一種a型副雞禽桿菌免疫保護(hù)性抗原及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種A型副雞禽桿菌免疫保護(hù)性抗原及其應(yīng)用。本發(fā)明獲得的人工A型副雞禽桿菌免疫保護(hù)性抗原蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，命名為P41。該蛋白具有很強(qiáng)的免疫原性，利用所述抗原蛋白制備的亞單位疫苗，能夠明顯增強(qiáng)雞對A型副雞禽桿菌的抵抗力，其保護(hù)效果優(yōu)于全菌滅活疫苗，可有效預(yù)防副雞禽桿菌的感染。
【專利說明】
一種A型副雞禽桿菌免疫保護(hù)性抗原及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于家禽傳染病疫苗制備技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種A型副雞禽桿菌免疫保 護(hù)性抗原及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 副雞禽桿菌(Avibacterium paragallinarum，Apg)為巴氏桿菌科的一種短小革蘭 氏陰性桿菌，基本特征為無運(yùn)動性、菌體呈多形性、強(qiáng)毒株帶有莢膜。1932年De Blieck首先 報道了自鼻道和鼻竇黏膜具有急性卡他性炎癥、面部水腫和結(jié)膜炎的雞群中首次分離出一 種革蘭氏陰性桿菌。最初的研究報道指出該病原菌生長條件中既需要X(血紅素晶）因子，也 需要V (煙酰胺腺嘌啉二核苷酸，NAD)因子，早期的研究者將其命名為雞嗜血桿菌 (Haemophilus gall inarum)。1962年，Page等人研究發(fā)現(xiàn)所有1C病例的分離株生長只需要V 因子。因此，有學(xué)者提議將只需要V因子的雞嗜血桿菌命名為一個新種：副雞嗜血桿菌 (H.paragallinarum)，并被廣泛接受。近年來，在南非、墨西哥等地已從患鼻炎的雞中分離 到不依賴V因子的副雞嗜血桿菌菌株。因此，嚴(yán)格按照在體外生長因子需要進(jìn)行嗜血菌的分 類并不科學(xué)。2005年，Blackall等將副雞嗜血桿菌的名稱改為副雞禽桿菌(Avibacterium paragallinarum)〇
[0003] 副雞禽桿菌作為雞的一種重要的呼吸道病原菌，常引起雞的傳染性鼻炎 (infectious coryza, 1C)，該病在世界范圍內(nèi)廣泛傳播，給養(yǎng)雞業(yè)造成愈來愈嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì) 損失。目前國內(nèi)已有許多養(yǎng)雞場發(fā)生該病的報道。從感染部位來看，副雞禽桿菌感染的是呼 吸系統(tǒng)中最前沿的部位一鼻道和鼻竇黏膜，可以說是呼吸道疾病的門戶病。這第一屏障被 破壞，其他病原的感染率就大大增加。若與其它病原如雞傳染性支氣管炎病毒、雞支原體、 雞傳染性喉氣管炎等并發(fā)感染后引起雞呼吸道疾病綜合征，會給養(yǎng)雞業(yè)造成更大的損失。 各種日齡的雞都易感該菌，常見于13周齡以上的雞，通常表現(xiàn)為低死亡率和高發(fā)病率，產(chǎn)蛋 率下降10%~40%。該病病理變化主要表現(xiàn)在上呼吸道急性卡它性炎癥典型癥狀是黏液性 鼻竇炎，鼻竇黏膜水腫充血、黏膜桿狀細(xì)胞滲出，并且伴隨有異噬性白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，產(chǎn) 生典型的鼻炎病變。臨床表現(xiàn)為面部單側(cè)或雙側(cè)腫脹、流鼻涕，食欲下降、產(chǎn)蛋率下降。
[0004] 雞傳染性鼻炎是一種呼吸道傳染病，目前主要靠滅活疫苗來控制。滅活疫苗的免 疫效果可能與所激發(fā)的黏膜抗體相關(guān)。研究表明A、B、C三個血清型的Apg均有不同程度的致 病力，但三者的滅活菌體不存在型間交叉免疫，只存在型內(nèi)交叉免疫保護(hù)。目前國際上普遍 使用的滅活疫苗絕大多數(shù)都包含了A型和C型，隨著國內(nèi)外陸續(xù)發(fā)現(xiàn)有大量B型Apg的流行和 發(fā)生，國際上影響較大的疫苗公司已經(jīng)開始提供包含A、B、C三種血清型的三價滅活疫苗。另 一方面，由于副雞禽桿菌含有LPS等毒素物質(zhì)，大量接種所帶來毒副作用也會影響雞的產(chǎn)蛋 與生長，因此導(dǎo)致了生產(chǎn)上免疫失敗時有發(fā)生。雞傳染性鼻炎滅活疫苗對野外雞群感染的 預(yù)防效果大約為70-80%，在其效力檢驗(yàn)中由于環(huán)境和評價方法的不盡一致可能會有不同 的結(jié)果。
[0005] 因此，需要研究更為安全有效的副雞禽桿菌疫苗，既不影響雞的產(chǎn)蛋與生長，又能 提高對雞傳染性鼻炎的防疫效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為彌補(bǔ)現(xiàn)有的副雞禽桿菌疫苗免疫效果欠佳的不足，本發(fā)明提供一種人工A型副 雞禽桿菌免疫保護(hù)性抗原蛋白，該抗原蛋白免疫原性強(qiáng)，能夠覆蓋多種副雞禽桿菌變異株， 利用該抗原蛋白可制備對A型副雞禽桿菌預(yù)防效果顯著的亞單位疫苗。
[0007] 本發(fā)明請求保護(hù)的技術(shù)方案如下：
[0008] -種人工A型副雞禽桿菌免疫保護(hù)性抗原蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0009] 一種A型副雞禽桿菌亞單位疫苗，其特征在于，其活性組分包括權(quán)利要求1所述的 人工A型副雞禽桿菌免疫保護(hù)性抗原蛋白。
[0010] 所述A型副雞禽桿菌亞單位疫苗，其特征在于，所述人工A型副雞禽桿菌免疫保護(hù) 性抗原蛋白的終濃度為l〇μg/ml。
[0011] 用于編碼所述人工A型副雞禽桿菌免疫保護(hù)性抗原蛋白的基因。
[0012] 所述基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0013] -種表達(dá)權(quán)利要求1所述的人工A型副雞禽桿菌免疫保護(hù)性抗原蛋白的重組表達(dá) 載體，其特征在于，其表達(dá)外源蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0014] 所述重組表達(dá)載體是大腸桿菌重組表達(dá)載體pET28a-P41，是利用Ncol和Xhol酶切 獲得SEQ ID N0:2所示的核苷酸片段，并連接到pET28a的Ncol與Xho頂每切位點(diǎn)之間所得。
[0015] -種表達(dá)權(quán)利要求1所述的人工A型副雞禽桿菌免疫保護(hù)性抗原蛋白的重組大腸 桿菌菌株，其特征在于，其包含權(quán)利要求7所述的重組表達(dá)載體pET28a-P41。
[0016] 權(quán)利要求1所述的人工A型副雞禽桿菌免疫保護(hù)性抗原蛋白的制備方法，其特征在 于，包括如下步驟：
[0017] 獲得權(quán)利要求6或7所述的重組表達(dá)載體，導(dǎo)入到表達(dá)系統(tǒng)中誘導(dǎo)表達(dá)獲得所述人 工A型副雞禽桿菌免疫保護(hù)性抗原蛋白。
[0018] 本發(fā)明利用在線抗原表位預(yù)測軟件http : / /www .cbs.dtu.dk/services/ BepiPred/，對A型副雞禽桿菌Hmtp210的基因（GenBank:KJ867495.1，全長6129bp)及其全蛋 白序列（2042個氨基酸殘基)進(jìn)行抗原表位分析，篩選免疫原性較強(qiáng)的抗原表位，并根據(jù)經(jīng) 驗(yàn)截取其中部分抗原表位，以便所得的抗原蛋白的大小適合于大量制備并具有良好的免疫 活性，最后將優(yōu)化的各抗原表位進(jìn)行拼接，獲得了SEQ ID NO: 1所示的一段融合肽，作為人 工A型副雞禽桿菌抗原蛋白，命名為P41。對該抗原蛋白P41的抗原特性進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析， Western Blotting實(shí)驗(yàn)證明了該抗原蛋白具有較好的免疫原性，使用該抗原蛋白免疫試驗(yàn) 雞后能保護(hù)試驗(yàn)雞只不受同型副雞禽桿菌感染。
[0019] 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)還表明，該抗原蛋白P41能夠針對多株流行的副雞禽桿菌，如Hp8、221、 0083等A型菌株，且保護(hù)效果優(yōu)于全菌常規(guī)滅活疫苗。利用本發(fā)明的抗原蛋白P41制備亞單 位疫苗，能夠明顯增強(qiáng)雞對副雞禽桿菌的抵抗力，有效預(yù)防副雞禽桿菌的感染。在本發(fā)明的 一個實(shí)施例中，攻毒保護(hù)率實(shí)驗(yàn)表明，采用P41抗原蛋白免疫的雞群在A型副雞禽桿菌攻毒 后，所有雞只沒有出現(xiàn)鼻炎癥狀，保護(hù)率為100%;采用全菌常規(guī)滅活疫苗免疫的雞群在攻 毒后3天內(nèi)有2-3只雞出現(xiàn)臨床癥狀，保護(hù)率為70~80%;而未進(jìn)行免疫的對照組雞群在攻 毒后全部出現(xiàn)鼻炎癥狀，發(fā)病率為100%。免疫組與非免疫組的保護(hù)率有極顯著差異。因此， 本發(fā)明的抗原蛋白是一種很好的免疫保護(hù)性抗原，其保護(hù)效果優(yōu)于全菌滅活疫苗，可以作 為副雞禽桿菌亞單位疫苗的候選抗原。
[0020]本發(fā)明還提供一種副雞禽桿菌亞單位疫苗，其活性組分包括上述副雞禽桿菌抗原 蛋白P41。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，將所述抗原蛋白P41與弗氏完全佐劑或不完全佐劑進(jìn) 行等體積混合乳化，制備副雞禽桿菌亞單位疫苗。在本發(fā)明的另一些實(shí)施例中，所述抗原蛋 白P41還可以與本領(lǐng)域已知的能夠作為禽類疫苗的其它蛋白或滅活菌聯(lián)用，制備聯(lián)合疫苗。 [00 21]所述亞單位疫苗中副雞禽桿菌抗原蛋白的終濃度優(yōu)選為10μg/ml。
[0022]本發(fā)明還提供所述人工A型副雞禽桿菌免疫保護(hù)性抗原蛋白的制備方法。其表達(dá) 系統(tǒng)可以采用原核表達(dá)系統(tǒng)或真核表達(dá)系統(tǒng)，原核表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)選大腸埃希氏菌BL21(DE3)， 真核表達(dá)系統(tǒng)可以是酵母菌或原生質(zhì)體。相應(yīng)地，選用與之匹配的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)化條件、表 達(dá)條件及蛋白提取方法進(jìn)行抗原蛋白的制備。
【附圖說明】
[0023]圖1.本發(fā)明實(shí)施例提供的pET28a質(zhì)粒圖譜。
[0024]圖2.本發(fā)明重組抗原蛋白P41基因 PCR擴(kuò)增結(jié)果，其中1為目的基因的擴(kuò)增片段，Μ 為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。
[0025] 圖3.表達(dá)質(zhì)粒pET_28a雙酶切鑒定結(jié)果，1為pET_28a質(zhì)粒的Ncol/Xhol雙酶切結(jié) 果;Μ為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。
[0026] 圖4.pET-28a-p41NcoI/XhoI雙酶切鑒定結(jié)果，1為重組質(zhì)粒的雙酶切結(jié)果;Μ為DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)。
[0027]圖5.本發(fā)明重組蛋白SDS-PAGE分析圖，其中Μ為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1為誘導(dǎo)前總蛋 白；2為37°C誘導(dǎo)后裂解上清;3為37°C誘導(dǎo)裂解后沉淀。
[0028] 圖6.重組蛋白純化過程SDS-PAGE分析圖，其中Μ為蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量，1為10mM咪唑 洗脫液，2為25mM咪唑洗脫液，3為100mM咪唑洗脫液，4為500mM咪唑洗脫液。
[0029] 圖7 .本發(fā)明重組抗原蛋白P41Western_blotting檢測結(jié)果，其中，Μ為蛋白標(biāo)準(zhǔn)分 子量，1為純化后的Ρ41抗原蛋白。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 以下通過具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，需要理解的是，下述實(shí)施例僅作為 解釋和說明，而不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0031] 實(shí)驗(yàn)材料 [0032] 1.質(zhì)粒與菌株
[0033]本發(fā)明采用的pET28a質(zhì)粒(Pharmacia公司產(chǎn)品，購自北京百靈克生物技術(shù)有限責(zé) 任公司）；圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的pET28a質(zhì)粒圖譜。
[0034]大腸埃希氏菌BL21(DE3)感受態(tài)購自北京天根生物技術(shù)有限公司。
[0035] 本發(fā)明所用菌株為副雞禽桿菌221，0083、Hp8、M〇deSt〇菌株，購自中國北京中國獸 醫(yī)藥品監(jiān)察所，屬于商業(yè)菌株。
[0036] 2.主要試劑與耗材
[0037] 氯化鈉、EDTA二鈉鹽、乙醇、甲醇、麗春紅S、三氯乙酸(TCA)，購自上海國藥公司。 [0038] Tris堿(Tris-HCL)、二硫蘇糖醇(DTT)、甘油、十二烷基磺酸鈉(SDS)、丙烯酰胺、過 硫酸銨、四甲基乙二胺(TEMED)，碳酸鈉、乙酸鈉，購自上海生工生物工程技術(shù)有限公司。 [0039] 甘氨酸、考馬斯亮藍(lán)R-250，購自AMRESC0公司。
[0040] 牛血清白蛋白（BSA)、胰酶、蛋白酶抑制劑(PMSF)、甲醛，購自Sigma公司。
[00411 蛋白酶K(貯存液濃度為20mg/ml，使用液濃度為lmg/ml)，購自上海華舜生物工程 有限公司。
[0042]卡納青霉素(kanamycin)、胎牛血清、誘導(dǎo)劑IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷），購 自 Invitrogen公司。
[0043] 吸頭與離心管，購自AxyGen公司。
[0044] Taq酶及l(fā)OTaq酶Buffer、NcoI、Xho I等核酸內(nèi)切酶及相關(guān)Buffer、T4連接酶及10 父丁4連接酶81^€61、1?仙86、0嫩1^11?^(01^-2000、01^-15000)均為寶生物（大連）有限公司產(chǎn) 品。
[0045]柱式離心式DNA凝膠回收試劑盒、辣根過氧化物酶（HRP)標(biāo)記的兔抗雞I gG購自 Sigma公司。
[0046] 底物液配制:底物液A: 0.006 % H2〇2緩沖液;底物液B:取Na2HP〇4.12H20 14.2g，檸檬 酸10.5g，用雙蒸水定容至500mL配成0.1磷酸鹽梓檬酸緩沖液(pH5.0)，然后加上聯(lián)苯二胺 (TMB)。使用時將A液和B液等體積混合，混合后5分鐘內(nèi)使用，現(xiàn)配現(xiàn)用。
[0047] 大腸桿菌培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)液及固體培養(yǎng)基:每升含酵母提取物5g，胰蛋白胨 10g，NaCl 10g，用 10mol/L NaOH調(diào)pH至7·5，121 °C高壓滅菌20min，4°C保存?zhèn)溆?。在?00暈 升LB液體培養(yǎng)基中加入1.5g瓊脂即為固體LB培養(yǎng)基，121°C高壓滅菌20min，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0048] 副雞禽桿菌培養(yǎng)基TSB、TSA，及弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑均購自Sigma公司。
[0049] 純化副雞禽桿菌抗原蛋白采用Sepharose 4B純化柱(Amershan Pharmacia公司產(chǎn) 品)購自北京百靈克生物技術(shù)有限公司。
[0050] PBS緩沖液：NaCI 8.0g，KCl 0.2g，KH2P〇4 0.24g，Na2HP〇4 · 12H20 3.628g，溶于 800ml蒸餾水中，用鹽酸調(diào)pH值為7.4，蒸餾水定容至1000ml，121°C高壓滅菌20min，室溫保 存。
[0051] Western-blotting 緩沖液：
[0052] 電轉(zhuǎn)緩沖液:39mmol/L甘氨酸，48mmol/L Tris堿，0.037%SDS(電泳級），20% 甲 醇。配制l〇〇〇mL轉(zhuǎn)移緩沖液，需稱取2.9g甘氨酸，5.8g Tris堿，0.37g SDS，加200mL甲醇，加 ddH20至總量為1 OOOrnL。
[0053] TBS(pH8.0)緩沖液：10mmol/L Tris.HCl，150mmol/L NaCl。
[0054] TBST緩沖液:在上述TBS中加入終濃度為0 · 05 % Tween-20即可。
[0055] 剛春紅S( 10 X )|C存液：2g剛春紅S，30g三氯乙酸，30g磺基水楊酸，加 dd H2〇至 100mL〇
[0056] 3.試驗(yàn)動物:6周齡SPF雞，購自北京梅里亞維通SPF雞實(shí)驗(yàn)動物中心。
[0057] 本發(fā)明實(shí)施例中未特別說明的生物化學(xué)試劑，均為本領(lǐng)域常規(guī)試劑，可以商購獲 得，或通過本領(lǐng)域常規(guī)方法配制而得，規(guī)格為實(shí)驗(yàn)室純級即可。
[0058] 實(shí)施例1、副雞禽桿菌抗原表位的預(yù)測
[0059] 利用在線預(yù)測軟件(http ://www. cbs .dtu. dk/services/BepiPred/)對A型副雞禽 桿菌221株外膜蛋白的編碼基因 (GenBank No.KJ867495.1)進(jìn)行抗原表位預(yù)測，根據(jù)預(yù)測結(jié) 果多次優(yōu)化，從獲得的幾百個抗原表位中篩選免疫原性較強(qiáng)的表位，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)截取其中部 分表位，使最后拼接而成的抗原蛋白易于表達(dá)并具有良好的免疫活性。
[0060] 將優(yōu)化的抗原表位序列進(jìn)行拼接，獲得了副雞禽桿菌重組抗原蛋白P41，其氨基酸 序列如SEQ ID N0:1所示。
[0061 ]實(shí)施例2、副雞禽桿菌重組抗原蛋白P41的原核表達(dá) [0062] 1.目的基因及其引物的合成
[0063]將SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列送華大科技(北京）有限公司進(jìn)行全序列合成， 得到長度為l〇85bp的副雞禽桿菌重組抗原蛋白P41的目的基因。
[0064] 根據(jù)目標(biāo)基因的序列設(shè)計上、下游引物，并在上、下游引物中分別引入Ncol和Xhol 酶切位點(diǎn)，得到SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4所示的引物，由華大科技(北京)有限公司合成。 [0065] 2.重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
[0066] 2.1目標(biāo)蛋白編碼基因的PCR擴(kuò)增
[0067]以步驟1中人工合成的P41目的基因?yàn)槟０?，按照下列反?yīng)體系和程序進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，獲得大量的目的基因片段。
[0068] PCR反應(yīng)體系：
[0069] PCR各個成分的用量：（其中引物濃度為10D溶于400μ1 ddH20)
[0073] 72'C 5min
[0074] 2.2換載酶切
[0075] 將步驟2.1中獲得的PCR產(chǎn)物按照下列反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行酶切。
[0076] PCR產(chǎn)物片段酶切體系（50ul): 純化回收好的片段 lug (20μ1) 1〇χ FD BuIVcr 5μΙ
[0077] Nc〇\ 1μΙ(10ιι/μΙ) Xho\ 1 μL (lOu/μΙ) dd 賊 23μ1
[0078] 以上體系放入37 °C恒溫水浴鍋中反應(yīng)2h。
[0079] 2.3酶切后的PCR產(chǎn)物回收
[0080]采用北京天根生化技術(shù)有限公司的普通DNA膠回收試劑盒回收DNA片段，按照試劑 盒說明書的步驟進(jìn)行，具體操作如下：
[0081] (1)用0.8%的瓊脂糖膠電泳，使目的DNA片段與其它DNA盡可能分開，在長波紫外 燈下，用在酒精燈火焰上燒過的手術(shù)刀片切下含有目的DNA片段的瓊脂塊，放入1.5ml滅菌 離心管中，稱取重量。
[0082] (2)向離心管中加入3倍體積的溶膠液；（如重為O.lg的凝膠，體積可視為100μΙ，依 此類推）。55°(：-60°(：水浴放置lOmin，其間不斷溫和地上下翻轉(zhuǎn)離心管，以確保膠塊充分溶 解。如果還有未完全溶解的膠塊，可多放置幾分鐘或是補(bǔ)加溶膠液，直至膠塊溶解完全(若 膠塊的體積過大，可先將膠塊切成碎塊）。
[0083] (3)將向吸附柱中加入上步所得的溶液（吸附柱預(yù)先放入收集管中），室溫靜置 lmin，然后12000r/min離心2min，倒掉廢液，將吸附柱重新放回到收集管中。
[0084] (4)向吸附柱中加入700yL的漂洗液（已加入無水乙醇），12000r/min離心lmin，倒 掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中。
[0085] (5)向吸附柱中加入700yL漂洗液，12000r/min離心lmin，倒掉廢液。
[0086] (6)將吸附柱放回收集管中，12000r/min空離心2min，盡量的去除漂洗液。將吸附 柱置于室溫放置數(shù)分鐘，徹底晾干。
[0087] (7)將吸附柱放入一個無菌的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加適量洗脫緩 沖液EB，室溫放置211^11。1200(^/1^11離心21^11收集0嫩溶液。
[0088]離心管中的液體即為回收的DNA片段，可立即使用或保存于-20°C備用。
[0089] 結(jié)果參見圖2，圖2為本發(fā)明重組抗原蛋白P41基因 PCR擴(kuò)增結(jié)果，由圖2可知，PCR擴(kuò) 增結(jié)果顯示該片段的大小約為l〇85bp左右，與理論上預(yù)期的Apg P41基因序列大小1085bp 基本一致。
[0090] 2.4表達(dá)載體的酶切及回收 [0091]載體的酶切體系（50μ1): ρΕΤ28Α 1μ§ 1〇χ FD Buffer 5μ1
[0092] Λ;γο 1 iVi 1 μ! (1 Ou/μL) Xho\ ^ 1 μ丨（lOu/μΙ) ddHO 42μ1
[0093] 以上體系放入37 °C恒溫水浴鍋中反應(yīng)2h。
[0094] PET28a酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖如圖3所示。回收酶切的載體片段，方法及步 驟同2.3PCR產(chǎn)物回收的方法及步驟。
[0095] 2.5目的片段與載體連接
[0096] 將回收純化好的目的基因片段和載體按照下列體系和條件進(jìn)行連接。
[0097]連接體系（20μ1): 酶切目的片段： 8μ1 酶切載體ρΕΤ28Α 4μ1
[0098] |〇χ Τ4 DNAIigase Buffet 2μ! T4 DNAligasc 1 μ I (Su/μL) ddH20 補(bǔ)允個： 20μΙ
[0099] 上述連接混合液放在22°CPCR儀lh即可。
[0100] 2.6轉(zhuǎn)化并篩選陽性克隆
[0101] 取感受態(tài)細(xì)胞ΤορΙΟ 100μΙ加入到1.5ml EP管中，將連接后的重組質(zhì)粒pET28a-P41各5-10μ1加入并混勻。置冰上30min后，42°C熱激90sec，冰浴3min-5min。加入400μ1 LB， 于37 °C 200rpm振蕩培養(yǎng)45min使其復(fù)蘇。復(fù)蘇后的重組大腸桿菌懸液于4 °C 25000rpm離心 lOmin，棄去400μ1上清，用剩余的100μΙ重懸沉淀并涂布于含有25μg/ml Kana的LB瓊脂平 板。37°C增殖lh，再將平板翻過來，倒置37°C培養(yǎng)1 4h-l 6h至菌落出現(xiàn)。
[0102] 2.7重組質(zhì)粒的酶切鑒定
[0103]質(zhì)粒的提取:使用堿裂解法(參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版.黃培唐等譯，北京， 科學(xué)出版社，2002版介紹的方法)進(jìn)行，具體操作步驟如下：
[0104] (1)用滅菌牙簽在LB平板上隨機(jī)挑取數(shù)個單茵落，分別接種于3ml 25μg/ml卡那霉 素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜。
[0105] (2)將菌液轉(zhuǎn)入1.5ml離心管內(nèi)，于4°C8000rpm離心l-3min，棄上清，再將剩余的 1.5ml菌液重復(fù)離心，倒立離心管于吸水紙上，使液體流盡。
[0106] (3)加 100μΙ冰預(yù)冷的溶液I，渦旋使菌體充分懸浮，再加入200μ1新配制的溶液II， 反復(fù)顛倒離心管數(shù)次，冰浴5min，最后加150μ1冰預(yù)冷的溶液III，溫和顛倒離心管數(shù)次，冰 浴10min〇
[0107] (4)于4°C以12000rpm離心10min，吸取上清至另一支1.5ml離心管中，加入等體積 的異丙醇，混和均勻，室溫靜置5min。
[0108] (5)室溫12000rpm離心10min，棄上清，沉淀用75%冷乙醇漂洗后，按照常規(guī)真空干 燥或自然干燥方法干燥。
[0109] (6)沉淀用 200μ1 含 Rnase(20μg/ml)的 ΤΕ(ρΗ8·0)溶解，56°C 水浴 30min 或 37°C 水浴 lh以除去RNA。
[0110] (7)加7.5mol/L NH4Ac 100μ1，室溫靜置5min，再于室溫 12000rpm離心5min。
[0111] (8)吸取上清到另一 1.5ml的EP管中，加入2倍體積的冷無水乙醇，冰浴置10min。
[0112] (9)于4°C12000rpm離心10min，棄上清，沉淀用75%冷乙醇漂洗后，真空干燥后溶 于20μ1 ddH20或TE (pH8.0)，置-20 °C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0113] 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定:利用Ncol+Xhol酶切重組質(zhì)粒，酶切后應(yīng)出現(xiàn)預(yù)期大小的 外源片段和載體片斷即為正確的重組質(zhì)粒。
[0114] 挑取PCR鑒定的陽性菌落，提取質(zhì)粒，分別用Ncol和Xhol對重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切， 結(jié)果參見圖4。由圖4可知，pET28a質(zhì)粒片段大小為5369bp，P41基因的大小為1085bp，與預(yù)期 結(jié)果一致。
[0115] 3.重組表達(dá)菌株的構(gòu)建
[0116] 取感受態(tài)細(xì)胞BL21 (DE3) 100μΙ加入到1.5ml EP管中，將重組質(zhì)粒pET28a-P41各 0.5μ1加入并混勻。置冰上30min后，42°C熱激90秒，冰浴3min-5min。
[0117] 將其涂布于含有25μg/ml Kana的LB瓊脂平板。37°C置lh，再將平板翻過來，倒置37 °C培養(yǎng)14h-16h至菌落出現(xiàn)。
[0118] 4.目的基因在大腸桿菌中的表達(dá)及純化
[0119] 4.1目的基因的誘導(dǎo)表達(dá):將含重組抗原蛋白pET28a_P41的表達(dá)菌株接種于含有 25μg/mlKana的3mL LB液體培養(yǎng)基，于37°C搖床培養(yǎng)。從培養(yǎng)好的菌液中取100μΙ接種于 10mL含有25μg/ml Kana的新鮮LB液體培養(yǎng)基中，于37°C振蕩培養(yǎng)約3h，至0D6Q()達(dá)到0.6-1.0 時，加 IPTG至終濃度為0.8mmol，繼續(xù)培養(yǎng)3h后收集菌體。
[0120] 4.2表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳分析
[0121] (l)SDS-PAGE及Western Blot相關(guān)溶液配制
[0122] 10%過硫酸胺(APS):過硫酸胺0. lg，加 ddH2〇至lml于EP管中，現(xiàn)配現(xiàn)用。
[0123] 1.5mol/L Tris-HCl(pH8.8):Tris 18.17g，溶于80ml ddH20中，濃HC1 調(diào)pH至8.8， 定容至100ml，室溫保存。
[0124] lmol/L Tris-HCl(pH6.8):Tris 12.1g，溶于80ml ddH20中，濃HC1 調(diào)pH至6.8,定 容至100ml，室溫保存。
[0125] lmol/L Tris-HCl(pH7.5):Tris 30.29g，溶于200ml ddH20中，濃HC1 調(diào)pH至7.5， 定容至250ml，室溫保存。
[0126] 10%SDS:SDS 10g，加 ddH20定容至100ml，50°C水浴溶解后室溫保存。
[0127] 5XTris-甘氨酸電泳緩沖液(pH 8.3):Tris 15.1g，甘氨酸94g，SDS 5g，加 ddH20 定容至1000ml，臨用時稀釋5倍。
[0128] lmol/L DTT:稱DTT 7.71g溶于50ml 0.01mol/LNaAc(pH5.2)后過濾除菌，分裝成 小份于_20°C保存。
[0129] 2XSDS上樣緩沖液：lmol/L Tris-HCl(pH6.8)10ml，SDS 4g，溴酚藍(lán)0.2g，甘油 20ml，加 ddH20至100ml，臨用時加 lmol/L DTT使其終濃度為0.2mol/L。
[0130] 考馬斯亮藍(lán)染液：甲醇30ml，ddH20 60ml，10ml冰乙酸，充分混勻后加入0.25g考馬 斯亮藍(lán)，用濾紙過濾后至棕色瓶內(nèi)室溫保存。
[0131 ] 脫色液：甲醇30ml，ddH2〇 60ml，10ml冰乙酸，充分混勾。
[0132] 蛋白轉(zhuǎn)印緩沖液:Tris 5.82g，甘氨酸2.93g，甲醇300ml，加 ddH20定容至1000ml。
[0133] TBS: lmol/L Tris-HCl(pH7.5) 10ml，NaCl 8.8g，加 ddH20定容至 1000ml。
[0134] TBST:20%Tween-20 2.5ml，加 TBS定容至 1000ml，充分混勻。
[0135] 封閉液:5g脫脂奶粉加入到100ml TBS中，充分溶解后4°C保存。
[0136] 稀釋液：lg脫脂奶粉加入到100ml TBS中，充分溶解后4°C保存。
[0137] (2) SDS-PAGE電泳樣品的制備：
[0138] 將誘導(dǎo)后的重組大腸桿菌于8000r/min離心15min。沉淀用1/10體積的50mmol/ LTris-Cl (pH7.5)重懸，并加入溶菌酶至終濃度lmg/ml，冰浴30min。冰浴條件下進(jìn)行超聲碎 破，直至菌液不再粘稠，l〇〇〇〇r/min，離心30min。分別取少量裂解后的上清和沉淀，加入2X 蛋白電泳上樣緩沖液125μ1，DTT 25μ1及TE液100μΙ，震蕩混勻，100°C煮沸l(wèi)Omin，12000r/ min離心5min，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。
[0139] (3)SDS聚丙烯酰胺凝膠的配制及電泳
[0140] SDS-PAGE凝膠配制方法如表1所示：
[0141] 表1 SDS-PAGE凝膠配制方法
[0142]
[0143] 15%的分離膠配制:將各成分加入后迅速混合，加入制膠板中，上面加純化水。然 后，再配制5%濃縮膠:將表中相關(guān)各成分加入后迅速混合，加入制膠板的分離膠的上面(先 將分離膠上面的純化水倒干凈），灌滿后插入加樣梳。
[0144] 待濃縮膠凝固后，取下梳子;將凝膠固定于電泳裝置上，加入足夠量的Tris-甘氨 酸電泳緩沖液，在加樣孔中分別加入各樣品：電泳電壓200V，電流在20mA-40mA范圍內(nèi)，電泳 lh，至溴酚藍(lán)泳出膠底面，終止電泳。
[0145] (4)聚丙烯酰胺凝膠染色與脫色
[0146] 卸下凝膠，用考馬斯亮藍(lán)R250染色液染色30min，再用脫色液進(jìn)行脫色lmin，觀察 結(jié)果。
[0147] 結(jié)果如圖5所示，將含有陽性重組質(zhì)粒的大腸埃希菌以ImM IPTG誘導(dǎo)37°C誘導(dǎo)表 達(dá)后，并經(jīng)SDS-PAGE檢測，結(jié)果約在41Ku處見表達(dá)條帶，與預(yù)期蛋白大小相一致，未誘導(dǎo)菌 沒有此蛋白。誘導(dǎo)后裂解上清中的蛋白含量高于沉淀，純化時可以直接使用裂解上清，省去 包涵體變性復(fù)性的步驟。
[0148] 4.3重組蛋白的制備及純化
[0149] 1)挑取含陽性重組表達(dá)質(zhì)粒的重組菌的單菌落，接種于3mL Kana/LB培養(yǎng)基中，37 °C活化過夜后，1:100稀釋到Kana/LB中，37 °C、230r/min振搖培養(yǎng)至對數(shù)生長期(0D_ 0.6 ~1)，加入終濃度為lmm〇l/L的IPTG，于37°C、230r/min振搖誘導(dǎo)培養(yǎng)6-8h。分別于誘導(dǎo)前和 誘導(dǎo)后不同時間取出lmL，5,000r/min離心10min收集菌體，棄上清后加入2XSDS上樣緩沖 液，煮沸l(wèi)Omin，用12 %的十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進(jìn)行檢查，并 用Quantity One-4.3. l(BIO-RAD)軟件分析表達(dá)產(chǎn)量。
[0150] 2)收集500mL經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)6h后的菌液，8000r/min離心10min，沉淀用5mL的lOmmol/ L PBS溶解，超聲波破碎后，12,000r/min離心10min后，收集每次離心后的上清，然后進(jìn)行 SDS-PAGE電泳檢測。
[0151] 3)利用鎳瓊脂糖親和層析原理處理經(jīng)超聲波裂解后的菌體上清液，具體操作如 下：
[0152] ①取5mLNi-IDA，用10倍柱床體積的Binding buffer清洗平衡柱子，流速5mL/min。
[0153 ]②樣品（裂解液上清)上柱，流速為2mL/min，收集穿透液。
[0154] ③10倍柱床體積的Binding buffer清洗柱子，流速10mL/min。
[0155] ④Wash Buffer洗雜，流速5ml/min，收集洗脫液。
[0156] ⑤Elution Buffer冼脫，流速2ml/min，收集洗脫液。
[0157] ⑥將純化后的蛋白置于透析袋中，在PBS，緩沖液(pH=7.4)中緩慢透析，收集透析 后的樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析。
[0158] 注：Binding BufTer(PBS，0.5%T;riton Χ_100，ρΗ=7·4)
[0159] Wash bufTer-10(PBS，10mM咪挫，ρΗ=7·4)
[0160] Wash buffer-25(PBS，25mM咪唑，ρΗ=7·4)
[0161] Elution BufTer-100(PBS，100mM咪挫，ρΗ=7·4)
[0162] Elution Buffer-500(PBS，500mM咪唑，ρΗ=7·4)
[0163] 結(jié)果如圖6所示，濃度為500mM咪唑的洗脫液洗脫效果最好;P41蛋白經(jīng)純化后，獲 得了較純的目的蛋白。
[0164] 實(shí)施例3、重組抗原蛋白的特性分析
[0165] 1.用Western-blot方法分析重組抗原蛋白的抗原性
[0166] 將上述純化的重組抗原蛋白P41按照常規(guī)方法進(jìn)行SDS-PAGE電泳，其步驟是：
[0167] 1)轉(zhuǎn)移:切出6張 Whatman 3M濾紙和1張硝酸纖維膜(NC膜），濾紙和膜的大小要和 凝膠的大小完全相等或略小于凝膠，用鉛筆在濾膜一角作標(biāo)記，確保轉(zhuǎn)印后膜與凝膠的相 對方向；將硝酸纖維膜在純化水中浸泡5min;在另一淺托盤中加入少量轉(zhuǎn)移緩沖液，將6張 Whatman 3M濾紙浸泡于其中。然后按照如下步驟安裝轉(zhuǎn)移電泳槽:平放石墨電極的底座（陽 極），依次放3層3M濾紙、硝酸纖維膜、聚丙烯酰胺凝膠和3層3M濾紙。徹底排除各層間的氣 泡:將轉(zhuǎn)移電泳槽的上蓋扣到石墨電極一轉(zhuǎn)移膜膠復(fù)合體上;連接電源，根據(jù)凝膠板面積按 照0.65mA/cm 2-l. 0mA/cm2的參數(shù)接通電流，電泳轉(zhuǎn)移0.5h-2h。
[0168] 2)麗春紅染色:轉(zhuǎn)移結(jié)束后，取下NC膜，于去離子水中漂洗2次-3次后，轉(zhuǎn)移至麗春 紅染色液中染色5min-10min，觀察轉(zhuǎn)印效果，并用鉛筆標(biāo)出蛋白Marker位置;室溫下用去離 子水漂洗硝酸纖維膜直至顏色褪去;將NC膜置于5 %的脫脂奶粉中，室溫封閉2h;洗膜:棄封 閉液，用1 X TBST洗NC膜3遍，每次5min;
[0169] 3)-抗孵育:將NC膜放入用5%的脫脂奶粉稀釋的雞抗Apg型菌陽性血清(本實(shí)驗(yàn) 室用Apg 221株免疫SPF雞制備，可對外提供;也可以自己制備）（體積比1:50)，37°C孵育lh;
[0170] 洗膜:取出NC膜，用1 X TBST洗膜3次，每次1 Omin:
[0171] 4)二抗孵育:將膜轉(zhuǎn)入5%的脫脂奶粉稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗雞IgG抗體(體積比1: 5000)，37°C孵育2h;洗膜取出NC膜，用1 X TBST洗膜3次，每次lOmin;
[0172] 5)顯色:將NC膜置于新配置的DAB顯色液中，置暗處顯色，待蛋白帶的顏色深度達(dá) 到要求后，用1 X TBST、沖洗以終止反應(yīng)。
[0173] 2.重組蛋白抗血清的制備
[0174] 1)疫苗的制備及免疫試驗(yàn)
[0175] 重組抗原蛋白疫苗的制備:將重組抗原蛋白P41與弗氏完全佐劑等體積混合乳化， 使疫苗中抗原蛋白終濃度為l〇μg/ml。第二次免疫用疫苗采用弗氏不完全佐劑。
[0176]免疫方法:給所述的42日齡試驗(yàn)SPF雞接種弗氏完全佐劑乳化的重組蛋白疫苗(接 種量為0.2ml/只）；2周后腹腔接種弗氏不完全佐劑乳化的重組蛋白疫苗(接種量為0.2ml/ 只）；間隔1 〇天后于翅靜脈采血，收集血清。
[0177] 血清特異性抗體的檢測:采用ELISA方法，具體步驟為：
[0178] 使用純化的重組抗原蛋白P41 lyg/100yl于4°C過夜包被酶聯(lián)板，1%BSA 37°C封 閉lh，洗滌液洗板1次后封裝于-20°C保存。
[0179]將加強(qiáng)免疫一周后的雞采血分離血清，倍比稀釋后取100μΙ加入酶聯(lián)板，同時設(shè)弗 氏佐劑對照和空白對照。
[0180] 37Γ 反應(yīng) 30min。
[0181] 洗板3次后加入體積比1:5，000稀釋的兔抗雞IgY(H+L)-HRP，37 °C反應(yīng)30min。
[0182] 洗板5次后加 100μΙ底物液，避光顯色lOmin后加入2 %H2S〇4終止反應(yīng)，于630nm讀 數(shù)。
[0183] 樣品與對照組0D值之比大于2的血清判為血清ELISA抗體陽性。
[0184] 本發(fā)明重組抗原蛋白P41Western-blotting檢測結(jié)果參見圖7。由圖7可知，重組質(zhì) 粒表達(dá)蛋白的大小為41Ku，而采自雞康復(fù)陽性血清與表達(dá)蛋白約在41Ku處發(fā)生了反應(yīng)與預(yù) 期結(jié)果相符。說明本發(fā)明的重組抗原蛋白具有良好的抗體結(jié)合活性。
[0185] 實(shí)施例4、重組抗原蛋白對SPF雞免疫效力試驗(yàn)
[0186] 1.重組抗原蛋白疫苗制備及免疫方法
[0187] 1.1重組抗原蛋白疫苗的制備
[0188] 將重組抗原蛋白P41與弗氏完全佐劑等體積混合乳化，使疫苗中抗原蛋白終濃度 為l〇μg/ml用于首次免疫，第二次免疫使用弗氏不完全佐劑，其余組分與首免相同。
[0189] 全菌滅活疫苗制備:將副雞禽桿菌221株菌經(jīng)純培養(yǎng)后，挑取單個菌落8~10個，涂 于TSA平板上(含10%滅活牛血清）。37°(：培養(yǎng)16h~18h后，用滅菌的0.01m 〇l/L PBS將平板 上的菌苔洗下，稀釋至7.5X109cfu/ml，用甲醛滅活(3%〇)24h~48h，然后與弗氏佐劑按1:1 體積混合乳化，終濃度達(dá)到3.0 X 109cfu/ml。
[0190] 1.2免疫方法
[0191] 42日齡SPF試驗(yàn)雞90只，分為3組，每組30只。分別是P41蛋白組，全菌滅活菌苗組和 PBS對照組。各組試驗(yàn)雞胸部肌肉分別免疫弗氏佐劑乳化的亞單位疫苗(P41)、全菌滅活疫 苗(221)或PBS各0.5ml/只；4周后相同劑量、相同途徑加強(qiáng)免疫。期間每兩周翅靜脈取血，用 于血清特異性抗體的監(jiān)測。
[0192] 血清抗體的檢測采用ELISA方法，同實(shí)施例3。
[0193] 1.3免疫雞攻毒試驗(yàn)
[0194] 對加強(qiáng)免疫4周后的SPF雞進(jìn)行攻毒試驗(yàn)。各試驗(yàn)組內(nèi)再分成3組進(jìn)行攻毒，每組10 只，分別在眶下竇接種1 X l〇6CFU劑量的A型副雞禽桿菌株菌221株，Hp8株和0083株。連續(xù)觀 察三天，記錄試驗(yàn)雞的臨床特征及死亡情況，評價重組抗原蛋白的免疫保護(hù)力，結(jié)果參見表 2，表2為本發(fā)明重組蛋白P41亞單位疫苗免疫SPF雞后對Apg菌株攻毒的保護(hù)結(jié)果。
[0195] 表2本發(fā)明重組蛋白P41免疫SPF雞后對Apg菌株攻毒的保護(hù)結(jié)果
[0198] *重組蛋白免疫組獲得免疫保護(hù)的試驗(yàn)雞數(shù)與PBS對照組比較，差異顯著。
[0199] 由表2可知，本發(fā)明提供的重組蛋白作為抗原的疫苗免疫效果顯著。分別用原核表 達(dá)的重組蛋白P41免疫，2次免疫后用A型Apg強(qiáng)毒攻擊，非免疫對照組所有試驗(yàn)雞陸續(xù)發(fā)病。 P41免疫組A型攻毒后沒有雞只表現(xiàn)出鼻炎癥狀，保護(hù)率為100%;全菌滅活疫苗免疫組在攻 毒后3天內(nèi)有2-3只雞出現(xiàn)臨床癥狀，保護(hù)率為70~80%。重組蛋白的保護(hù)率優(yōu)于全菌滅活 疫苗的保護(hù)效果，與非免疫組相比，有極顯著差異。由于純化蛋白不含全菌體所攜帶的脂多 糖等成分，本發(fā)明制備的亞單位疫苗沒有副反應(yīng)，而全菌滅活疫苗會有一過性食欲下降，精 神萎靡等副反應(yīng)。從制備成本上說，亞單位疫苗由于培養(yǎng)誘導(dǎo)容易，培養(yǎng)基便宜，容易純化 等特點(diǎn)，也低于常規(guī)滅活菌苗。
[0200] 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng) 視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種人工A型副雞禽桿菌免疫保護(hù)性抗原蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。2. -種A型副雞禽桿菌亞單位疫苗，其特征在于，其活性組分包括權(quán)利要求1所述的人 工A型副雞禽桿菌免疫保護(hù)性抗原蛋白。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的A型副雞禽桿菌亞單位疫苗，其特征在于，所述人工A型副雞禽 桿菌免疫保護(hù)性抗原蛋白的終濃度為l〇μg/ml。4. 用于編碼權(quán)利要求1所述的人工A型副雞禽桿菌免疫保護(hù)性抗原蛋白的基因。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。6. -種表達(dá)權(quán)利要求1所述的人工A型副雞禽桿菌免疫保護(hù)性抗原蛋白的重組表達(dá)載 體，其特征在于，其表達(dá)外源蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組表達(dá)載體，其特征在于，是大腸桿菌重組表達(dá)載體 pET28a-P41，是利用NcoI和XhoI酶切獲得SEQ ID N0:2所示的核苷酸片段，并連接到pET28a 的NcoI與Xho頂每切位點(diǎn)之間所得。8. -種表達(dá)權(quán)利要求1所述的人工A型副雞禽桿菌免疫保護(hù)性抗原蛋白的重組大腸桿 菌菌株，其特征在于，其包含權(quán)利要求7所述的重組表達(dá)載體pET28a-P41。9. 權(quán)利要求1所述的人工A型副雞禽桿菌免疫保護(hù)性抗原蛋白的制備方法，其特征在 于，包括如下步驟： 獲得權(quán)利要求6或7所述的重組表達(dá)載體，導(dǎo)入到表達(dá)系統(tǒng)中誘導(dǎo)表達(dá)獲得所述人工A 型副雞禽桿菌免疫保護(hù)性抗原蛋白。
【文檔編號】C07K14/285GK105949287SQ201610497198
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年6月29日
【發(fā)明人】王宏俊, 李淑芳, 龔玉梅, 張培君, 李桂萍
【申請人】北京市農(nóng)林科學(xué)院