本發(fā)明屬于獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種vero細(xì)胞培養(yǎng)液添加劑及其制備方法、使用方法。

背景技術(shù)：

非洲綠猴腎細(xì)胞系vero細(xì)胞為全球認(rèn)可的生產(chǎn)人用及動(dòng)物用疫苗的細(xì)胞基質(zhì)，基于其對(duì)多種病毒敏感的特性，vero細(xì)胞的規(guī)?；囵B(yǎng)技術(shù)在病毒性疫苗、重組蛋白、單克隆抗體等生產(chǎn)技術(shù)平臺(tái)中具有重要的價(jià)值。

雞傳染性法氏囊?。╥nfectiousbursal,ibd）是由雞傳染性法氏囊病毒（infectiousbursalvirus,ibdv）引起的一種烈性傳染病，該病主要通過(guò)疫苗來(lái)防控，疫苗的質(zhì)量和安全性在很大程度上取決于疫苗的生產(chǎn)方式和過(guò)程，雞傳染性法氏囊疫苗通常是大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)胞收獲病毒液，但目前多采用含血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，血清組分的復(fù)雜性和不確定性，以及其中存在病毒等病原微生物污染的潛在風(fēng)險(xiǎn)，影響著病毒疫苗的生產(chǎn)工藝和疫苗質(zhì)量。從病毒疫苗生產(chǎn)工藝角度考慮，血清組分的復(fù)雜性和批次間的質(zhì)量差異增加了病毒疫苗生產(chǎn)的不穩(wěn)定性和產(chǎn)品質(zhì)量控制的難度；從病毒疫苗的安全性角度考慮，血清中潛在的病原微生物，給疫苗的使用帶來(lái)了不容忽視的安全隱患。

由使用血清所造成的細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程和細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物安全性的不確定因素增加的現(xiàn)實(shí)問(wèn)題，成為動(dòng)物細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)技術(shù)研究和應(yīng)用的發(fā)展動(dòng)因。無(wú)血清培養(yǎng)基具有諸多優(yōu)勢(shì)：簡(jiǎn)化下游目的產(chǎn)物的分離純化、節(jié)約成本；避免血清批次間的差異巧性，提高細(xì)胞培養(yǎng)的穩(wěn)定性及結(jié)果的可靠性；避免血清對(duì)細(xì)胞的毒性作用和血清源性污染；無(wú)血清培養(yǎng)基由于添加成分相對(duì)確定，可用于研究細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化、代謝及基因調(diào)控等研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明目的在于設(shè)計(jì)提供一種vero細(xì)胞培養(yǎng)液添加劑及其制備方法、使用方法的技術(shù)方案。

所述的一種vero細(xì)胞培養(yǎng)液添加劑，其特征在于每1000mlpbs溶液中含有以下組分：龜板提取物1-20mg、枸杞多糖5-20mg、云芝多糖2-20mg、亞硒酸鈉0.1-1mg、胰島素生長(zhǎng)因子1-20ug。

所述的一種vero細(xì)胞培養(yǎng)液添加劑，其特征在于每1000mlpbs溶液中含有以下組分：龜板提取物5-15mg、枸杞多糖8-16mg、云芝多糖4-16mg、亞硒酸鈉0.2-0.8mg、胰島素生長(zhǎng)因子5-15ug。

所述的一種vero細(xì)胞培養(yǎng)液添加劑的制備方法，其特征在于將所述重量配比的組分混合后，加入到pbs溶液中，邊加邊攪拌，直至完全溶解，補(bǔ)pbs溶液至1000ml，即得。

所述的一種vero細(xì)胞培養(yǎng)液添加劑的使用方法，其特征在于按藥物混合液：dmem重量比=1:1~1:3將兩者充分混合后使用。

本發(fā)明中龜板提取物購(gòu)買(mǎi)于：安徽遠(yuǎn)徽藥業(yè)有限公司；枸杞多糖購(gòu)買(mǎi)于：荊州金海藥業(yè)有限公司；云芝多糖購(gòu)買(mǎi)于：武漢福鑫化工有限公司；亞硒酸鈉購(gòu)買(mǎi)于：河南博特爾化工產(chǎn)品有限公司；胰島素生長(zhǎng)因子購(gòu)買(mǎi)于：sigma。

本發(fā)明具有以下有益效果：

1、本發(fā)明所制備的vero細(xì)胞培養(yǎng)液添加劑，可替代血清，大幅度降低生產(chǎn)成本，保證了疫苗的質(zhì)量和安全性。

2、本發(fā)明所制備的vero細(xì)胞培養(yǎng)液添加劑，可以大大提高細(xì)胞的生長(zhǎng)速度。

3、本發(fā)明所制備的vero細(xì)胞培養(yǎng)液添加劑，可以促進(jìn)雞傳染性法氏囊病毒對(duì)vero細(xì)胞的感染敏感性，提高其病毒含量，從而提高雞傳染性法氏囊活疫苗的免疫原性。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，下列實(shí)施例中未提及的具體實(shí)驗(yàn)方法，通常按常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。

實(shí)施例1：培養(yǎng)液添加劑的制備

龜板提取物：1mg(購(gòu)買(mǎi)于：安徽遠(yuǎn)徽藥業(yè)有限公司)

枸杞多糖：5mg（購(gòu)買(mǎi)于：荊州金海藥業(yè)有限公司）

云芝多糖：2mg(購(gòu)買(mǎi)于：武漢福鑫化工有限公司)

亞硒酸鈉：0.1mg(購(gòu)買(mǎi)于：河南博特爾化工產(chǎn)品有限公司)

胰島素生長(zhǎng)因子：1ug(購(gòu)買(mǎi)于：sigma)

將以上各種成分混合后，加入到盛有一定量的pbs溶液中，邊加邊攪拌，直至完全溶解，補(bǔ)pbs溶液至1000ml，按照藥物混合液：dmem=1:1制備一種vero細(xì)胞培養(yǎng)液添加劑，兩者充分混合，并經(jīng)過(guò)0.22um細(xì)菌濾器進(jìn)行過(guò)濾除菌，之后進(jìn)行分裝備用。

實(shí)施例2：培養(yǎng)液添加劑的制備

龜板提取物：8mg(購(gòu)買(mǎi)于：安徽遠(yuǎn)徽藥業(yè)有限公司)

枸杞多糖：15mg（購(gòu)買(mǎi)于：荊州金海藥業(yè)有限公司）

云芝多糖：8mg(購(gòu)買(mǎi)于：武漢福鑫化工有限公司)

亞硒酸鈉：0.5mg(購(gòu)買(mǎi)于：河南博特爾化工產(chǎn)品有限公司)

胰島素生長(zhǎng)因子：8ug(購(gòu)買(mǎi)于：sigma)

將以上各種成分混合后，加入到盛有一定量的pbs溶液中，邊加邊攪拌，直至完全溶解，補(bǔ)pbs溶液至1000ml，按照藥物混合液：dmem=1:2制備一種vero細(xì)胞培養(yǎng)液添加劑，兩者充分混合，并經(jīng)過(guò)0.22um細(xì)菌濾器進(jìn)行過(guò)濾除菌，之后進(jìn)行分裝備用。

實(shí)施例3：培養(yǎng)液添加劑的制備

龜板提取物：20mg(購(gòu)買(mǎi)于：安徽遠(yuǎn)徽藥業(yè)有限公司)

枸杞多糖：20mg（購(gòu)買(mǎi)于：荊州金海藥業(yè)有限公司）

云芝多糖：20mg(購(gòu)買(mǎi)于：武漢福鑫化工有限公司)

亞硒酸鈉：1mg(購(gòu)買(mǎi)于：河南博特爾化工產(chǎn)品有限公司)

胰島素生長(zhǎng)因子：20ug(購(gòu)買(mǎi)于：sigma)

將以上各種成分混合后，加入到盛有一定量的pbs溶液中，邊加邊攪拌，直至完全溶解，補(bǔ)pbs溶液至1000ml，按照藥物混合液：dmem=1：3制備一種vero細(xì)胞培養(yǎng)液添加劑，兩者充分混合，并經(jīng)過(guò)0.22um細(xì)菌濾器進(jìn)行過(guò)濾除菌，之后進(jìn)行分裝備用。

試驗(yàn)例1本發(fā)明培養(yǎng)液添加劑的應(yīng)用

1材料

1.1vero細(xì)胞培養(yǎng)液添加劑

按本發(fā)明實(shí)施例1-3制得

1.2dmem基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)于gibco公司，

硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(tg)、胰酪蛋白胨培養(yǎng)基（tsb）購(gòu)于北京中海生物科技有限公司

1.3vero細(xì)胞購(gòu)于atcc，由浙江美保龍生物技術(shù)有限公司保存

1.4雞傳染性法氏囊病毒（d78株/b87株），購(gòu)于中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所

1.5試驗(yàn)動(dòng)物14日齡spf雞60只，購(gòu)于青島易邦生物技術(shù)有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心

2方法

2.1培養(yǎng)基檢驗(yàn)

2.1.1無(wú)菌檢驗(yàn)

將實(shí)施例1-3制備的vero細(xì)胞培養(yǎng)液添加劑，各取3個(gè)不同批次進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)，每個(gè)批次分別取1ml接種于2支50mltg大管中，1支置于35-37℃培養(yǎng)，1支置于23-25℃培養(yǎng)，3d后各吸取培養(yǎng)物分別接種于10個(gè)tg小管，再分別置于35-37℃和23-25℃培養(yǎng)，另外每個(gè)批次分別取0.2ml接種于tsb小管內(nèi)，置于23-25℃培養(yǎng)，同時(shí)做陰性對(duì)照，均培養(yǎng)7日，觀察結(jié)果。

2.1.2內(nèi)毒素測(cè)定

將實(shí)施例1-3制備的vero細(xì)胞培養(yǎng)液添加劑，各取3個(gè)不同批次進(jìn)行內(nèi)毒素檢驗(yàn)，每個(gè)批次分別取1.7ml用鱟試劑盒分別進(jìn)行檢測(cè)，用酶標(biāo)儀選擇波長(zhǎng)405nm測(cè)其od值，同時(shí)做陰性對(duì)照。

2.2細(xì)胞生長(zhǎng)速度測(cè)定

由實(shí)施例1-3使用的vero細(xì)胞培養(yǎng)液添加劑，以及含8%、10%胎牛血清的vero完全培養(yǎng)液分別將已消化好的vero細(xì)胞，稀釋成3*10⁴個(gè)/ml的細(xì)胞密度接種于24孔培養(yǎng)板，每孔培養(yǎng)液體積為2ml，每種培養(yǎng)基接種1塊24孔培養(yǎng)板，置于37℃，5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d后，用0.25%(w/v)的胰蛋白酶溶液消化用不同培養(yǎng)液培養(yǎng)的vero細(xì)胞細(xì)胞各4個(gè)培養(yǎng)孔，用cedexas-20細(xì)胞密度和活力自動(dòng)分析儀計(jì)數(shù)細(xì)胞密度和活力。

2.3病毒培養(yǎng)

用dmem基礎(chǔ)培養(yǎng)基將雞傳染性法氏囊病毒（d78株/b87株）稀釋成1500tcid50/ml，分別接種于由2.2培養(yǎng)的5種細(xì)胞中，分別置于37℃、5%co2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96h之后進(jìn)行收毒。

2.4tcid50測(cè)定

分別將由實(shí)施例1-3制備的vero細(xì)胞培養(yǎng)液添加劑培養(yǎng)的細(xì)胞、含8%、10%fbs的vero培養(yǎng)液培養(yǎng)的細(xì)胞，均稀釋成10⁵～10⁶個(gè)/ml，按0.2ml/孔轉(zhuǎn)入96孔培養(yǎng)板中，置于37℃，5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d，棄掉培養(yǎng)液上清，將2.3收獲的雞傳染性法氏囊病毒（d78株/b87株）分別用dmem基礎(chǔ)培養(yǎng)基作連續(xù)10倍稀釋?zhuān)?.2ml/孔接種，置于37℃，5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4d，每天觀察細(xì)胞病變并記錄，按reed-muench法計(jì)算tcid50。

2.5免疫原性測(cè)定

將2.3收獲的五種病毒液經(jīng)檢驗(yàn)合格，加入佐劑后制作成疫苗成品測(cè)定疫苗的免疫原性。將60只14日齡的spf雞共分為6組，每組10只，第ⅰ組采用經(jīng)本發(fā)明實(shí)施例1制備的培養(yǎng)液添加劑，用于培養(yǎng)vero細(xì)胞繁殖雞傳染性法氏囊病毒，經(jīng)加工處理后制成的疫苗，按照0.2ml/只，進(jìn)行胸肌注射免疫；第ⅱ組采用經(jīng)本發(fā)明實(shí)施例2制備的培養(yǎng)液添加劑，用于培養(yǎng)vero細(xì)胞繁殖雞傳染性法氏囊病毒，經(jīng)加工處理后制成的疫苗，按照0.2ml/只，進(jìn)行胸肌注射免疫；第ⅲ組采用經(jīng)本發(fā)明實(shí)施例3制備的培養(yǎng)液添加劑，用于培養(yǎng)vero細(xì)胞繁殖雞傳染性法氏囊病毒，經(jīng)加工處理后制成的疫苗，按照0.2ml/只，進(jìn)行胸肌注射免疫；第ⅳ組采用含10%fbs培養(yǎng)基，用于培養(yǎng)vero細(xì)胞繁殖雞傳染性法氏囊病毒，經(jīng)加工處理后制成的疫苗，按照0.2ml/只，進(jìn)行胸肌注射免疫；第ⅴ組采用含8%fbs培養(yǎng)基，用于培養(yǎng)vero細(xì)胞繁殖雞傳染性法氏囊病毒，經(jīng)加工處理后制成的疫苗，按照0.2ml/只，進(jìn)行胸肌注射免疫。第ⅳ組，疫苗對(duì)照組，不進(jìn)行免疫。各組均在免疫后第7d、14d、21d、28d、35d、45d、49d分別翅靜脈采血并分離血清，用elisa方法進(jìn)行測(cè)定ibdv的抗體水平。

由2.2培養(yǎng)的5種細(xì)胞在培養(yǎng)雞傳染性法氏囊病毒的同時(shí)，我們又試著培養(yǎng)犬瘟熱病毒（cdv），經(jīng)加工處理后制成的疫苗，對(duì)45日齡的犬只進(jìn)行免疫，同時(shí)設(shè)疫苗對(duì)照組，分別在60、75日齡對(duì)試驗(yàn)犬進(jìn)行前肢靜脈采血，離心，制備血清，采用血清微量中和試驗(yàn)測(cè)定血清中cdv抗體效價(jià)。

3.1檢驗(yàn)結(jié)果

表1無(wú)菌檢驗(yàn)結(jié)果

表2內(nèi)毒素檢驗(yàn)結(jié)果（405nm）

由表1、表2可以看出，由實(shí)施例1、2、3制備的不同批次的培養(yǎng)基添加劑均既無(wú)菌生長(zhǎng)又不含內(nèi)毒素，該方法制備的培養(yǎng)基添加劑安全可靠。

3.2細(xì)胞密度及活力測(cè)定

表3細(xì)胞密度測(cè)定結(jié)果

由表3可以看出，由實(shí)施例1、2、3制備的培養(yǎng)基添加劑培養(yǎng)的vero細(xì)胞密度明顯大于含fbs培養(yǎng)基培養(yǎng)的vero細(xì)胞。

表4細(xì)胞活率測(cè)定結(jié)果

由表4可以看出，在相同的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，由實(shí)施例1、2、3制備的培養(yǎng)基添加劑培養(yǎng)的vero細(xì)胞存活率明顯大于由含fbs培養(yǎng)基培養(yǎng)的vero細(xì)胞。

3.3tcid50測(cè)定結(jié)果

表5tcid50測(cè)定結(jié)果

由表5可以看出，由實(shí)施例1、2、3制備的培養(yǎng)基添加劑培養(yǎng)的vero細(xì)胞比由含fbs培養(yǎng)基培養(yǎng)的vero細(xì)胞更有利于ibdv的繁殖，敏感性更強(qiáng)。

3.4免疫原性測(cè)定結(jié)果

表6ibdv的抗體水平測(cè)定結(jié)果

由表6可以看出，ⅰ、ⅱ、ⅲ組的抗體水平明顯高于ⅳ、ⅴ組，由實(shí)施例1、2、3制備的添加劑培養(yǎng)的ibdv加工制成的疫苗產(chǎn)生的抗體水平高于含fbs培養(yǎng)基培養(yǎng)的ibdv加工制成的疫苗。

表760日齡cdv的抗體水平測(cè)定結(jié)果

表875日齡cdv的抗體水平測(cè)定結(jié)果

我們意外的發(fā)現(xiàn)，由實(shí)施例1、2、3制備的添加劑培養(yǎng)的cdv加工制成的疫苗產(chǎn)生的中和抗體水平明顯優(yōu)于疫苗對(duì)照組，使更多的犬只得到保護(hù)。

4結(jié)論

綜上所述，本發(fā)明所制備的vero細(xì)胞培養(yǎng)液添加劑，在可以大大提高細(xì)胞的生長(zhǎng)速度的前提下，一方面能增強(qiáng)雞傳染性法氏囊病毒對(duì)vero細(xì)胞的敏感性，提高病毒的tcid50含量；另一方面，還可以增強(qiáng)雞傳染性法氏囊病毒活疫苗的免疫原性。使用本發(fā)明所制備的細(xì)胞培養(yǎng)液添加劑培養(yǎng)的vero細(xì)胞，不限于只用來(lái)繁殖雞傳染性法氏囊病毒，還可以用來(lái)培養(yǎng)犬瘟熱病毒等病毒，經(jīng)過(guò)加工處理后制得疫苗，產(chǎn)生的抗體水平具有明顯的優(yōu)勢(shì)。