使用的，如:但不僅限于等滲劑、緩沖 液、矯味劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、崩解劑和潤滑劑等;也可以是為了與所述物質(zhì)相適應(yīng) 而選擇使用的，如:但不僅限于乳化劑、增溶劑、抑菌劑、止痛劑和抗氧劑等，這類輔料能有 效提高組合物所含化合物的穩(wěn)定性和溶解性或改變化合物的釋放速率和吸收速率等，從而 改善各種化合物在生物體內(nèi)的代謝，進而增強組合物的給藥效果。此外，還可以為實現(xiàn)特定 的給藥目的或方式，如：緩釋給藥、控釋給藥和脈沖給藥等，而使用的輔料，如:但不僅限于 明膠、白蛋白、殼聚糖、聚醚和聚酯類高分子材料(如:但不僅限于，聚乙二醇、聚氨酯、聚碳 酸酯及其共聚物等）。所述有利于給藥的主要表現(xiàn)有:但不僅限于提高治療效果、提高生物 利用度、降低毒副作用和提高患者順應(yīng)性等。
[0063] 在水溶液注射劑中，輔料一般包括等滲劑和緩沖液，以及必要的乳化劑（如： Tweeen-80、Pluronic和Poloxamer等）、增溶劑和抑菌劑等。此外，還包括含有藥學(xué)上可接受 的其它藥用輔料，如:抗氧劑、pH調(diào)節(jié)劑和止痛劑等。
[0064] 用于制取口服液體制劑的輔料一般包括溶劑，以及必要的矯味劑、抑菌劑、乳化劑 和著色劑等。
[0065] 用于制取片劑的輔料一般包括填充劑(如:淀粉、糖粉、糊精、乳糖、可壓性淀粉、微 晶纖維素、硫酸鈣、磷酸氫鈣和甘露醇等）、粘合劑(如：乙醇、淀粉漿、羧甲基纖維素鈉、羥丙 基纖維素、甲基纖維素、乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、明膠溶液、蔗糖溶液和聚乙烯吡咯 烷酮的水溶液或醇溶液等）、崩解劑(如:干淀粉、羧甲基淀粉鈉、低取代羥丙基纖維素、交聯(lián) 聚乙烯吡咯烷酮和交聯(lián)羧甲基纖維素鈉)和潤滑劑(如:硬脂酸鎂、微粉硅膠、滑石粉、氫化 植物油、聚乙二醇4，000、聚乙二醇6，000和月桂醇硫酸鎂等)等。
[0066] 用于制取乳劑的輔料一般為水、油（如：脂肪酸）、乳化劑，以及必要的防腐劑和矯 味劑等。
[0067] 用于制取顆粒劑的輔料與片劑類似，但造粒過程不同。根據(jù)需要，將制得的顆粒劑 與助流劑混合后裝入膠囊即得膠囊劑。
[0068] 如本文所用，術(shù)語"對象"、"生物體"、"動物"或"患者"包括人、野生動物和家畜 (Livestock)。野生動物為自然狀態(tài)下未經(jīng)人工馴化的動物。家畜是為了提供食物來源而人 工飼養(yǎng)的動物，如:但不僅限于狗、貓、鼠、大鼠、倉鼠、豬、兔、奶牛、水牛、公牛、綿羊、山羊、 鵝和雞等。給予治療的"患者"或"生物體"優(yōu)先選擇哺乳動物，尤其是人。
[0069] 如本文所用，術(shù)語"預(yù)防"是指在未被臨床標(biāo)準(zhǔn)認(rèn)定的疾病前，各種用于防止疾病 發(fā)生或發(fā)展的手段或措施，包括醫(yī)學(xué)、物理或化學(xué)的方法，以阻止和降低疾病各種癥狀的發(fā) 生或發(fā)展。
[0070] 如本文所用，術(shù)語"治療"是指為了阻止和降低疾病的發(fā)生或發(fā)展，使疾病病程的 發(fā)展或加重得以抑制、遏制、減輕、改善、減緩、停止、延遲或反轉(zhuǎn)，所描述的保持和/或用藥 時的疾病的、紊亂的或病理學(xué)狀態(tài)的各種指標(biāo)包括減輕或減少癥狀或并發(fā)癥，或治愈或消 除疾病、紊亂或狀況。
[0071] 如本文所用，術(shù)語"藥物"是指可以用于預(yù)防或治療某種疾病的單一化合物、多種 化合物形成的組合物，或指以單一化合物為主要活性成分的組合物或制劑(formulation)， 還指由多種化合物為活性成分的組合物或制劑。"藥物"應(yīng)理解為不僅指根據(jù)一國之法律規(guī) 定，通過其設(shè)立的行政機構(gòu)審批并準(zhǔn)予生產(chǎn)的產(chǎn)品，還指在為了獲得通過審批和準(zhǔn)予生產(chǎn) 的過程中，所形成的含單一化合物為活性成分的各類物質(zhì)形態(tài)。"形成"應(yīng)理解為通過化學(xué) 合成、生物轉(zhuǎn)化或購買等途徑獲得。
[0072] 本發(fā)明提供的作為藥物組合物的給藥途徑，包括但不僅限于，口服(Oral)、鼻腔 (Nasal )、（面）頰（Buccal )、透皮（Trans dermal )、肺部（Pulmonal )、陰道（Vaginal)、皮下 (Subcutaneous)或靜脈（Intravenous)給予生物體。
[0073]本發(fā)明的主要優(yōu)點在于：
[0074] (1)首次揭示了蘆平曲韋、伊曲康唑、和/或法匹拉韋針對腸道病毒的協(xié)同抑制作 用；
[0075] (2)本發(fā)明組合物起效量低；
[0076] (3)本發(fā)明的組合物可大幅降低臨床用藥量，既可降低生產(chǎn)成本，也能減輕患者負 擔(dān)。
[0077] (4)本發(fā)明的組合物可以阻止耐藥株的產(chǎn)生。
[0078] 下面結(jié)合具體實施例，進一步詳陳本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明詳細條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條 件如美國Sambrook. J等著《分子克隆實驗室指南》(黃培堂等譯，北京:科學(xué)出版社，2002年） 中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計 算。以下實施例中所用的實驗材料和試劑如無特別說明均可從市售渠道獲得。
[0079]材料和方法：
[0080] 細胞、病毒和化合物
[0081] RD(人橫紋肌瘤）、Vero(非洲綠猴腎)細胞在含有1%青霉素/鏈霉素(penicillin/ streptomycin,P/S)和 10%胎牛血清（fetal bovine serum,FBS)的DMEM培養(yǎng)基中，于37°C， 5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。EV71FY573株(GenBank登錄號HM064456)用于評估化合物抗病毒活 性、病毒效價減少實驗和聯(lián)合用藥實驗。EV71G082用于病毒效價減少實驗、突變病毒篩選以 及評估實驗。化合物伊曲康唑、蘆平曲韋、法匹拉韋和GW5074分別購自Sigma-Aldrich、 Santa Cruz和Chembest公司，并溶解于DMSO中進行實驗。蘇拉明購自拜爾公司并溶解于培 養(yǎng)基中。
[0082]化合物的評估實驗
[0083] 從Sigma-Aldrich購得伊曲康唑，溶于DMSO中，終濃度為10mM，從拜爾購得蘇拉明， 溶于含有2%FBS的培養(yǎng)基中，終濃度為50mM，從Chembest購得法匹拉韋，溶于DMSO中，終濃 度為400mM，從Santa Cruz公司購得蘆平曲韋，溶于DMSO中，終濃度為2mM，從Sigma公司購得 GW5074，溶于DMSO中，終濃度為IOmM。為了評估五種化合物抑制EV71誘導(dǎo)的CPE活性，本發(fā)明 人進行了劑量依賴實驗。向96孔白板(Corning Costar)的每孔中加入50μ1含有10000個RD 細胞的DMEM，在37 °C，5 % CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，每孔分別加入梯度稀釋的被測化合物 (對于溶解于DMSO中的化合物，DMSO終濃度為0.25 % )，對照組中加入5μ1 0.25 %的DMSO或 培養(yǎng)基。然后加入45μ1含150PFU的病毒稀釋液，每孔的終體積為100μΙ，培養(yǎng)96小時后，取 出，于室溫下平衡30分鐘。而后每孔加入50μ1 Ce IlTiter-Glo (Promega)試劑，在室溫下放 置 10到30分鐘，使用Veritas Microplate Luminometer(Turner BioSystem)酶標(biāo)儀進行檢 測。為了測定化合物對細胞的作用，本發(fā)明人進行了細胞毒性實驗，實驗方法與劑量依賴實 驗相同，但是不再加入病毒液，取而代之的是等體積的含2%FBS和1%P/S的DMEM。
[0084]聯(lián)合用藥實驗
[0085]為評估聯(lián)合用藥療法對EV71感染的抑制效果，本發(fā)明人采用了棋盤法進行實 驗[21-22]。向96孔白板(Corning Costar)的每孔中加入50μ1含有10000個RD細胞的DMEM，在 37°C，5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，向96孔板的中央60個孔中分別加入5μ1兩種2倍稀釋的 被測化合物，對照組中加入5μ10.25%的DMSO或培養(yǎng)基。然后加入40μ1含150PFU的病毒稀釋 液，每孔的終體積為100μΙ，培養(yǎng)96小時后，取出，于室溫下平衡30分鐘。而后每孔加入50μ1 Cel ITiter-Glo(Promega)試劑，在室溫下放置10到30分鐘，使用Veritas Microplate Luminometer(Turner BioSystem)酶標(biāo)儀進行檢測。為了測定同時加入兩種化合物對細胞 的影響，本發(fā)明人進行了細胞毒性實驗，實驗方法與聯(lián)合用藥實驗相同，但是不再加入病毒 液，取而代之的是等體積的含2%FBS和1%P/S的DMEM。實驗結(jié)果用MacSynergy II軟件分析 并得出3D示意圖。
[0086]病毒效價的測定
[0087] 測EV71G082株和重組病毒的效價，向12孔板(Corning Costar)的每孔中加入1ml 含3\105個￥〇仰細胞的01^1，培養(yǎng)2411。病毒進行10倍倍比稀釋，即將27以1病毒液與243以1的 含2%FBS和I %P/S的DMEM混勻。吸出12孔板中的培養(yǎng)基，每孔加入200μ1病毒液。放置在37 °C，5%C02的培養(yǎng)箱中感染lh，每隔15分鐘輕輕搖動。然后吸出病毒液，加入1ml含0.8%甲 基纖維素以9皿(^(16 11，0311^〇(^6111)和2%?85的01^]\1，在37°(：，5%〇)2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6天， 置于3.7%的福爾馬林中固定Ih后，用1%的結(jié)晶紫染色。
[0088] EV71FY573株的滴度是通過半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(TCID5q)測定的。向96孔透明板 每孔中加入20000個RD細胞，培養(yǎng)24小時后加入100μΙ 10倍倍比稀釋的病毒（從10-^lJlO 1)，每個稀釋度的病毒加入到10個孔中。感染1小時后，吸出病毒，加入含2%FBS的DMEMt^ 37°C，5 %⑶:^的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天后置于3.7 %的福爾馬林中固定Ih后，用1 %的結(jié)晶紫染 色。用Reed-Muench方法測病毒滴度并表示為TCID5Q/ml。
[0089]病毒效價減少實驗
[0090] 在12孔板中接種RD細胞，3X IO5個/孔，37°C培養(yǎng)過夜，24小時后加入MOI = O. 1的 EV71病毒液和2倍倍比稀釋的伊曲康唑、蘆平曲韋、法匹拉韋、蘇拉明和GW5074，在37 °C培養(yǎng) 48h后，收集上清液，放到-80 °C冰箱中凍存，然后測定病毒滴度。為測定伊曲康唑和蘆平曲 韋聯(lián)合用藥對EV71效價的抑制作用，本發(fā)明人在12孔板中接種Vero細胞，3 X IO5個/孔，37 °C培養(yǎng)過夜，24小時后加入MOI = 0.1的EV71病毒液和不同濃度的伊曲康唑和蘆平曲韋，在 37 °C培養(yǎng)48h后，收集上清液，放到-80 °C冰箱中凍存，然后測定病毒滴度。
[0091] 免疫染色實驗
[0092] 為定性檢測耐藥株篩選實驗中的病毒，本發(fā)明人進