(jù)此開發(fā)出修復(fù)腦神經(jīng)元退化的高效藥物。
文檔編號C12N15/12GK1521260SQ0310223
公開日2004年8月18日 申請日期2003年1月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月30日
發(fā)明者謝佐平, 鐘毅, 陳健 申請人:清華大學(xué), 北京卓凱生物技術(shù)有限公司