葡萄糖異構酶基因、編碼酶、載體、工程菌及應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種葡萄糖異構酶基因、編碼酶、重組載體及基因工程菌，以及葡萄糖異構酶基因工程菌在催化D-葡萄糖異構化制備D-果糖中的應用，本發(fā)明提供的高效表達耐高溫葡萄糖異構酶的重組大腸桿菌，解決了一般的葡萄糖異構酶最適反應溫度低的問題；應用該菌種生產葡萄糖異構酶具有產量高、工藝簡單、便于工業(yè)化應用等優(yōu)點，該菌株可以直接用于高果糖漿的生產，而不需細胞破碎；發(fā)酵結束后在85℃條件下對D-葡萄糖的總酶活達到715U/L，D-果糖的轉化率達到55％，這為高果糖漿的大規(guī)模生產以及其作為重要的食品添加劑提供了良好的技術支持。
【專利說明】葡萄糖異構酶基因、編碼酶、載體、工程菌及應用 (一）

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種產葡萄糖異構酶（Glucose isomerase，簡稱GI，EC5. 3. 1. 5)的基 因工程菌及其構建方法和應用，屬于基因工程領域。 (二）

【背景技術】
[0002] 葡萄糖異構酶（Glucose isomerase，簡稱GI，EC5. 3. L 5)，又稱木糖異構酶 (Xylose isomerase，XI)，能夠催化D-葡萄糖和D-木糖的異構化反應，分別轉化為D-果糖 和D-木酮糖，是食品工業(yè)領域重要的生物催化劑之一，尤其是在生物轉化制備高果糖漿的 工藝中具有關鍵的作用。
[0003] 高果糖漿（HFCS)是葡萄糖和果糖混合物，也稱果葡糖漿，是一種重要的甜味劑。 根據(jù)果糖的含量，高果糖漿可分為三種類型，HFCS-42(果糖42%、葡萄糖53%、多聚糖 5% )、HFCS-55(果糖55%、葡萄糖42%、多聚糖3% )和HFCS-90(果糖90%，葡萄糖9%， 多聚糖1% )。HFCS-90主要是通過HFCS-42分離、濃縮、純化制得，直接作為添加劑使用較 少，一般用于制備HFCS-55。HFCS-55 -般是由HFCS-90與HFCS-42混合制成。自從上世紀 六十年代作為一種甜味劑被應用于食品領域，高果糖漿的市場需求逐年增加，探索其工業(yè) 化生產的方法也層出不窮。目前制備高果糖漿的方法主要有化學法、發(fā)酵法和酶法。其中 應用葡萄糖異構酶生物轉化法生產的HFCS-42是目前市場上高果糖漿的主要來源。
[0004] 葡萄糖異構酶催化D-葡萄糖異構化是一個熱力學平衡反應。葡萄糖異構酶（第 一類GI) -般在高于60°C左右時催化活性降低，轉化率最高達到42-45%，因此，只能用來 制得HFCS-42。若能篩選到耐高溫的葡萄糖異構酶（第二類GI)，可將反應溫度提高至85°C 以上，促進D-葡萄糖向D-果糖的轉化，從而提高轉化率至55 %以上，因此可以直接生產 HFCS-55。
[0005] 目前已經有一些耐高溫葡萄糖異構酶的報道，例如來自于阿波羅棲熱袍菌 Thermotoga neapolitana DSM5068和海棲熱袍菌Thermotoga maritime DSM3109 的葡萄糖 異構酶，其最適反應溫度分別達到了 97°C和105°C。然而，有些耐高溫的葡萄糖異構酶耐酸 能力較弱，在堿性條件下會催化生成有色物質阿洛酮糖。目前商業(yè)化生產的葡萄糖異構酶 難以滿足HFCS-55生產的需求。因此篩選出新型的表達耐高溫的葡萄糖異構酶基因，并通 過基因工程技術構建高表達的基因工程菌在HFCS-55的制備中具有重要的意義。 (三）


【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明目的是提供一種葡萄糖異構酶基因、編碼酶、重組載體及基因工程菌，以及 葡萄糖異構酶基因工程菌在催化D-葡萄糖異構化制備D-果糖中的應用。
[0007] 本發(fā)明采用的技術方案是：
[0008] 本發(fā)明涉及一種葡萄糖異構酶基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0009] 由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQ NO :1所示多核苷酸的變體，只要其與該多核 苷酸具有90%以上同源性，均屬于本發(fā)明保護范圍之列。所述多核苷酸的變體是指一種具 有一個或多個核苷酸改變的多核苷酸序列。此多核苷酸的變體可以使生的等位變異體或非 生的變異體，包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是 一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質上 改變其編碼的氨基酸的功能。
[0010] 本發(fā)明涉及一種所述葡萄糖異構酶基因編碼的葡萄糖異構酶，所述酶的氨基酸序 列為SEQ ID NO. 2所示。
[0011] 由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ NO :2所示氨基酸序列的多肽的片段或 其變體，如其保守性變體、生物活性片段或衍生物，只要該多肽的片段或多肽變體與前述氨 基酸序列同源性在95%以上，均屬于本發(fā)明保護范圍之列。具體的，所述改變可包括氨基酸 序列中氨基酸的缺失、插入或替換；其中，對于變體的保守性改變，所替換的氨基酸具有與 原氨基酸相似的結構或化學性質，如用亮氨酸替換異亮氨酸，變體也可具有非保守性改變， 如用色氨酸替換甘氨酸。
[0012] 本發(fā)明還涉及一種含所述葡萄糖異構酶基因的重組載體。
[0013] 本發(fā)明提供一種由所述重組載體構建的重組基因工程菌。
[0014] 本發(fā)明還提供一種所述葡萄糖異構酶基因在制備葡萄糖異構酶中的應用，所述的 應用為：構建含有所述葡萄糖異構酶基因的重組載體，將所述重組載體轉化至大腸桿菌中， 獲得的重組基因工程菌進行誘導培養(yǎng)，取培養(yǎng)液分離得到含葡萄糖異構酶的菌體細胞。
[0015] 此外，本發(fā)明涉及一種所述葡萄糖異構酶在催化D-葡萄糖異構化制備D-果糖 中的應用，所述的應用為：以含葡萄糖異構酶基因的重組工程菌經發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌 體為酶源，以D-葡萄糖為底物，以鎂鹽和鈷鹽為助劑，以去離子水為反應介質，在55? l〇〇°C (優(yōu)選80?95°C )、150r/min條件下反應，反應完全后，將反應液分離純化，獲得D-果 糖；所述底物初始濃度為100?300g/L去離子水，濕菌體的質量用量為20g/L去離子水，所 述鎂鹽和鈷鹽物質的量濃度分別為5?25mmol/L去離子水和0. 1?5mmol/L去離子水。
[0016] 進一步，優(yōu)選所述底物初始濃度為l〇〇g/L去離子水，濕菌體的質量用量為20g/L 去離子水，所述鎂鹽在反應體系中物質的量濃度為15mmol/L去離子水，鈷鹽在反應體系中 物質的量濃度lmmol/L去離子水。
[0017] 進一步，所述酶源按如下步驟制備：將含萄萄糖異構酶基因的重組工程菌接種至 含終濃度40 μ g/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基，37°C、150r/min培養(yǎng)至OD6tltl = 0. 8?1. 0,獲 得種子液；將種子液以體積濃度2 %的接種量轉入含終濃度40 μ g/mL卡那霉素的LB液體 培養(yǎng)基中，于37°C、150r/min條件下培養(yǎng)OD6tltl = 0. 4?0. 8,添加終濃度0. 5mMIPTG，28°C、 150r/min誘導培養(yǎng)10h，獲得誘導培養(yǎng)液，將誘導培養(yǎng)液離心，收集濕菌體，即為酶源；所述 LB液體培養(yǎng)基組成：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaC110g/L，溶劑為水，用IM NaOH將pH 調至7. 0。
[0018] 更進一步，本發(fā)明所述葡萄糖異構酶在催化D-葡萄糖異構化制備D-果糖中的應 用方法為：
[0019] (1)重組菌的篩選：所述重組表達質粒pET-28b-tpgi上帶有卡那霉素抗性基 因，如果重組質粒已經轉化到大腸桿菌中，重組菌株具有卡那霉素抗性，可在含有40yg/ mL卡那霉素的平板上生長；挑取陽性轉化子，即為葡萄糖異構酶重組菌BL21(DE3)/ pET-28b_tpgi〇
[0020] (2)重組菌經培養(yǎng)表達葡萄糖異構酶
[0021] LB液體培養(yǎng)基（g/L)組成：胰蛋白胨10,酵母粉5, NaCl 10,溶劑為水，用IM NaOH 將pH調至7. 0 ;LB固體培養(yǎng)基添加20g/L瓊脂；高壓滅菌；使用前添加終濃度40 μ g/mL卡 那霉素。
[0022] 將萄糖異構酶重組菌BL21 (DE3) /pET-28b-tpgi接種至終濃度40 μ g/mL卡那霉素 的LB液體培養(yǎng)基，250mL三角瓶，裝液量為50mL，培養(yǎng)溫度37°C、搖床轉速150r/min，培養(yǎng) 至0D_ = 0. 8?1. 0,獲得種子液；將種子液以體積濃度2%的接種量轉入裝有IOOmL終濃 度^yg/mL卡那霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基（LB液體培養(yǎng)基）的500mL三角瓶中，于37°C、150r/ min 條件下培養(yǎng) 2-3h (0D_ = 0. 4 ?0. 8)，添加終濃度 0. 5mMIPTG，28 °C、150r/min 誘導培 養(yǎng)l〇h，獲得誘導培養(yǎng)液。
[0023] (3)葡萄糖異構酶酶活測定
[0024] 取誘導培養(yǎng)液，4°C、8000r/min離心lOmin，將(λ 4g菌體沉淀溶于20mL去離子水 (pH6. 8)中，充分混勻懸浮菌體，加入終濃度ImM Co2+、終濃度IOmM Mg2+和終濃度100g/L 的D-葡萄糖，在85°C、150rpm條件下反應lh，冰浴5min終止反應，8000r/min離心IOmin, 取上清；采用HPLC檢測D-葡萄糖和D-果糖的濃度。分析柱為Hi-Plex Ca離子交換柱 (300X7. 7mm，美國，Agilent)，Waters2414 示差折光檢測器，Watersl525 泵，Waters717 進 樣器。酶活（U)定義為在該條件下每分鐘生成lymol D-果糖所需酶量；比酶活單位為U/ mg濕菌體。
[0025] 本發(fā)明所述葡萄糖異構酶能夠耐受80?KKTC溫度，且在底物濃度為100g/L、反 應溫度85°C時酶活達到715U/L，轉化率達到55%。
[0026] 本發(fā)明的優(yōu)點在于構建了一株高效表達耐高溫（80?95°C )葡萄糖異構酶的重 組大腸桿菌，解決了一般的葡萄糖異構酶最適反應溫度低的問題；應用該菌種生產葡萄糖 異構酶具有產量高、工藝簡單、便于工業(yè)化應用等優(yōu)點，該菌株可以直接用于高果糖漿的生 產，而不需細胞破碎。發(fā)酵結束后在85°C條件下對D-葡萄糖的總酶活達到715U/L，D-果 糖的轉化率達到55%，這為高果糖漿的大規(guī)模生產以及其作為重要的食品添加劑提供了良 好的技術支持。 (四）【專利附圖】

【附圖說明】
[0027] 圖1為tpgi的PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖。M :DL2000DNA Marker ;1 :以 tpgi-NMK-F和 tpgi-NMK-R為引物 PCR擴增的 tpgi 基因片段；2 :以 tpgi-MA-F和 tpgi-MA-R 為引物PCR擴增的tpgi基因片段。
[0028] 圖 2 為質粒 pP43NMK_tpgi (a)和 pMA0911_tpgi (b)的酶切電泳圖。（a) :M :Fast DL10000DNA Marker(500-10000) ;1 :質粒 pP43NMK-tpgi 被 Pst I 單酶切后的片段；2 : 質粒pP43NMK-tpgi被Pst I和Hind III雙酶切后的片段；3 :質粒pP43NMK被Pst I單 酶切后的片段；4:質粒PP43NMK被Pst I和Hind III雙酶切后的片段；(b):Ml:Fast DL10000DNA Marker(500-10000) ;1:質粒 pMA0911-tpgi 被 EcoR I 單酶切后的片段；2:質 粒 pMA0911-tpgi 被 EcoR I 和 BamH I 雙酶切后的片段；M2 :DL2000DNA Marker。
[0029] 圖3為重組表達質粒pP43NMK-tpgi (a)和pMA0911-tpgi (b)的物理圖譜。
[0030] 圖4為tpgi的PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖。M :DL2000DNA Marker ;1 :以tpgi-F 和tpgi-R為引物PCR擴增的tpgi基因片段。
[0031] 圖5為陽性重組表達質粒pET-28b-tpgi的酶切電泳圖。Ml :DL2000DNA Marker ; I :pET-28b-tpgi 的 Nco I 和 Xho I 雙酶切條帶；Fast DL10000DNA Marker(500-10000)。
[0032] 圖6為pET-28b_tpgi重組表達質粒的物理圖譜。
[0033] 圖7為重組大腸桿菌全細胞蛋白的SDS-PAGE圖。M :蛋白分子量Marker ;1 :E. coli BL21(DE3)/pET-28b ;2 :未誘導的Ε· coli BL21(DE3)/pET-28b-tpgi ;3 :0· 5mM IPTG誘導的 BL21(DE3)/pET-28b-tpgi。 (五）【具體實施方式】
[0034] 下面結合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于 此：
[0035] 實施例1 :葡萄糖異構酶的基因合成
[0036] 葡萄糖異構酶的基因來源于熱孢菌屬細菌Thermotoga petrophila RKU-I (DSM NO. 13995 JCM NO. 10881)的全基因組序列，其中從1149014bp到1150348bp堿基為編碼葡 萄糖異構酶基因的序列（GenBank No. YP_001244714, GI 148270254)。為了使該基因連接 到載體pET-28b后可以表達帶有His-tag的蛋白，切除其終止密碼子，并依據(jù)密碼子簡并性 對其序列中的常用限制性內切酶識別位點BamH I、Xho I、Pst I、Hind III和Nco I進行 序列優(yōu)化，新設計的葡萄糖異構酶基因（tpgi)的序列如SEQ ID NO. 1所示，基因合成工作 委托上海旭冠生物科技發(fā)展有限公司完成，基因合成后連接到克隆載體PES中。
[0037] 實施例2 :葡萄糖異構酶重組枯草芽孢桿菌的構建
[0038] 在實施例1的基礎上，分別針對不同的枯草芽孢桿菌表達載體設計引物，利用PCR 技術，以合成的核苷酸序列（SEQ ID NO. 1所示）為模板，對葡萄糖異構酶基因（tpgi)進行 擴增。對于表達載體 PP43NMK，設計引物 tpgi-NMK-F (5' -AAAACTGCAGATGATGGAATTTTTCCCT G-3'）和 tpgi-NMK-R (5, -CCCAAGCTTTTAACGAAGTTCAGCGATTG-3' )，并分別引入 Pst I 和 Hind III限制性酶切位點；對于表達載體PMA0911，設計引物tpgi-MA-F(5' -CCGGAATTCATGATGG AAiriTTCCCTG-3'）和 tpgi-MA-R(5' -CGCGGATCCTTAACGAAGTTCAGCGATTG-3')，并分別引入 EcoR I和BamH I限制性酶切位點。
[0039] PCR 反應體系（50μ L)為：10XPfu PCR buffer5y L，dNTP Mixture8y L ;模板 DNAl μ L ;上下游引物各2 μ L ;Pfu DNA聚合酶0. 5 μ L ;無菌水31. 5 μ L。PCR反應的程序 為94°C預變性5min;30個循環(huán)（94°C變性30s，50°C退火30s，72°C延伸120s) ;72°C延伸 lOmin。以I %瓊脂糖凝膠電泳驗證并以0.8%瓊脂糖凝膠電泳回收PCR擴增產物，結果擴 增到與SEQ ID No. 1序列大小相符的tpgi基因片段（圖1泳道1和泳道2)。
[0040] 用限制性內切酶Pst I和Hind III分別雙酶切純化后的tpgi基因和載體 PP43NMK ;用限制性內切酶EcoR I和BamH I分別雙酶切純化后的tpgi基因和載體 PMA0911，分別以T4DNA連接酶于16°C過夜連接。連接反應體系為（20μυ :目的基因片段 12 μ L，載體 DNA5 μ L，10 X T4DNA 連接酶 buffer2 μ L，T4DNA 連接酶 1 μ L。
[0041] 連接產物轉化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞，涂布于含有40 μ g/mL卡那霉素的LB 平板上，37°C培養(yǎng)12?18h。挑取陽性克隆，37°C、150r/min振蕩培養(yǎng)過夜，提取質粒，經酶 切鑒定（鑒定結果見圖2)，得到正確構建的原核表達質粒pP43NMK-tpgi和pMA0911-tpgi， 其物理圖譜見圖3。將質粒pP43NMK-tpgi和pMA0911-tpgi分別電轉到枯草芽孢桿菌 WB800感受態(tài)細胞中，轉化方法為：取連接產物5?10 μ L，加入到100 μ L枯草芽孢桿菌 WB800感受態(tài)細胞中，充分混勻后，轉入預冷的0. 2cm電轉杯中，冰浴中預冷IOmin ;取出電 轉杯，用紙巾吸去表面的水分，放入樣品槽中；將參數(shù)設定為2. 5kv，25 μ F，200 Ω，電擊時 間為4-5ms ;電擊，立即加入ImL LB培養(yǎng)基，30°C、150r/min培養(yǎng)2h ;涂布在含有40μ g/ mL卡那霉素的LB平板上，37°C培養(yǎng)12-24h，挑取轉化子，進行質粒提取和酶切驗證，得 到正確構建的重組枯草芽孢桿菌（B. subtilis)WB800/pP43NMK-tpgi和重組枯草芽孢桿 菌（B. subtilis)WB800/pMA0911-tpgi。LB 培養(yǎng)基組成為：胰蛋白胨 10g/L，酵母粉 5g/L， NaC110g/L，溶劑為水，用IM NaOH將pH調至7.0。
[0042] 實施例3 :重組枯草芽孢桿菌的蛋白電泳和酶活測定
[0043] 通過酶切驗證和測序驗證后的重組菌B. subtilis WB800/pP43NMK-tpgi和 B. subtilis WB800/pMA0911-tpgi接種至50mL LB液體培養(yǎng)基中（含有卡那霉素40 μ g/ mL)，37°C、150r/min振蕩培養(yǎng)到OD6tltl = 0. 8?I. 0 ;培養(yǎng)液以2% (v/v)接種量接種到新鮮 的含有40 μ g/mL卡那霉素的IOOmL LB液體培養(yǎng)基中，37°C、150r/min振蕩培養(yǎng)10?24h。
[0044] 取菌體培養(yǎng)液，lOOOr/min離心5min，分別取菌體沉淀和上清液，分別加20 μ LSDS 緩沖液混合，沸水浴加熱5min，進行SDS-PAGE分析，以不含載體的空宿主作對照，結果未發(fā) 現(xiàn)明顯的葡萄糖異構酶蛋白條帶；相應的，也未檢測到葡萄糖異構酶的酶活。表明葡萄糖異 構酶在枯草芽孢桿菌中未能成功表達，或者表達的葡萄糖異構酶被蛋白酶降解。
[0045] 實施例4 :葡萄糖異構酶重組大腸桿菌的構建
[0046] 在實施例1的基礎上，利用PCR技術，以合成的核苷酸序列（SEQ ID NO. 1所示） 為模板，以 tpgi_F(5' -CATGCCATGGTAATGGAATTTTTCCCAGAAATCC-3')和 tpgi-R (5, -GGCCTC GAGCCTCAGTTCCGCTATTGTC-3')為引物，對葡萄糖異構酶基因（tpgi)進行擴增，并在其5' 端和3'分別引入Nco I和Xho I限制性酶切位點。PCR反應體系（50 μ L)為：10XPfu 0. 5 μ L ;無菌水31. 5 μ L。PCR反應的程序為94°C預變性5min ;94°C變性30s，57°C退火90s， 72°C延伸I. 5min(30個循環(huán)）；72°C延伸lOmin。以1%瓊脂糖凝膠電泳驗證并以0. 8%瓊 脂糖凝膠電泳回收PCR擴增產物，結果擴增到與SEQ ID No. 1序列大小相符的tpgi基因片 段（圖4泳道1)。
[0047] 用限制性內切酶Nco I和Xho I雙酶切純化后的tpgi基因（即回收的PCR擴增 產物）和載體pET-28b(+)，用T4DNA連接酶于16°C過夜連接。連接反應體系為（20yL) : 目的基因片段12yL，載體DNA5yL，10XT4DNA連接酶buffer2yL，T4DNA連接酶lyL。 連接產物轉化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細胞，轉化方法為：取連接產物5?10 μ L，加入 至Ij 100 μ L大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細胞中，充分混勻后，冰浴30min ;將裝有混合物的 Eppendorf管置于42°C水浴熱休克90s，然后立即轉移到冰上冷卻2min ;向管中加入600 μ L LB液體培養(yǎng)基，置于37°C、150r/min恒溫搖床上培養(yǎng)2?4h，然后涂布于含有40 μ g/mL卡 那霉素的LB平板上，37°C培養(yǎng)12?18h。挑取陽性克隆，37°C、150r/min振蕩培養(yǎng)過夜，提 取質粒，經酶切鑒定（鑒定結果見圖5)，得到正確構建的原核表達質粒pET-28b-tpgi，其物 理圖譜見圖6。含有質粒pET-28b-tpgi的陽性克隆為正確構建的重組大腸桿菌BL21(DE3)/ pET-28b_tpgi。
[0048] 實施例5 :重組大腸桿菌的蛋白電泳和酶活測定
[0049] 將實施例4中構建的重組大腸桿菌BL21 (DE3) /pET-28b-tpgi接種至50mL LB液 體培養(yǎng)基中（含有卡那霉素40 μ g/mL)，37°C、150r/min振蕩培養(yǎng)到OD6tltl = 0. 8?I. 0 ;培 養(yǎng)液以2% (v/v)接種量接種到新鮮的含有40 μ g/mL卡那霉素的IOOmL LB液體培養(yǎng)基 中，37°C、150r/min振蕩培養(yǎng)至菌體濃度OD6tltl = 0· 6?0· 8,加入終濃度0· 5mMIPTG，28°C、 150r/min誘導培養(yǎng)10h。
[0050] 誘導培養(yǎng)IOh后，取20 μ L菌液，加20 μ L SDS緩沖液混合，沸水浴加熱5min，取 8 μ L進行SDS-PAGE電泳分析，以空載體為對照，得到一條分子量約為50kDa的蛋白條帶 (見圖7)，同時測定該重組菌對D-葡萄糖的總酶活，總酶活為715U/L。
[0051] 酶活測定方法為：取誘導培養(yǎng)液，4°C、8000r/min離心lOmin，將0. 4g菌體沉淀溶 于20mL去離子水（pH6. 8)中，充分混勻懸浮菌體，加入終濃度ImM Co2+、終濃度IOmM Mg2+ 和終濃度l〇〇g/L的D-葡萄糖，在80°C條件下反應lh，冰浴5min終止反應，8000r/min離心 10min，取上清；采用HPLC檢測D-葡萄糖和D-果糖的濃度。分析柱為Hi-Plex Ca離子交換 柱（300X7. 7mm，美國，Agilent)，Waters2414 示差折光檢測器，Watersl525 泵，Waters717 進樣器。
[0052] 酶活單位定義：在80 °C，pH6. 8條件下，Imin內催化D-葡萄糖異構化為 IymolD-果糖所需要的酶量定義為1U。葡萄糖異構酶的比酶活以每mg濕菌體所含有的酶 活力單位表示（U/mg)，結果見表1。
[0053] 表1以重組大腸桿菌為酶源測定的葡萄糖異構酶活力
[0054]

【權利要求】
1. 一種葡萄糖異構酶基因，其特征在于所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2. -種權利要求1所述葡萄糖異構酶基因編碼的葡萄糖異構酶，其特征在于所述酶的 氨基酸序列為SEQ ID NO. 2所示。
3. -種含權利要求1所述葡萄糖異構酶基因的重組載體。
4. 一種由權利要求2所述重組載體構建的重組基因工程菌。
5. -種權利要求1所述葡萄糖異構酶基因在制備葡萄糖異構酶中的應用，其特征在于 所述的應用為：構建含有所述葡萄糖異構酶基因的重組載體，將所述重組載體轉化至大腸 桿菌中，獲得的重組基因工程菌進行誘導培養(yǎng)，取培養(yǎng)液分離得到含葡萄糖異構酶的菌體 細胞。
6. -種權利要求2所述葡萄糖異構酶在催化D-葡萄糖異構化制備D-果糖中的應用， 其特征在于所述的應用為：以含葡萄糖異構酶基因的重組工程菌經誘導培養(yǎng)獲得的濕菌體 為酶源，以D-葡萄糖為底物，以鎂鹽和鈷鹽為助劑，以去離子水為反應介質，在55?100°C、 150r/min條件下反應，反應完全后，將反應液分離純化，獲得D-果糖。
7. 如權利要求6所述應用，其特征在于所述底物初始濃度為100?300g/L去離子水， 濕菌體的質量用量為20g/L去離子水，所述鎂鹽和鈷鹽物質的量濃度分別為5?25mmol/L 去離子水和0. 1?5mmol/L去離子水。
8. 如權利要求7所述應用，其特征在于所述底物初始濃度為100g/L去離子水，濕菌 體的質量用量為20g/L去離子水，所述鎂鹽和鈷鹽物質的量濃度為15mmol/L去離子水和 lmmol/L去離子水。
9. 如權利要求6所述應用，其特征在于所述酶源按如下步驟制備：將含萄萄糖異構酶 基因的重組工程菌接種至含終濃度40 μ g/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基，37°C、150r/min 培養(yǎng)至0D_ = 0. 8?1. 0,獲得種子液；將種子液以體積濃度2 %的接種量轉入含終濃度 40 μ g/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C、150r/min條件下培養(yǎng)0D6(I(I = 0. 4?0. 8,添 加終濃度〇. 5mM IPTG，28°C、150r/min誘導培養(yǎng)10h，獲得誘導培養(yǎng)液，將誘導培養(yǎng)液離心， 收集濕菌體，即為酶源；所述LB液體培養(yǎng)基組成：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCllOg/ L，溶劑為水，pH值為7.0。
【文檔編號】C12N9/90GK104293759SQ201410484596
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年9月19日 優(yōu)先權日:2014年9月19日
【發(fā)明者】鄭裕國, 周海巖, 柳志強, 劉成龍, 廖承軍, 陳德水, 程新平, 毛寶興, 張為宏 申請人:浙江工業(yè)大學, 浙江華康藥業(yè)股份有限公司