專利名稱：腸道病毒71型顱內(nèi)注射感染c57/bl6乳鼠模型的建立方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種腸道病毒71型顱內(nèi)注射接種感染C57/BL6乳鼠模型的建立方法。
背景技術(shù)：
腸道病毒7I 型(EV7I)是手足口病(Hand Foot and Mouth Disease, HFMD)主要病原。2008年至今EV71感染為主引起的HFMD在中國大陸多個省市流行，并且其臨床特征發(fā)生改變，伴神經(jīng)系統(tǒng)、心、肺損傷的重癥發(fā)病率升高，時有病死發(fā)生，但是目前對其感染和致病機(jī)制、病毒基因與毒力關(guān)系等缺乏了解，臨床急需有效的治療藥物和預(yù)防性疫苗。EV71病毒具有嚴(yán)格的宿主特異性，目前缺乏成熟穩(wěn)定的動物模型。這一現(xiàn)狀從根本上限制了 EV71致病機(jī)理、臨床治療及預(yù)防疫苗的研究。因此，本專利涉及的穩(wěn)定的EV71 顱內(nèi)注射途徑感染C57/BL6乳鼠模型為EV71臨床基礎(chǔ)研究以及疫苗研發(fā)提供了有力的工具。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供了一種腸道病毒71型顱內(nèi)注射感染C57/BL6乳鼠模型的建立方法，動物模型的建立可促進(jìn)腸道病毒71型病原學(xué)和致病機(jī)制的研究，用于高效抗病毒藥物的篩選和預(yù)防性疫苗的研制，為EV71臨床基礎(chǔ)研究以及疫苗研制和開發(fā)提供了有力的工具。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的一種腸道病毒71型顱內(nèi)注射感染C57/BL6乳鼠模型的建立方法，包括以下步驟 取C57/BL6乳鼠，顱內(nèi)注射病毒液，即得腸道病毒71型感染的小鼠模型。所述病毒液注射量為20 μ L，是通過以下方法制得的將EV71毒種，以 200 μ L/100mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶的接種量接種MA104細(xì)胞，37°C,5% CO2培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞病變情況，至MA104細(xì)胞約70%出現(xiàn)凝集、皺縮時，將整瓶細(xì)胞凍融，離心取上清，即得到EV71的病毒液。所述EV71毒種，為現(xiàn)有技術(shù)中已有的，常規(guī)取得即可，本發(fā)明對此無限制，不再贅述。所述建立方法，還包括以下小鼠模型的鑒定步驟飼養(yǎng)上述接種腸道病毒71型的乳鼠，2天后，后肢出現(xiàn)反應(yīng)遲緩、后肢癱瘓，5天后死亡的，即為感染成功的小鼠模型。本發(fā)明成功地建立了穩(wěn)定的腸道病毒71型感染的乳鼠模型，其后肢癱瘓率一般為80% 100%，死亡率為30 100%。本發(fā)明為科研人員研究腸道病毒71型病原學(xué)、腸道病毒71型致病機(jī)制以及高效抗病毒藥物的篩選和疫苗的研制提供了基礎(chǔ)和工具，具有廣闊的應(yīng)用前景。


圖1為臨床分離毒株的RT-PCR鑒定的電泳圖，其中，M = Maker (D2000)，N=陰性細(xì)胞對照，B =空白試劑對照，1 =分離毒株。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。實施例1建立感染腸道病毒71型的乳鼠模型步驟如下1、EV71的分離鑒定本發(fā)明所采用的EV71毒株是從臨床的重癥手足口病人的大便標(biāo)本中分離的，同時采用人橫紋肌肉瘤細(xì)胞株(RD)、恒河猴腎細(xì)胞株(MA104)和非洲綠猴腎細(xì)胞株(Vero)三種細(xì)胞對標(biāo)本中的病毒進(jìn)行分離，結(jié)果三種細(xì)胞上菌出現(xiàn)了細(xì)胞病變，傳代后凍存毒種。然后提取分離到的EV71基因組RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用EV71國家標(biāo)準(zhǔn)引物對分離毒株進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明分離毒株在226bp處出現(xiàn)了很亮的目的條帶(如圖1所示)，可證實從臨床手足口重癥病人大便標(biāo)本中分離的毒株為EV71。2、EV71感染動物模型的建立2.1小鼠的準(zhǔn)備購買SPF級別的C57/BL6孕鼠2組，每只生產(chǎn)乳鼠6只，25°C、濕度50 %，分格飼養(yǎng)在ABSL-2實驗室的凈化動物飼養(yǎng)柜內(nèi)，觀察動物生長情況，C57/BL6乳鼠生長狀態(tài)良好。2. 2毒種的準(zhǔn)備將分離的EV71毒種，以200yL/100mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶的接種量接種MA104細(xì)胞， 37°C、5% CO2培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞病變情況。接種EV71后第2天，MA104細(xì)胞約70%出現(xiàn)了凝集、皺縮，將整瓶細(xì)胞凍融后，離心取上清，即得到EV71的病毒液。2. 3EV71感染動物模型的建立2. 3. 1動物分組將兩組動物分別設(shè)為病毒組和正常對照組，病毒組顱內(nèi)注射接種EV71病毒，正常對照組顱內(nèi)注射接種含2%胎牛血清的1640培養(yǎng)液。2·32接種EV71采用無菌的微量進(jìn)樣器，病毒組每只C57/BL6乳鼠顱內(nèi)注射病毒液20 μ L，正常對照組每只C57/BL6乳鼠顱內(nèi)注射含2%胎牛血清的1640培養(yǎng)液20 μ L。然后將動物按相同的條件飼養(yǎng)在凈化動物飼養(yǎng)柜內(nèi)，每天觀察動物。2. 3. 3接毒后的觀察接種0天及1天病毒組和正常對照組均無異常；接種2天后病毒組動物后肢全部出現(xiàn)明顯反應(yīng)遲緩、后肢癱瘓，正常對照組無異常，取兩組動物各3只分別進(jìn)行解剖固定； 至接種5天病毒組剩余乳鼠均死亡，正常對照組無異常，動物模型建立成功。
權(quán)利要求
1.一種腸道病毒71型顱內(nèi)注射感染C57/BL6乳鼠模型的建立方法，其特征在于，包括以下步驟取C57/BL6乳鼠，顱內(nèi)注射病毒液，即得腸道病毒71型感染的小鼠模型。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腸道病毒71型顱內(nèi)注射感染C57/BL6乳鼠模型的建立方法，其特征在于所述病毒液注射量為20 μ L，是通過以下方法制得的將EV71毒種，以 200 μ L/100mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶的接種量接種MA104細(xì)胞，37°C,5% CO2培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞病變情況，至MA104細(xì)胞70%出現(xiàn)凝集、皺縮時，將整瓶細(xì)胞凍融，離心取上清，即得到EV71的病毒液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腸道病毒71型顱內(nèi)注射感染C57/BL6乳鼠模型的建立方法， 其特征在于還包括以下小鼠模型的鑒定步驟飼養(yǎng)上述接種腸道病毒71型的乳鼠，2天后，后肢出現(xiàn)反應(yīng)遲緩、后肢癱瘓，5天后死亡的，即為感染成功的乳鼠模型。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種腸道病毒71型顱內(nèi)注射感染C57/BL6乳鼠模型的建立方法取C57/BL6乳鼠，顱內(nèi)注射病毒液，即得腸道病毒71型感染的乳鼠模型。所述病毒液注射量為20μL，是通過以下方法制得的將EV71毒種，以200μL/100mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶的接種量接種MA104細(xì)胞，37℃、5％CO2培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞病變情況，至MA104細(xì)胞有約70％出現(xiàn)凝集、皺縮時，將整瓶細(xì)胞凍融，離心取上清，即得到EV71的病毒液。本發(fā)明成功地建立了穩(wěn)定的腸道病毒71型顱內(nèi)注射感染C57/BL6乳鼠模型，為科研人員研究腸道病毒71型的病原特征和致病機(jī)制提供了有力的工具，為高效抗病毒藥物的篩選和疫苗的研制提供了基礎(chǔ)，具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號A01K67/027GK102366427SQ20111032783
公開日2012年3月7日 申請日期2011年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月25日
發(fā)明者張穎, 蓋中濤 申請人:濟(jì)南市傳染病醫(yī)院