一種定量檢測(cè)實(shí)際水樣中鉛離子濃度的硅基sers芯片及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及環(huán)境監(jiān)測(cè)領(lǐng)域，公開(kāi)了一種定量檢測(cè)實(shí)際水樣中鉛離子濃度的硅基SERS芯片及其制備方法。該芯片由銀納米顆粒修飾的硅晶片、金納米顆粒、SEQ ID NO:1、2、4所示核苷酸序列，以及在SEQ ID NO:3所示核苷酸序列5’端偶聯(lián)巰基、3’端偶聯(lián)熒光染料的序列片段組成。本發(fā)明用多聚腺嘌呤輔助的表面增強(qiáng)拉曼散射硅基芯片用于鉛離子檢測(cè)，所述芯片由核(銀)?衛(wèi)星(金)納米顆粒修飾的硅晶片構(gòu)成，共價(jià)連接在芯片上的DNAzyme可以被鉛離子特異性激活，使得substrate strand斷裂成兩段自由的DNA，因而可檢測(cè)到較強(qiáng)的SERS信號(hào)，達(dá)到較高的靈敏度、特異性、可重現(xiàn)性以及可循環(huán)性。
【專利說(shuō)明】
一種定量檢測(cè)實(shí)際水樣中鉛離子濃度的硅基SERS芯片及其制 備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及環(huán)境監(jiān)測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種定量檢測(cè)實(shí)際水樣中鉛離子濃度的 硅基SERS芯片及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 鉛離子是環(huán)境中最危險(xiǎn)的重金屬離子之一，存在多種源頭例如食物、血液、飲用 水、工業(yè)廢水等等。研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)食物鏈和飲用水鉛污染會(huì)對(duì)人類特別是兒童的神經(jīng)系 統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、智力發(fā)展等造成嚴(yán)重的傷害(參見(jiàn)：Int · J ·Hyg·Environ ·Health 2008，211， 345-351; Annu. Rev.Med. 2004,55,209-222)。鉛離子在人體內(nèi)不易于降解，因而長(zhǎng)期的積累 甚至少量的鉛離子也會(huì)影響人類的健康。美國(guó)環(huán)境保護(hù)局規(guī)定在飲用水中鉛離子的最大殘 余量不能超過(guò)72.4nM。已有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，一些兒童由于長(zhǎng)期的和低水平的鉛離子暴露，智力能 力受到嚴(yán)重的影響（參見(jiàn)British Medical Bulletin 2003,68,167-182)。因此對(duì)于鉛離 子的檢測(cè)已日益成為環(huán)境監(jiān)測(cè)的重要問(wèn)題，研發(fā)新型鉛離子檢測(cè)方法對(duì)于環(huán)境保護(hù)、疾病 預(yù)防、重大環(huán)境污染監(jiān)測(cè)具有重要意義。
[0003] 目前，各種傳統(tǒng)的分析方法像原子吸收光譜法，電感耦合等離子體-質(zhì)譜法，電感 耦合等離子體-原子發(fā)射光譜法，已廣泛使用。然而，這些分析方法大多是昂貴的，耗時(shí)的， 需要冗長(zhǎng)的步驟和復(fù)雜的儀器，從而限制了鉛離子檢測(cè)的廣泛應(yīng)用。
[0004] 表面增強(qiáng)拉曼散射（SERS)是一種非常吸引人的現(xiàn)象，它已廣泛的用于傳感應(yīng)用 中。相比較正常的拉曼信號(hào)，分子吸附在一些特定的金屬表面時(shí)，該分子的拉曼信號(hào)會(huì)得到 極大地提高，因而能夠超高靈敏的檢測(cè)樣品。這種巨大的增強(qiáng)因子是由于，在光照下，對(duì)于 表面較為粗糙的金屬襯底來(lái)說(shuō)，表面能夠產(chǎn)生局域電磁場(chǎng)。除了較高的靈敏性，SERS具有狹 窄的拉曼峰從而導(dǎo)致較小的背景，有利于多元檢測(cè)。此外，拉曼散射在不同的環(huán)境下非常穩(wěn) 定，幾乎不受濕度，氧氣，外來(lái)物種等的影響。因此，SERS已用于靈敏性和特異性的檢測(cè)鉛離 子。例如，王等人，發(fā)展了一種獨(dú)特的和簡(jiǎn)單的"Signal off"SERS策略用于靈敏性和選擇性 的檢測(cè)鉛離子(參見(jiàn):Chem. Commun. 2011，47，4394-4396)。之后，徐等人，介紹了一種基于 DNAzyme的Ag NPs-〇n_Ag f ilm結(jié)構(gòu)，能夠檢測(cè)InM的鉛離子（參見(jiàn)：Anal · Chem · 2014，86， 11494-11497)。盡管這些SERS傳感器是可行的，但是靈敏性和重現(xiàn)性不是令人滿意的，因而 限制其在實(shí)際水樣中的應(yīng)用。因此，更多的努力開(kāi)始致力于發(fā)展穩(wěn)定性好、重現(xiàn)性優(yōu)良的基 底以實(shí)現(xiàn)超靈敏性和特異性的檢測(cè)產(chǎn)品。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種定量檢測(cè)實(shí)際水樣中鉛離子濃度的硅基 SERS芯片及其制備方法，使得所述硅基SERS芯片在檢測(cè)實(shí)際水樣中鉛離子濃度時(shí)具有較好 的靈敏度、特異性、重現(xiàn)性以及可循環(huán)性。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0007] 一種定量檢測(cè)實(shí)際水樣中鉛離子濃度的硅基SERS芯片，其特征在于，由銀納米顆 粒修飾的硅晶片、金納米顆粒、SEQ ID NO: 1-2和SEQ ID N0:4所示核苷酸序列，以及在SEQ ID NO: 3所不核昔酸序列5 '端偶聯(lián)有疏基、3 '端偶聯(lián)有焚光染料的序列片段；
[0008]其中，銀納米顆粒修飾的娃晶片與SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列連接，金納米顆粒 與SEQ ID NO: 2所示核苷酸序列連接，SEQ ID NO: 1-2所示核苷酸序列彼此形成互補(bǔ)雙鏈連 接，在SEQ ID N0:3所示核苷酸序列5'端偶聯(lián)有巰基、3'端偶聯(lián)有熒光染料的序列片段通過(guò) 末端巰基與金、銀納米顆粒共價(jià)連接，SEQ ID N0:4所示核苷酸序列與SEQ ID NO: 3所示核 苷酸序列彼此形成互補(bǔ)雙鏈連接。
[0009]本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有檢測(cè)實(shí)際水樣中鉛離子濃度的SERS技術(shù)靈敏度(僅為nM級(jí)）和重 現(xiàn)性較差的問(wèn)題，本發(fā)明采用多聚腺嘌呤(Poly A30,即SEQ ID NO: 1-2所示核苷酸序列，本 發(fā)明中分別命名為Poly A30-P1和Poly A30-P2)輔助的表面增強(qiáng)拉曼散射硅基芯片用于高 性能的鉛離子檢測(cè)，本發(fā)明這種芯片由核(銀)_衛(wèi)星(金)納米顆粒修飾的硅晶片所構(gòu)成，共 價(jià)連接在硅基SERS芯片上的DNAzyme(g卩SEQ ID N0:3所示核苷酸序列，本發(fā)明中命名為 Cy5-17E-SH)可以被鉛離子特異性激活，使得substrate strand(即SEQ ID N0:4所示核苷 酸序列，本發(fā)明中命名為17DS)斷裂成兩段自由的DNA，因而可檢測(cè)到較強(qiáng)的SERS信號(hào)，原理 示意圖見(jiàn)圖1。
[0010]其中，作為優(yōu)選，所述序列片段為在SEQ ID N0:3所示核苷酸序列5'端偶聯(lián)有HS-(CH2)6-、3'端偶聯(lián)有Cy5熒光染料的序列片段，即5' - HS-(CH2)6-TTTCATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGAGT-Cy5-3'〇 [0011]作為優(yōu)選，所述硅晶片為〇. 01~20 Ω *cm的p型或n型硅晶片。
[0012]同時(shí)，本發(fā)明還提供了所述硅基SERS芯片的制備方法，包括：
[0013] 步驟1、制備銀納米顆粒修飾的娃晶片以及金納米顆粒；
[0014] 步驟2、將已制備好的銀納米顆粒修飾的硅晶片與溶解于磷酸鹽緩沖液中的SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列恒溫混合孵育，然后向其中加入鹽溶液，過(guò)夜老化，得到SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列連接的銀納米顆粒修飾的硅晶片；
[0015] 將所制備的金納米顆粒與溶解于磷酸鹽緩沖液中的SEQ ID N0:2所示核苷酸序列 恒溫混合孵育，然后向溶液中加入鹽溶液，過(guò)夜老化，得到SEQ ID NO: 2所示核苷酸序列連 接的金納米顆粒；
[0016] 步驟3、將步驟2所得硅晶片和金納米顆粒置于雜交緩沖液中恒溫混合孵育，通過(guò) SEQ ID NO: 1-2所示核苷酸序列互補(bǔ)配對(duì)形成雙鏈結(jié)構(gòu)，用PBS沖洗，然后氮?dú)獯蹈?，得到?(銀)-衛(wèi)星(金)納米顆粒修飾的硅晶片(掃描電鏡表征照片見(jiàn)圖2);
[0017] 步驟4、將核(銀)-衛(wèi)星（金)納米顆粒修飾的硅晶片與在SEQ ID NO: 3所示核苷酸 序列5 '端偶聯(lián)有疏基、3 '端偶聯(lián)有焚光染料的序列片段丨旦溫混勾并振蕩反應(yīng)，使SEQ ID NO: 3所示核苷酸序列末端疏基與金、銀納米粒子共價(jià)連接形成金-硫鍵和銀-硫鍵，然后向 溶液中加入鹽溶液，過(guò)夜老化；
[0018] 將老化后的材料取出，與溶解于雜交緩沖液中SEQ ID N0:4所示核苷酸序列恒溫 混合孵育，通過(guò)DNA互補(bǔ)配對(duì)形成DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，然后用PBS沖洗，氮?dú)獯蹈?，得到所述硅?SERS芯片。
[0019] 作為優(yōu)選，所述銀納米顆粒修飾的硅晶片由以下方法制備獲得：
[0020] 將單晶硅片依次用去離子水、丙酮、去離子水進(jìn)行超聲清洗，然后再用濃硫酸和過(guò) 氧化氫混合溶液清洗；
[0021] 清洗后的單晶硅片加入到氫氟酸溶液中進(jìn)行硅-氫化反應(yīng)，得到表面覆蓋Si-H鍵 的硅晶片，然后光面朝上，放入硝酸銀和氫氟酸的混合溶液中，緩慢振蕩反應(yīng)，銀離子被Si-H鍵還原，在硅晶片表面原位生長(zhǎng)上一層均勻的銀納米顆粒，得到銀納米顆粒修飾的硅晶 片，最后用氮?dú)獯蹈杀砻妗?br>[0022] 作為優(yōu)選，所述的過(guò)氧化氫質(zhì)量濃度為40%，濃硫酸和40%過(guò)氧化氫體積比為1: (0.01~100)。
[0023]作為優(yōu)選，所述氫氟酸溶液中氫氟酸的質(zhì)量濃度為1~40%。
[0024]作為優(yōu)選，所述娃-氫化反應(yīng)的時(shí)間為1~60分鐘。
[0025]作為優(yōu)選，所述硝酸銀和氫氟酸的混合溶液由IM的硝酸銀溶液和質(zhì)量濃度為40% 的氫氟酸溶液按體積比為1:(0.01~100)配制而成。
[0026] 作為優(yōu)選，所述振蕩反應(yīng)時(shí)間為1~60分鐘。
[0027] 作為優(yōu)選，所述納米金顆粒通過(guò)檸檬酸還原法制備獲得。具體的可參照如下方式：
[0028] 在沸騰的氯金酸溶液中，加入檸檬酸鈉溶液，攪拌反應(yīng)之后，得到金納米顆粒，所 述氯金酸質(zhì)量濃度為〇.〇1%，檸檬酸鈉質(zhì)量濃度為1%，反應(yīng)時(shí)間為15分鐘。
[0029] 作為優(yōu)選，SEQ ID NO: 1-2所示核苷酸序列濃度均為0.001~1M。
[0030] 作為優(yōu)選，步驟2所述恒溫混合孵育為在25°C孵育16小時(shí)。
[0031] 作為優(yōu)選，步驟2和步驟4所述加入鹽溶液為將初始濃度為IM的鹽溶液，每隔兩小 時(shí)分3-5次加入，鹽溶液最終濃度為0.01~1M。
[0032] 作為優(yōu)選，步驟3所述恒溫混合孵育為在37°C孵育24小時(shí)。
[0033] 作為優(yōu)選，步驟4所述振蕩反應(yīng)為在100~600轉(zhuǎn)每分鐘、25°C下反應(yīng)1~24小時(shí)。 [0034] 作為優(yōu)選，步驟4所述恒溫混合孵育為在37°C孵育1~24小時(shí)。
[0035]作為優(yōu)選，步驟4中在SEQ ID N0:3所示核苷酸序列5'端偶聯(lián)有巰基、3'端偶聯(lián)有 熒光染料的序列片段、SEQ ID N0:4所示核苷酸序列濃度均為0.001~1M。
[0036]本發(fā)明構(gòu)建的硅基SERS芯片從IOpM到ΙμΜ鉛離子的對(duì)數(shù)濃度與歸一化的拉曼強(qiáng)度 存在較好的線性關(guān)系(R2 = O. 997);由于該芯片優(yōu)越的SERS性能，它可以檢測(cè)到低至8.9 X 10一 12Μ(ρΜ級(jí)）的鉛離子濃度，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于已報(bào)道的SERS傳感器(ηΜ級(jí)）；此外，所提供的芯片具 有良好的選擇性和可循環(huán)性(三次循環(huán)后拉曼強(qiáng)度損失僅為11.1%);更重要的是，所制備 的芯片可以精確和可靠的檢測(cè)湖水、自來(lái)水和工業(yè)廢水等實(shí)際體系中未知鉛離子的濃度 (RSD值小于12%)。
【附圖說(shuō)明】
[0037]圖1是本發(fā)明的硅基SERS芯片檢測(cè)鉛離子的原理圖；
[0038]圖2是本發(fā)明制備得到的硅基SERS芯片，即核(銀)_衛(wèi)星(金)納米顆粒修飾的硅晶 片的掃描電鏡表征照片，其中銀納米顆粒(AgNPs)的尺寸約為11Onm，金納米顆粒(Au NPs) 的尺寸約為13nm，且較均勾的分布在Ag NPs表面上；
[0039] 圖3是本發(fā)明制備得到的芯片對(duì)不同濃度鉛離子的SERS試驗(yàn)系列結(jié)果譜圖；
[0040] 圖4是本發(fā)明制備得到的芯片對(duì)同一濃度不同離子的SERS光譜圖以及不同離子的 拉曼峰1366CHT1的強(qiáng)度的對(duì)比柱形圖，其中a圖為對(duì)同一濃度不同離子的SERS光譜圖，b圖為 不同離子的拉曼峰1366CHT1的強(qiáng)度的對(duì)比柱形圖；
[0041]圖5是本發(fā)明制備得到的芯片重建的原理圖以及3次循環(huán)使用的SERS光譜圖和相 應(yīng)的拉曼峰1366CHT1的強(qiáng)度的對(duì)比圖，其中a圖為芯片的重建原理圖，b和c圖分別為3次循環(huán) 使用的SERS光譜圖和相應(yīng)的拉曼峰1366CHT 1的強(qiáng)度的對(duì)比圖。
【具體實(shí)施方式】：
[0042]本發(fā)明公開(kāi)了一種定量檢測(cè)實(shí)際水樣中鉛離子濃度的硅基SERS芯片及其制備方 法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有 類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本 發(fā)明的產(chǎn)品及方法已經(jīng)通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi) 容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本 發(fā)明技術(shù)。
[0043]下面就本發(fā)明提供的一種定量檢測(cè)實(shí)際水樣中鉛離子濃度的硅基SERS芯片及其 制備方法做進(jìn)一步說(shuō)明。
[0044] 實(shí)施例1:制備本發(fā)明所述硅基SERS芯片
[0045] (1)氫氟酸輔助刻蝕方法制備銀納米顆粒修飾的硅晶片
[0046] 取0.5cm2大小單晶硅片3-6片置于潔凈燒杯中于超聲儀中依次用去離子水、丙酮、 去離子水進(jìn)行超聲清洗15分鐘，再放入40mL濃硫酸和過(guò)氧化氫(質(zhì)量濃度:40%)混合溶液 (體積比= 3:1)中進(jìn)一步清洗，然后再用去離子水清洗，得到干凈的硅晶片。將清洗干凈的 硅晶片置入氫氟酸溶液(質(zhì)量濃度:5 % )中進(jìn)行硅-氫化反應(yīng)，緩慢振蕩30分鐘，得到表面覆 蓋大量Si-H鍵的硅晶片。將經(jīng)過(guò)上述處理后所得到的硅晶片，光面朝上，放入20mL硝酸銀 (IM)和氫氟酸（質(zhì)量濃度:40%)的混合溶液(體積比= 1:100)中，緩慢振蕩反應(yīng)60分鐘，根 據(jù)電化學(xué)反應(yīng)原理，銀離子被Si-H鍵還原，在硅晶片表面原位生長(zhǎng)上一層均勻的銀納米顆 粒，從而得到銀納米顆粒修飾的硅晶片，最后用氮?dú)獯蹈杀砻妗?br>[0047] (2)核(銀)_衛(wèi)星(金)納米顆粒修飾的硅晶片的制備
[0048]根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的檸檬酸還原方法，在沸騰的50mL氯金酸溶液(質(zhì)量濃度:0.01 % )中，加 入2mL檸檬酸鈉溶液(質(zhì)量濃度：1%)，攪拌反應(yīng)15分鐘之后，得到金納米顆粒。將所制備的 金納米顆粒與溶解于磷酸鹽緩沖液（P B S )中的P 〇 I y A 3 0 - P I D NA ( 5 ' -AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATTTTTGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGA-3 '）（濃度： 0.001M)，恒溫25°C，在恒溫混勻儀上混合孵育16小時(shí)，然后向溶液中分3次每隔2小時(shí)加一 次IM鹽溶液，使得鹽溶液最終濃度為0.1M，過(guò)夜老化，得到PolyA30-Pl連接的金納米顆粒。 將已制備好的銀納米顆粒修飾的硅晶片與溶解于磷酸鹽緩沖液中的Poly A30-P2DNA(5'_ AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATTTTTTCCACAAAATGATTCTGAATTAGCTGTATC-3 '）（濃度： 0.001M)，恒溫25°C，在恒溫混勻儀上混合孵育16小時(shí)，然后向溶液中分5次每隔2小時(shí)加一 次IM鹽溶液，使得鹽溶液最終濃度為0.1 M，過(guò)夜老化，得到PolyA30-P2連接的銀納米顆粒修 飾的硅晶片。將上述兩步所得材料置于雜交緩沖液中，恒溫37°C，在恒溫混勻儀上混合孵育 24小時(shí)。通過(guò)DNA互補(bǔ)配對(duì)形成雙鏈結(jié)構(gòu)，用PBS沖洗幾次，然后氮?dú)獯蹈?，得到?銀)-衛(wèi)星 (金)納米顆粒修飾的硅晶片。
[0049] (3)核(銀)-衛(wèi)星(金)納米顆粒修飾的硅晶片的SERS芯片構(gòu)建
[0050]將核（銀)-衛(wèi)星（金）納米顆粒修飾的娃晶片放在離心管中，加入enzyme strand DNA(Cy5-17E-SH,5'-HS-(CH2)6-TTTCATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGAGT-Cy5-3'）（濃度： 0.001M)的溶液，使得溶液浸沒(méi)材料。將離心管置于恒溫混勻儀中，350轉(zhuǎn)每分鐘，25°C恒溫， 振蕩反應(yīng)24小時(shí)，使DNA末端巰基與金、銀納米粒子共價(jià)形成金-硫鍵和銀-硫鍵，使DNA共價(jià) 連接到核(銀)_衛(wèi)星(金)納米顆粒修飾的硅晶片上。然后向溶液中分5次每隔2小時(shí)加一次 IM鹽溶液，使得鹽溶液最終濃度為0 . IM，過(guò)夜老化。將材料取出，與溶解于雜交緩沖液中 substrate strand DNA(17DS,5'-ACTCACTATrAGGAAGAGATG-3',rA(ribonucleotide adenosine)代表核糖核苷酸中的堿基A)(濃度:0.001M)，37°C恒溫，在恒溫混勾儀中混合孵 育24小時(shí)，通過(guò)DNA互補(bǔ)配對(duì)形成DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，然后用PBS沖洗幾次，氮?dú)獯蹈桑玫胶?(銀)-衛(wèi)星(金)納米顆粒修飾的硅晶片的SERS芯片。
[0051 ] 實(shí)施例2:制備本發(fā)明所述硅基SERS芯片
[0052] (1)氫氟酸輔助刻蝕方法制備銀納米顆粒修飾的硅晶片
[0053]取0.5cm2大小單晶硅片3-6片置于潔凈燒杯中于超聲儀中依次用去離子水、丙酮、 去離子水進(jìn)行超聲清洗15分鐘，再放入40mL濃硫酸和過(guò)氧化氫(質(zhì)量濃度:40%)混合溶液 (體積比= 3:1)中進(jìn)一步清洗，然后再用去離子水清洗，得到干凈的硅晶片。將清洗干凈的 硅晶片置入氫氟酸溶液(質(zhì)量濃度:5 % )中進(jìn)行硅-氫化反應(yīng)，緩慢振蕩30分鐘，得到表面覆 蓋大量Si-H鍵的硅晶片。將經(jīng)過(guò)上述處理后所得到的硅晶片，光面朝上，放入20mL硝酸銀 (1M)和氫氟酸（質(zhì)量濃度:40% )的混合溶液(體積比=1:50)中，緩慢振蕩反應(yīng)30分鐘，根據(jù) 電化學(xué)反應(yīng)原理，銀離子被Si-H鍵還原，在硅晶片表面原位生長(zhǎng)上一層均勻的銀納米顆粒， 從而得到銀納米顆粒修飾的硅晶片，最后用氮?dú)獯蹈杀砻妗?br>[0054] ⑵核(銀)-衛(wèi)星(金)納米顆粒修飾的硅晶片的制備
[0055]根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的檸檬酸還原方法，在沸騰的50mL氯金酸溶液(質(zhì)量濃度:0.01 % )中，加 入2mL檸檬酸鈉溶液(質(zhì)量濃度：1%)，攪拌反應(yīng)15分鐘之后，得到金納米顆粒。將所制備的 金納米顆粒與溶解于磷酸鹽緩沖液（P B S )中的P 〇 I y A 3 0 - P I D NA ( 5 ' -AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATTTTTGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGA-3 '）（濃度： 0.001M)，恒溫25°C，在恒溫混勻儀上混合孵育16小時(shí)，然后向溶液中分3次每隔2小時(shí)加一 次IM鹽溶液，使得鹽溶液最終濃度為0.1M，過(guò)夜老化，得到PolyA30-Pl連接的金納米顆粒。 將已制備好的銀納米顆粒修飾的硅晶片與溶解于磷酸鹽緩沖液中的Poly A30-P2DNA(5'_ AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATTTTTTCCACAAAATGATTCTGAATTAGCTGTATC-3 '）（濃度： 0.001M)，恒溫25°C，在恒溫混勻儀上混合孵育16小時(shí)，然后向溶液中分5次每隔2小時(shí)加一 次IM鹽溶液，使得鹽溶液最終濃度為0.1M，過(guò)夜老化，得到Poly A30-P2連接的銀納米顆粒 修飾的硅晶片。將上述兩步所得材料置于雜交緩沖液中，恒溫37°C，在恒溫混勻儀上混合孵 育24小時(shí)。通過(guò)DNA互補(bǔ)配對(duì)形成雙鏈結(jié)構(gòu)，用PBS沖洗幾次，然后氮?dú)獯蹈?，得到?銀)-衛(wèi) 星(金)納米顆粒修飾的硅晶片。
[0056] (3)核(銀)_衛(wèi)星(金)納米顆粒修飾的硅晶片的SERS芯片構(gòu)建
[0057]將核（銀)-衛(wèi)星（金）納米顆粒修飾的娃晶片放在離心管中，加入enzyme strand DNA(Cy5-17E-SH,5'-HS-(CH2)6-TTTCATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGAGT-Cy5-3'）（濃度： 0.001M)的溶液，使得溶液浸沒(méi)材料。將離心管置于恒溫混勻儀中，350轉(zhuǎn)每分鐘，25°C恒溫， 振蕩反應(yīng)24小時(shí)，使DNA末端巰基與金、銀納米粒子共價(jià)形成金-硫鍵和銀-硫鍵，使DNA共價(jià) 連接到核(銀)_衛(wèi)星(金)納米顆粒修飾的硅晶片上。然后向溶液中分5次每隔2小時(shí)加一次 IM鹽溶液，使得鹽溶液最終濃度為O . IM，過(guò)夜老化。將材料取出，與溶解于雜交緩沖液中 substrate strand DNA(17DS,5'-ACTCACTATrAGGAAGAGATG-3',rA(ribonucleotide adenosine)代表核糖核苷酸中的堿基A)(濃度:O. OO1M)，37°C恒溫，在恒溫混勾儀中混合孵 育24小時(shí)，通過(guò)DNA互補(bǔ)配對(duì)形成DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，然后用PBS沖洗幾次，氮?dú)獯蹈?，得到?(銀)-衛(wèi)星(金)納米顆粒修飾的硅晶片的SERS芯片。
[0058] 實(shí)施例3:制備本發(fā)明所述硅基SERS芯片
[0059] (1)氫氟酸輔助刻蝕方法制備銀納米顆粒修飾的硅晶片
[0060] 取0.5cm2大小單晶硅片3-6片置于潔凈燒杯中于超聲儀中依次用去離子水、丙酮、 去離子水進(jìn)行超聲清洗15分鐘，再放入40mL濃硫酸和過(guò)氧化氫(質(zhì)量濃度:40%)混合溶液 (體積比= 3:1)中進(jìn)一步清洗，然后再用去離子水清洗，得到干凈的硅晶片。將清洗干凈的 硅晶片置入氫氟酸溶液(質(zhì)量濃度:5 % )中進(jìn)行硅-氫化反應(yīng)，緩慢振蕩30分鐘，得到表面覆 蓋大量Si-H鍵的硅晶片。將經(jīng)過(guò)上述處理后所得到的硅晶片，光面朝上，放入20mL硝酸銀 (IM)和氫氟酸（質(zhì)量濃度:40%)的混合溶液(體積比= 1:100)中，緩慢振蕩反應(yīng)60分鐘，根 據(jù)電化學(xué)反應(yīng)原理，銀離子被Si-H鍵還原，在硅晶片表面原位生長(zhǎng)上一層均勻的銀納米顆 粒，從而得到銀納米顆粒修飾的硅晶片，最后用氮?dú)獯蹈杀砻妗?br>[0061 ] (2)核(銀)-衛(wèi)星(金)納米顆粒修飾的硅晶片的制備
[0062]根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的檸檬酸還原方法，在沸騰的50mL氯金酸溶液(質(zhì)量濃度:0.01 % )中，加 入2mL檸檬酸鈉溶液(質(zhì)量濃度：1%)，攪拌反應(yīng)15分鐘之后，得到金納米顆粒。將所制備的 金納米顆粒與溶解于磷酸鹽緩沖液（P B S )中的P 〇 I y A 3 0 - P I D NA ( 5 ' -AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATTTTTGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGA-3 '）（濃度： 0.01M)，恒溫25°C，在恒溫混勻儀上混合孵育16小時(shí)，然后向溶液中分3次每隔2小時(shí)加一次 IM鹽溶液，使得鹽溶液最終濃度為0.1M，過(guò)夜老化，得到PolyA30-Pl連接的金納米顆粒。將 已制備好的銀納米顆粒修飾的硅晶片與溶解于磷酸鹽緩沖液中的Poly A30-P2DNA(5'_ AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATTTTTTCCACAAAATGATTCTGAATTAGCTGTATC-3 '）（濃度： 0.01M)，恒溫25°C，在恒溫混勻儀上混合孵育16小時(shí)，然后向溶液中分5次每隔2小時(shí)加一次 IM鹽溶液，使得鹽溶液最終濃度為0.1 M，過(guò)夜老化，得到PolyA30-P2連接的銀納米顆粒修飾 的硅晶片。將上述兩步所得材料置于雜交緩沖液中，恒溫37°C，在恒溫混勻儀上混合孵育24 小時(shí)。通過(guò)DNA互補(bǔ)配對(duì)形成雙鏈結(jié)構(gòu)，用PBS沖洗幾次，然后氮?dú)獯蹈?，得到核（銀)-衛(wèi)星 (金)納米顆粒修飾的硅晶片。
[0063] (3)核(銀)_衛(wèi)星(金)納米顆粒修飾的硅晶片的SERS芯片構(gòu)建
[0064]將核（銀)-衛(wèi)星（金）納米顆粒修飾的娃晶片放在離心管中，加入enzyme strand DNA(Cy5-17E-SH,5'-HS-(CH2)6-TTTCATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGAGT-Cy5-3'）（濃度： 0.001M)的溶液，使得溶液浸沒(méi)材料。將離心管置于恒溫混勻儀中，350轉(zhuǎn)每分鐘，25°C恒溫， 振蕩反應(yīng)24小時(shí)，使DNA末端巰基與金、銀納米粒子共價(jià)形成金-硫鍵和銀-硫鍵，使DNA共價(jià) 連接到核(銀)_衛(wèi)星(金)納米顆粒修飾的硅晶片上。然后向溶液中分5次每隔2小時(shí)加一次 IM鹽溶液，使得鹽溶液最終濃度為0 . IM，過(guò)夜老化。將材料取出，與溶解于雜交緩沖液中 substrate strand DNA(17DS,5'-ACTCACTATrAGGAAGAGATG-3',rA(ribonucleotide adenosine)代表核糖核苷酸中的堿基A)(濃度:O. OO1M)，37°C恒溫，在恒溫混勾儀中混合孵 育24小時(shí)，通過(guò)DNA互補(bǔ)配對(duì)形成DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，然后用PBS沖洗幾次，氮?dú)獯蹈桑玫胶?(銀)-衛(wèi)星(金)納米顆粒修飾的硅晶片的SERS芯片。
[0065] 實(shí)施例3:制備本發(fā)明所述硅基SERS芯片
[0066] (1)氫氟酸輔助刻蝕方法制備銀納米顆粒修飾的硅晶片
[0067] 取0.5cm2大小單晶硅片3-6片置于潔凈燒杯中于超聲儀中依次用去離子水、丙酮、 去離子水進(jìn)行超聲清洗15分鐘，再放入40mL濃硫酸和過(guò)氧化氫(質(zhì)量濃度:40%)混合溶液 (體積比= 3:1)中進(jìn)一步清洗，然后再用去離子水清洗，得到干凈的硅晶片。將清洗干凈的 硅晶片置入氫氟酸溶液(質(zhì)量濃度:5 % )中進(jìn)行硅-氫化反應(yīng)，緩慢振蕩30分鐘，得到表面覆 蓋大量Si-H鍵的硅晶片。將經(jīng)過(guò)上述處理后所得到的硅晶片，光面朝上，放入20mL硝酸銀 (IM)和氫氟酸（質(zhì)量濃度:40%)的混合溶液(體積比= 1:100)中，緩慢振蕩反應(yīng)60分鐘，根 據(jù)電化學(xué)反應(yīng)原理，銀離子被Si-H鍵還原，在硅晶片表面原位生長(zhǎng)上一層均勻的銀納米顆 粒，從而得到銀納米顆粒修飾的硅晶片，最后用氮?dú)獯蹈杀砻妗?br>[0068] (2)核(銀)_衛(wèi)星(金)納米顆粒修飾的硅晶片的制備
[0069]根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的檸檬酸還原方法，在沸騰的50mL氯金酸溶液(質(zhì)量濃度:0.01 % )中，加 入2mL檸檬酸鈉溶液(質(zhì)量濃度：1%)，攪拌反應(yīng)15分鐘之后，得到金納米顆粒。將所制備的 金納米顆粒與溶解于磷酸鹽緩沖液（P B S )中的P 〇 I y A 3 0 - P I D NA ( 5 ' -AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATTTTTGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGA-3 '）（濃度： 0.001M)，恒溫25°C，在恒溫混勻儀上混合孵育16小時(shí)，然后向溶液中分3次每隔2小時(shí)加一 次IM鹽溶液，使得鹽溶液最終濃度為0.1M，過(guò)夜老化，得到Poly A30-P1連接的金納米顆粒。 將已制備好的銀納米顆粒修飾的硅晶片與溶解于磷酸鹽緩沖液中的Poly A30-P2DNA(5'_ AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATTTTTTCCACAAAATGATTCTGAATTAGCTGTATC-3 '）（濃度： 0.001M)，恒溫25°C，在恒溫混勻儀上混合孵育16小時(shí)，然后向溶液中分5次每隔2小時(shí)加一 次IM鹽溶液，使得鹽溶液最終濃度為0.1M，過(guò)夜老化，得到Poly A30-P2連接的銀納米顆粒 修飾的硅晶片。將上述兩步所得材料置于雜交緩沖液中，恒溫37°C，在恒溫混勻儀上混合孵 育24小時(shí)。通過(guò)DNA互補(bǔ)配對(duì)形成雙鏈結(jié)構(gòu)，用PBS沖洗幾次，然后氮?dú)獯蹈?，得到?銀)-衛(wèi) 星(金)納米顆粒修飾的硅晶片。
[0070] (3)核(銀)-衛(wèi)星(金)納米顆粒修飾的硅晶片的SERS芯片構(gòu)建
[0071]將核（銀)-衛(wèi)星（金）納米顆粒修飾的娃晶片放在離心管中，加入enzyme strand DNA(Cy5-17E-SH,5'-HS-(CH2)6-TTTCATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGAGT-Cy5-3'）（濃度： 0.01M)的溶液，使得溶液浸沒(méi)材料。將離心管置于恒溫混勻儀中，350轉(zhuǎn)每分鐘，25°C恒溫， 振蕩反應(yīng)24小時(shí)，使DNA末端巰基與金、銀納米粒子共價(jià)形成金-硫鍵和銀-硫鍵，使DNA共價(jià) 連接到核(銀)_衛(wèi)星(金)納米顆粒修飾的硅晶片上。然后向溶液中分5次每隔2小時(shí)加一次 IM鹽溶液，使得鹽溶液最終濃度為0 . IM，過(guò)夜老化。將材料取出，與溶解于雜交緩沖液中 substrate strand DNA(17DS,5'-ACTCACTATrAGGAAGAGATG-3',rA(ribonucleotide adenosine)代表核糖核苷酸中的堿基A)(濃度:0.01M)，37°C恒溫，在恒溫混勾儀中混合孵 育24小時(shí)，通過(guò)DNA互補(bǔ)配對(duì)形成DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，然后用PBS沖洗幾次，氮?dú)獯蹈?，得到?(銀)-衛(wèi)星(金)納米顆粒修飾的硅晶片的SERS芯片。
[0072] 實(shí)施例5:制備本發(fā)明所述硅基SERS芯片
[0073] (I)氫氟酸輔助刻蝕方法制備銀納米顆粒修飾的硅晶片
[0074] 取0.5cm2大小單晶硅片3-6片置于潔凈燒杯中于超聲儀中依次用去離子水、丙酮、 去離子水進(jìn)行超聲清洗15分鐘，再放入40mL濃硫酸和過(guò)氧化氫(質(zhì)量濃度:40%)混合溶液 (體積比= 3:1)中進(jìn)一步清洗，然后再用去離子水清洗，得到干凈的硅晶片。將清洗干凈的 硅晶片置入氫氟酸溶液(質(zhì)量濃度:5 % )中進(jìn)行硅-氫化反應(yīng)，緩慢振蕩30分鐘，得到表面覆 蓋大量Si-H鍵的硅晶片。將經(jīng)過(guò)上述處理后所得到的硅晶片，光面朝上，放入20mL硝酸銀 (IM)和氫氟酸（質(zhì)量濃度:40%)的混合溶液(體積比= 1:100)中，緩慢振蕩反應(yīng)60分鐘，根 據(jù)電化學(xué)反應(yīng)原理，銀離子被Si-H鍵還原，在硅晶片表面原位生長(zhǎng)上一層均勻的銀納米顆 粒，從而得到銀納米顆粒修飾的硅晶片，最后用氮?dú)獯蹈杀砻妗?br>[0075] (2)核(銀)_衛(wèi)星(金)納米顆粒修飾的硅晶片的制備
[0076]根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的檸檬酸還原方法，在沸騰的50mL氯金酸溶液(質(zhì)量濃度:0.01 % )中，加 入2mL檸檬酸鈉溶液(質(zhì)量濃度：1%)，攪拌反應(yīng)15分鐘之后，得到金納米顆粒。將所制備的 金納米顆粒與溶解于磷酸鹽緩沖液（P B S )中的P 〇 I y A 3 0 - P I D NA ( 5 ' -AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATTTTTGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGA-3 '）（濃度： 0.001M)，恒溫25°C，在恒溫混勻儀上混合孵育16小時(shí)，然后向溶液中分3次每隔2小時(shí)加一 次IM鹽溶液，使得鹽溶液最終濃度為0.5M，過(guò)夜老化，得到PolyA30-Pl連接的金納米顆粒。 將已制備好的銀納米顆粒修飾的硅晶片與溶解于磷酸鹽緩沖液中的Poly A30-P2DNA(5'_ AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATTTTTTCCACAAAATGATTCTGAATTAGCTGTATC-3 '）（濃度： 0.001M)，恒溫25°C，在恒溫混勻儀上混合孵育16小時(shí)，然后向溶液中分5次每隔2小時(shí)加一 次IM鹽溶液，使得鹽溶液最終濃度為0.5M，過(guò)夜老化，得到PolyA30-P2連接的銀納米顆粒修 飾的硅晶片。將上述兩步所得材料置于雜交緩沖液中，恒溫37°C，在恒溫混勻儀上混合孵育 24小時(shí)。通過(guò)DNA互補(bǔ)配對(duì)形成雙鏈結(jié)構(gòu)，用PBS沖洗幾次，然后氮?dú)獯蹈?，得到?銀)-衛(wèi)星 (金)納米顆粒修飾的硅晶片。
[0077] (3)核(銀)_衛(wèi)星(金)納米顆粒修飾的硅晶片的SERS芯片構(gòu)建
[0078]將核（銀)-衛(wèi)星（金）納米顆粒修飾的娃晶片放在離心管中，加入enzyme strand DNA(Cy5-17E-SH,5'-HS-(CH2)6-TTTCATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGAGT-Cy5-3'）（濃度： 0.001M)的溶液，使得溶液浸沒(méi)材料。將離心管置于恒溫混勻儀中，350轉(zhuǎn)每分鐘，25°C恒溫， 振蕩反應(yīng)24小時(shí)，使DNA末端巰基與金、銀納米粒子共價(jià)形成金-硫鍵和銀-硫鍵，使DNA共價(jià) 連接到核(銀)_衛(wèi)星(金)納米顆粒修飾的硅晶片上。然后向溶液中分5次每隔2小時(shí)加一次 IM鹽溶液，使得鹽溶液最終濃度為0.5M，過(guò)夜老化。將材料取出，與溶解于雜交緩沖液中 substrate strand DNA(17DS,5'-ACTCACTATrAGGAAGAGATG-3',rA(ribonucleotide adenosine)代表核糖核苷酸中的堿基A)(濃度:0.001M)，37°C恒溫，在恒溫混勾儀中混合孵 育24小時(shí)，通過(guò)DNA互補(bǔ)配對(duì)形成DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，然后用PBS沖洗幾次，氮?dú)獯蹈?，得到?(銀)-衛(wèi)星(金)納米顆粒修飾的硅晶片的SERS芯片。
[0079] 實(shí)施例6:制備本發(fā)明所述硅基SERS芯片
[0080] (1)氫氟酸輔助刻蝕方法制備銀納米顆粒修飾的硅晶片
[0081] 取0.5cm2大小單晶硅片3-6片置于潔凈燒杯中于超聲儀中依次用去離子水、丙酮、 去離子水進(jìn)行超聲清洗15分鐘，再放入40mL濃硫酸和過(guò)氧化氫(質(zhì)量濃度:40%)混合溶液 (體積比= 3:1)中進(jìn)一步清洗，然后再用去離子水清洗，得到干凈的硅晶片。將清洗干凈的 硅晶片置入氫氟酸溶液(質(zhì)量濃度:5 % )中進(jìn)行硅-氫化反應(yīng)，緩慢振蕩30分鐘，得到表面覆 蓋大量Si-H鍵的硅晶片。將經(jīng)過(guò)上述處理后所得到的硅晶片，光面朝上，放入20mL硝酸銀 (IM)和氫氟酸（質(zhì)量濃度:40%)的混合溶液(體積比= 1:100)中，緩慢振蕩反應(yīng)60分鐘，根 據(jù)電化學(xué)反應(yīng)原理，銀離子被Si-H鍵還原，在硅晶片表面原位生長(zhǎng)上一層均勻的銀納米顆 粒，從而得到銀納米顆粒修飾的硅晶片，最后用氮?dú)獯蹈杀砻妗?br>[0082] (2)核(銀)_衛(wèi)星(金)納米顆粒修飾的硅晶片的制備
[0083]根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的檸檬酸還原方法，在沸騰的50mL氯金酸溶液(質(zhì)量濃度:0.01 % )中，加 入2mL檸檬酸鈉溶液(質(zhì)量濃度：1%)，攪拌反應(yīng)15分鐘之后，得到金納米顆粒。將所制備的 金納米顆粒與溶解于磷酸鹽緩沖液（P B S )中的P 〇 I y A 3 0 - P I D NA ( 5 ' -AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATTTTTGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGA-3 '）（濃度： 0.001M)，恒溫25°C，在恒溫混勻儀上混合孵育16小時(shí)，然后向溶液中分3次每隔2小時(shí)加一 次IM鹽溶液，使得鹽溶液最終濃度為0.1M，過(guò)夜老化，得到PolyA30-Pl連接的金納米顆粒。 將已制備好的銀納米顆粒修飾的硅晶片與溶解于磷酸鹽緩沖液中的Poly A30-P2DNA(5'_ AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATTTTTTCCACAAAATGATTCTGAATTAGCTGTATC-3 '）（濃度： 0.001M)，恒溫25°C，在恒溫混勻儀上混合孵育16小時(shí)，然后向溶液中分5次每隔2小時(shí)加一 次IM鹽溶液，使得鹽溶液最終濃度為0.1M，過(guò)夜老化，得到Poly A30-P2連接的銀納米顆粒 修飾的硅晶片。將上述兩步所得材料置于雜交緩沖液中，恒溫37°C，在恒溫混勻儀上混合孵 育24小時(shí)。通過(guò)DNA互補(bǔ)配對(duì)形成雙鏈結(jié)構(gòu)，用PBS沖洗幾次，然后氮?dú)獯蹈?，得到?銀)-衛(wèi) 星(金)納米顆粒修飾的硅晶片。
[0084] (3)核(銀)_衛(wèi)星(金)納米顆粒修飾的硅晶片的SERS芯片構(gòu)建
[0085]將核（銀)-衛(wèi)星（金）納米顆粒修飾的娃晶片放在離心管中，加入enzyme strand DNA(Cy5-17E-SH,5'-HS-(CH2)6-TTTCATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGAGT-Cy5-3'）（濃度： 0.001M)的溶液，使得溶液浸沒(méi)材料。將離心管置于恒溫混勻儀中，500轉(zhuǎn)每分鐘，25°C恒溫， 振蕩反應(yīng)18小時(shí)，使DNA末端巰基與金、銀納米粒子共價(jià)形成金-硫鍵和銀-硫鍵，使DNA共價(jià) 連接到核(銀)_衛(wèi)星(金)納米顆粒修飾的硅晶片上。然后向溶液中分5次每隔2小時(shí)加一次 IM鹽溶液，使得鹽溶液最終濃度為0 . IM，過(guò)夜老化。將材料取出，與溶解于雜交緩沖液中 substrate strand DNA(17DS,5'-ACTCACTATrAGGAAGAGATG-3',rA(ribonucleotide adenosine)代表核糖核苷酸中的堿基A)(濃度:0.001M)，37°C恒溫，在恒溫混勾儀中混合孵 育18小時(shí)，通過(guò)DNA互補(bǔ)配對(duì)形成DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，然后用PBS沖洗幾次，氮?dú)獯蹈?，得到?(銀)-衛(wèi)星(金)納米顆粒修飾的硅晶片的SERS芯片。
[0086]實(shí)施例7:本發(fā)明所述芯片對(duì)不同濃度鉛離子的SERS試驗(yàn)
[0087]將制備好的本發(fā)明芯片于室溫下，浸泡在IOOnM鉛離子溶液中，反應(yīng)70分鐘后，取 出芯片，隨機(jī)選擇40個(gè)點(diǎn)做mapping實(shí)驗(yàn)，由圖3中a圖可知拉曼強(qiáng)度較為均勻，RSD值小于 12%，表明了該芯片具有較好的重現(xiàn)性。
[0088] 將制備好的本發(fā)明芯片于室溫下，分別浸泡在0、ΙΟρΜ、ΙΟΟρΜ、ΙηΜ、ΙΟηΜ、ΙΟΟηΜ、1μ M鉛離子溶液中，反應(yīng)70分鐘后，取出芯片，進(jìn)行拉曼實(shí)驗(yàn)，由圖3中b圖可知從IOpM到ΙμΜ鉛 離子的拉曼光譜圖，隨著鉛離子濃度增加拉曼強(qiáng)度也在增加，由圖3中c圖可知鉛離子的對(duì) 數(shù)濃度與歸一化的拉曼強(qiáng)度存在較好的線性關(guān)系(R 2 = O.997)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該芯片可有 效檢測(cè)鉛離子濃度低至8.9ρΜ，靈敏度極高。
[0089] 實(shí)施例8:本發(fā)明所述芯片對(duì)同一濃度不同離子的SERS試驗(yàn)
[0090] 將制備好的芯片于室溫下分別浸泡在InM的各種離子以及各種離子的混合溶液 中，反應(yīng)70分鐘后，取出芯片，分別進(jìn)行拉曼實(shí)驗(yàn)，由圖4中的a圖可知鉛離子和含有鉛離子 的混合溶液相比較其他離子溶液的拉曼光譜具有明顯的增強(qiáng)，從圖4中的b圖可以看出相應(yīng) 的拉曼峰1366CHT 1的強(qiáng)度可定量的比較不同離子之間的差別，結(jié)果顯示該芯片具有較好的 特異性可以準(zhǔn)確識(shí)別實(shí)際體系中的鉛離子。
[0091] 實(shí)施例9:本發(fā)明所述芯片的重建以及循環(huán)使用試驗(yàn)
[0092] 1、本發(fā)明所述芯片的重建
[0093]在一次檢測(cè)后，用PBS清洗芯片以除去殘余的DNA和鉛離子，將材料取出，與溶解于 雜交緩沖液中substrate strand DNA(17DS，5'-ACTCACTATrAGGAAGAGATG-3'，rA (ribonucleotide adenosine)代表核糖核苷酸中的堿基A)(濃度:0.001M)，37°C恒溫，在恒 溫混勻儀中混合孵育24小時(shí)，通過(guò)DNA互補(bǔ)配對(duì)形成DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，然后用PBS沖洗幾次，氮 氣吹干，重建得到核(銀)_衛(wèi)星(金)納米顆粒修飾的硅晶片的SERS芯片(參見(jiàn)圖5中a圖）。
[0094] 2、本發(fā)明所述芯片的循環(huán)使用試驗(yàn)
[0095]將重建的芯片，于室溫下，浸泡在InM的鉛離子溶液中，反應(yīng)70分鐘后，取出芯片， 進(jìn)行拉曼實(shí)驗(yàn)，然后循環(huán)使用，每一次重建之后拉曼強(qiáng)度都會(huì)明顯的增強(qiáng)(每次重建后拉曼 強(qiáng)度都會(huì)明顯增強(qiáng)指的是剛重建后未使用的芯片的拉曼強(qiáng)度沒(méi)有或者很微弱，當(dāng)加入鉛離 子之后拉曼信號(hào)會(huì)明顯的增強(qiáng)，參見(jiàn)圖5中b圖），為了定量的比較，由圖5中的c圖中拉曼峰 1366CHT1的強(qiáng)度計(jì)算得知三次循環(huán)后強(qiáng)度僅減弱了 11%，結(jié)果表明本發(fā)明芯片易于重建，可 多次使用，可循環(huán)性高，大大降低制備成本。
[0096]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng) 視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種定量檢測(cè)實(shí)際水樣中鉛離子濃度的硅基SERS芯片，其特征在于，由銀納米顆粒 修飾的硅晶片、金納米顆粒、SEQIDN0 :1-2和SEQIDN0:4所示核苷酸序列，以及在SEQID NO: 3所不核昔酸序列5'端偶聯(lián)有疏基、3'端偶聯(lián)有焚光染料的序列片段組成； 其中，銀納米顆粒修飾的娃晶片與SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列連接，金納米顆粒與 SEQ ID NO: 2所示核苷酸序列連接，SEQ ID NO: 1-2所示核苷酸序列彼此形成互補(bǔ)雙鏈連 接，在SEQ ID N0:3所示核苷酸序列5'端偶聯(lián)有巰基、3'端偶聯(lián)有熒光染料的序列片段通過(guò) 末端巰基與金、銀納米顆粒共價(jià)連接，SEQ ID N0:4所示核苷酸序列與SEQ ID NO: 3所示核 苷酸序列彼此形成互補(bǔ)雙鏈連接。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述硅基SERS芯片，其特征在于，所述序列片段為在SEQ ID N0:3所 示核苷酸序列5'端偶聯(lián)有HS-(CH2)6-、3'端偶聯(lián)有Cy5熒光染料的序列片段。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述硅基SERS芯片，其特征在于，所述硅晶片為0.01~20 Ω處一勺口型 或η型硅晶片。4. 權(quán)利要求1所述硅基SERS芯片的制備方法，其特征在于，包括： 步驟1、制備銀納米顆粒修飾的硅晶片以及金納米顆粒； 步驟2、將已制備好的銀納米顆粒修飾的硅晶片與溶解于磷酸鹽緩沖液中的SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列恒溫混合孵育，然后向其中加入鹽溶液，過(guò)夜老化，得到SEQ ID NO: 1 所示核苷酸序列連接的銀納米顆粒修飾的硅晶片； 將所制備的金納米顆粒與溶解于磷酸鹽緩沖液中的SEQ ID N0:2所示核苷酸序列恒溫 混合孵育，然后向溶液中加入鹽溶液，過(guò)夜老化，得到SEQ ID N0:2所示核苷酸序列連接的 金納米顆粒； 步驟3、將步驟2所得硅晶片和金納米顆粒置于雜交緩沖液中恒溫混合孵育，通過(guò)SEQ ID NO: 1-2所示核苷酸序列互補(bǔ)配對(duì)形成雙鏈結(jié)構(gòu)，用PBS沖洗，然后氮?dú)獯蹈?，得到?(銀)-衛(wèi)星(金)納米顆粒修飾的硅晶片； 步驟4、將核(銀)_衛(wèi)星（金）納米顆粒修飾的硅晶片與在SEQ ID N0:3所示核苷酸序列 5'端偶聯(lián)有巰基、3'端偶聯(lián)有熒光染料的序列片段恒溫混勻并振蕩反應(yīng)，使SEQ ID N0:3所 示核苷酸序列末端巰基與金、銀納米粒子共價(jià)連接形成金-硫鍵和銀-硫鍵，然后向溶液中 加入鹽溶液，過(guò)夜老化； 將老化后的材料取出，與溶解于雜交緩沖液中SEQ ID N0:4所示核苷酸序列恒溫混合 孵育，通過(guò)DNA互補(bǔ)配對(duì)形成DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，然后用PBS沖洗，氮?dú)獯蹈桑玫剿龉杌鵖ERS芯 片。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述制備方法，其特征在于，所述銀納米顆粒修飾的硅晶片由以下方 法制備獲得： 將單晶硅片依次用去離子水、丙酮、去離子水進(jìn)行超聲清洗，然后再用濃硫酸和過(guò)氧化 氫混合溶液清洗； 清洗后的單晶硅片加入到氫氟酸溶液中進(jìn)行硅-氫化反應(yīng)，得到表面覆蓋Si-H鍵的硅 晶片，然后光面朝上，放入硝酸銀和氫氟酸的混合溶液中，緩慢振蕩反應(yīng)，銀離子被Si-H鍵 還原，在硅晶片表面原位生長(zhǎng)上一層均勻的銀納米顆粒，得到銀納米顆粒修飾的硅晶片，最 后用氮?dú)獯蹈杀砻妗?. 根據(jù)權(quán)利要求5所述制備方法，其特征在于，所述的過(guò)氧化氫質(zhì)量濃度為40%，濃硫 酸和40 %過(guò)氧化氫體積比為1: (0.01~100)。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述制備方法，其特征在于，所述氫氟酸溶液中氫氟酸的質(zhì)量濃度為 1 ~40%〇8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述制備方法，其特征在于，所述硅-氫化反應(yīng)的時(shí)間為1~60分鐘。9. 根據(jù)權(quán)利要求5所述制備方法，其特征在于，所述硝酸銀和氫氟酸的混合溶液由1M的 硝酸銀溶液和質(zhì)量濃度為40%的氫氟酸溶液按體積比為1:(0.01~100)配制而成。10. 根據(jù)權(quán)利要求5所述制備方法，其特征在于，所述振蕩反應(yīng)時(shí)間為1~60分鐘。11. 根據(jù)權(quán)利要求4所述制備方法，其特征在于，所述納米金顆粒通過(guò)檸檬酸還原法制 備獲得。12. 根據(jù)權(quán)利要求4所述制備方法，其特征在于，SEQ ID NO: 1-2所示核苷酸序列濃度均 為0.001~1M。13. 根據(jù)權(quán)利要求4所述制備方法，其特征在于，步驟2所述恒溫混合孵育為在25°C孵育 16小時(shí)。14. 根據(jù)權(quán)利要求4所述制備方法，其特征在于，步驟2和步驟4所述加入鹽溶液為將初 始濃度為1M的鹽溶液，每隔兩小時(shí)分3-5次加入，鹽溶液最終濃度為0.01~1M。15. 根據(jù)權(quán)利要求4所述制備方法，其特征在于，步驟3所述恒溫混合孵育為在37°C孵育 24小時(shí)。16. 根據(jù)權(quán)利要求4所述制備方法，其特征在于，步驟4所述振蕩反應(yīng)為在100~600轉(zhuǎn)每 分鐘、25 °C下反應(yīng)1~24小時(shí)。17. 根據(jù)權(quán)利要求4所述制備方法，其特征在于，步驟4所述恒溫混合孵育為在37°C孵育 1~24小時(shí)。18. 根據(jù)權(quán)利要求4所述制備方法，其特征在于，步驟4中在SEQ ID NO: 3所示核苷酸序 列5'端偶聯(lián)有巰基、3'端偶聯(lián)有熒光染料的序列片段、SEQ ID N0:4所示核苷酸序列濃度均 為0.001~1M。
【文檔編號(hào)】G01N21/65GK105842225SQ201610179491
【公開(kāi)日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2016年3月28日
【發(fā)明人】何耀, 史宇, 王后禹
【申請(qǐng)人】蘇州大學(xué)