(Thermo Fisher Scientific株式會(huì)社制)測(cè)定剝離液中的抗體量，并用其除以固相化面積，由此算出吸附濃度。
[0184]實(shí)施例1的培養(yǎng)容器中，僅在其內(nèi)側(cè)的一面固相化有抗CD3抗體。
[0185]關(guān)于實(shí)施例1的培養(yǎng)容器的固相化濃度的測(cè)定結(jié)果是，固相化面中的抗CD3抗體的濃度為40ng/cm2o
[0186](實(shí)施例2)
[0187]與實(shí)施例1同樣地制作IlcmX 22.5cm(約225cm2)的袋。
[0188]然后，在該袋中封入空氣約600ml，并且接著封入溶解有5yg的抗CD3抗體(Miltenyi B1tec株式會(huì)社制)的磷酸緩沖液(Japan Life Technologies株式會(huì)社制)1ml。此外進(jìn)行與實(shí)施例1同樣的處理，制造實(shí)施例2的培養(yǎng)容器。
[0189]實(shí)施例2的培養(yǎng)容器中，僅在其內(nèi)側(cè)的一面固相化有抗CD3抗體。
[0190]關(guān)于實(shí)施例2的培養(yǎng)容器的固相化濃度的測(cè)定結(jié)果，固相化面中的抗CD3抗體的濃度為 llng/cm2。
[0191](比較例I)
[0192]與實(shí)施例1同樣地制作IlcmX 22.5cm(約225cm2)的袋。[Ο193] 然后，在該袋中封入溶解有50yg的抗CD3抗體(Miltenyi B1tec株式會(huì)社制)的磷酸緩沖液(Japan Life Technologies株式會(huì)社制)1ml，使磷酸緩沖液的液滴與袋內(nèi)的上下兩面接觸，在26 °C靜置60分鐘。然后，用磷酸緩沖液40ml進(jìn)行3次袋內(nèi)的清洗，制造比較例I的培養(yǎng)容器。
[0194]比較例I的培養(yǎng)容器在其內(nèi)側(cè)的兩面固相化有抗⑶3抗體。
[0195]關(guān)于比較例I的培養(yǎng)容器的固相化濃度的測(cè)定結(jié)果，容器內(nèi)表面的抗CD3抗體的濃度為 25ng/cm2。
[0196](比較例2)
[0197]與實(shí)施例1同樣地制作IlcmX 22.5cm(約225cm2)的袋。
[0198]然后，在該袋中封入空氣約600ml，并且接著封入溶解有5yg的抗CD3抗體(Miltenyi B1tec株式會(huì)社制)的磷酸緩沖液(Japan Life Technologies株式會(huì)社制)10ml。此時(shí)，以使磷酸緩沖液的液滴僅與袋內(nèi)表面的一面(固相化面)接觸的方式進(jìn)行。
[0199]然后，在26°C的條件下手動(dòng)搖動(dòng)袋I分鐘，使磷酸緩沖液的液滴以1m/分鐘的速度在袋內(nèi)的底面上移動(dòng)，在袋內(nèi)形成固相化面。進(jìn)一步，用磷酸緩沖液1ml進(jìn)行3次袋內(nèi)的清洗，制造比較例2的培養(yǎng)容器。
[0200]比較例2的培養(yǎng)容器中，僅在其內(nèi)側(cè)的一面固相化有抗⑶3抗體。
[0201]關(guān)于比較例2的培養(yǎng)容器的固相化濃度的測(cè)定結(jié)果，固相化面中的抗CD3抗體的濃度為 8ng/cm2。
[0202][實(shí)驗(yàn)2:淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)]
[0203](活化工序)
[0204]對(duì)于由實(shí)驗(yàn)I的實(shí)施例1、2和比較例1、2得到的培養(yǎng)容器，使用夾子分別以使培養(yǎng)部為5cmX IIcm的方式進(jìn)行劃分。
[0205]然后，將人末梢血單核細(xì)胞(Cell Applicat1ns株式會(huì)社制)5.8 X 14個(gè)懸浮于加入有10%小牛血清(Japan Life Technologies株式會(huì)社制)的ALyS505N_7培養(yǎng)基(株式會(huì)社細(xì)胞科學(xué)研究所制)，將4ml封入培養(yǎng)容器。然后，直接在37°C靜置75小時(shí)，進(jìn)行淋巴細(xì)胞的活化工序。
[0206]此時(shí)，實(shí)施例1、2和比較例2以使培養(yǎng)容器的固相化面朝下的方式進(jìn)行。此外，如上所述，比較例I的培養(yǎng)容器中在其內(nèi)側(cè)的上下兩面固相化有同量的抗CD3抗體，沒(méi)有上下的區(qū)別，即沒(méi)有固相化面與非固相化面的區(qū)別。
[0207](增殖工序)
[0208]在結(jié)束了活化工序的培養(yǎng)容器中追加上述培養(yǎng)基4ml，將培養(yǎng)容器上下反轉(zhuǎn)，直接在37°C靜置26小時(shí)，進(jìn)行淋巴細(xì)胞的增殖(第二實(shí)施方式中的第一增殖工序)。
[0209]然后，去掉夾子，將培養(yǎng)容器培養(yǎng)部的容積擴(kuò)大(第二實(shí)施方式中的容積擴(kuò)大工序)，追加上述培養(yǎng)基20ml，直接在37°C靜置62小時(shí)，繼續(xù)進(jìn)行淋巴細(xì)胞的增殖(第二實(shí)施方式中的第二增殖工序)。
[0210]在距離培養(yǎng)開(kāi)始的上述各操作的時(shí)刻(75小時(shí)后、75+26( = 101)小時(shí)后、75+26+62(=163)小時(shí)后)、以及去掉夾子后的18小時(shí)后(75+26+18( = 119))，計(jì)數(shù)各培養(yǎng)容器中的淋巴細(xì)胞數(shù)目。其結(jié)果如圖7所示。
[0211]如圖7所示，僅在培養(yǎng)容器內(nèi)的一面分別固相化有40ng/cm2、Ilng/cm2的抗⑶3抗體的實(shí)施例1、2中，在增殖工序中能夠使淋巴細(xì)胞顯著增殖。此時(shí)，在固相化濃度為40ng/cm2的情況(實(shí)施例1)與llng/cm2的情況(實(shí)施例2)之間，在增殖效率方面沒(méi)有看到顯著的差升。
[0212]另一方面，在培養(yǎng)容器內(nèi)的兩面固相化有抗CD3抗體的比較例I中，與實(shí)施例1、2相比，可知增殖工序中的淋巴細(xì)胞的增殖效率大幅降低。
[0213]另外，與實(shí)施例2相比稍微減少了所固相化的抗CD3抗體的濃度的比較例2中，在增殖工序中幾乎無(wú)法使淋巴細(xì)胞增殖。由此可知，優(yōu)選使固相化于培養(yǎng)容器的固相化面的抗⑶3抗體的濃度為約lOng/cm2以上。
[0214]然后，參照?qǐng)D16?圖21對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式所涉及的培養(yǎng)容器的制造方法的實(shí)施例和比較例進(jìn)行說(shuō)明。圖16、18、20為示出實(shí)施例和比較例的示意圖，圖17、19、21為示出實(shí)施例和比較例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖表的圖。
[0215][實(shí)驗(yàn)3:抗體固相化培養(yǎng)袋的制造]
[0216](實(shí)施例3)
[0217]使用LaboPlasto Mill(株式會(huì)社東洋精機(jī)制作所制)作為塑料擠出成形裝置，將低密度聚乙烯擠出成形，成形出厚度ΙΟΟμπι的膜。然后，使用脈沖熱封機(jī)，用該膜制作IlcmX
22.5cm(約225cm2)的袋，對(duì)該袋進(jìn)行γ射線滅菌后供于實(shí)驗(yàn)。
[0218]然后，將該袋載置于裝載臺(tái)后封入空氣約600ml，并且接著以液滴的狀態(tài)封入溶解有50yg的抗CD3抗體(Mi I teny i B i o tec株式會(huì)社制)的磷酸緩沖液(Japan LifeTechnologies株式會(huì)社制)10ml。此時(shí)，以使該磷酸緩沖液的液滴僅與袋內(nèi)表面的底面接觸的方式進(jìn)行。
[0219]然后，在26°C的條件下手動(dòng)搖動(dòng)袋I分鐘，使磷酸緩沖液的液滴以1m/分鐘的速度在袋內(nèi)的底面上移動(dòng)，使抗體吸附于袋內(nèi)的底面，制造抗體固相化培養(yǎng)袋。
[0220]固相化濃度的測(cè)定以下述方式進(jìn)行。
[0221 ]首先，除去培養(yǎng)容器內(nèi)的液滴，使固相化面與包含I %十二烷基硫酸鈉(日本西格瑪奧德里奇合同會(huì)社制)的磷酸緩沖液(同上)500μ1接觸，靜置30分鐘后，用Present Mixer(Tietech株式會(huì)社制)施加強(qiáng)振動(dòng)，剝離所吸附的抗體。使用Micro BCATM Protein AssayKit(Thermo Fisher Scientific株式會(huì)社制)測(cè)定剝離液中的抗體量，并用其除以固相化面積，由此算出單位面積的蛋白質(zhì)吸附量(以下稱為吸附濃度)。
[0222]實(shí)施例3的培養(yǎng)容器中，僅在其內(nèi)側(cè)的一面(底面)固相化有抗CD3抗體。關(guān)于實(shí)施例3的培養(yǎng)容器的固相化濃度的測(cè)定結(jié)果，抗CD3抗體的吸附濃度為41.5ng/cm2。
[0223](實(shí)施例4)
[0224]與實(shí)施例3同樣地制作IlcmX 22.5cm(約225cm2)的袋。
[0225]然后，在該袋中封入空氣約600ml，并且接著以液滴的狀態(tài)封入溶解有50yg的抗⑶3抗體(Miltenyi B1tec株式會(huì)社制)的磷酸緩沖液(Japan Life Technologies株式會(huì)社制)1ml ο
[0226]然后，在26°C的條件下手動(dòng)搖動(dòng)袋2.5分鐘，使磷酸緩沖液的液滴以1m/分鐘的速度在袋內(nèi)的底面上移動(dòng)，使抗體吸附于袋內(nèi)的底面。然后，將袋上下反轉(zhuǎn)，再次手動(dòng)搖動(dòng)袋2.5分鐘，使上述液滴以1m/分鐘的速度在袋內(nèi)的底面(上下反轉(zhuǎn)前的頂面)上移動(dòng)。由此，使抗體吸附于袋內(nèi)壁的兩面，制造抗體固相化培養(yǎng)袋。
[0227]實(shí)施例4的培養(yǎng)容器在其內(nèi)側(cè)的兩面固相化有抗CD3抗體。關(guān)于實(shí)施例4的培養(yǎng)容器的固相化濃度的測(cè)定結(jié)果，抗CD3抗體的吸附濃度為31.2ng/cm2。
[0228](比較例3)
[0229]與實(shí)施例3同樣地制作IlcmX 22.5cm(約225cm2)的袋。
[0230]然后，在不在該袋中封入空氣的情況下封入溶解有50yg的抗⑶3抗體(MiltenyiB1tec株式會(huì)社制)的磷酸緩沖液(Japan Life Technologies株式會(huì)社制)1ml，使該磷酸緩沖液與袋內(nèi)的上下兩面接觸，在26°C靜置60分鐘。然后，用磷酸緩沖液40ml進(jìn)行3次袋內(nèi)的清洗，制造抗體固相化培養(yǎng)袋。
[0231 ]比較例3的培養(yǎng)容器在其內(nèi)側(cè)的兩面固相化有抗CD3抗體。關(guān)于比較例3的培養(yǎng)容器的固相化濃度的測(cè)定結(jié)果，抗CD3抗體的吸附濃度為26.1ng/cm2。
[0232](比較例4)
[0233]與實(shí)施例3同樣地制作IlcmX 22.5cm(約225cm2)的袋。
[0234]然后，在不在該袋中封入空氣的情況下以液滴的狀態(tài)封入溶解有50yg的抗⑶3抗體(Miltenyi B1tec株式會(huì)社制)的磷酸緩沖液(Japan Life Technologies株式會(huì)社制)10ml。然后，在26°C的條件下手動(dòng)搖動(dòng)袋5分鐘，使磷酸緩沖液的液滴以1m/分鐘的速度在袋內(nèi)移動(dòng)，使抗體吸附于袋的內(nèi)表面。進(jìn)一步，用磷酸緩沖液1ml進(jìn)行3次袋內(nèi)的清洗，制造抗體固相化培養(yǎng)袋。
[0235]比較例4的培養(yǎng)容器在其內(nèi)側(cè)的兩面固相化有抗CD3抗體。關(guān)于比較例4的培養(yǎng)容器的固相化濃度的測(cè)定結(jié)果，抗CD3抗體的吸附濃度為23.8ng/cm2。
[0236]如圖17所示，實(shí)施例3、實(shí)施例4、比較例3和比較例4中抗體對(duì)培養(yǎng)容器底面的單位面積的吸附效率(吸附濃度X 225cm2/50000ngX 100)分別為19%、14%、12%、11 %。
[0237]S卩，根據(jù)實(shí)施例3的方法，即使固相化時(shí)間為I分鐘，與固相化時(shí)間為60分鐘的比較例3的結(jié)果相比，吸附效率也增大60%左右。
[0238]另一方面，在不在培養(yǎng)容器中封入氣體的情況下使液滴移動(dòng)從而進(jìn)行固相化的比較例4中，與比較例3的結(jié)果相比，吸附效率小。
[0239]另外，認(rèn)為實(shí)施例4的吸附效率之所以小于實(shí)施例3的吸附效率，是因?yàn)閷?shí)施例4的吸附面積為實(shí)施例3的吸附面積的2倍。
[0240]進(jìn)一步，對(duì)實(shí)施例4與比較例4的結(jié)果進(jìn)行比較可知，通過(guò)在培養(yǎng)容器中放入氣體的基礎(chǔ)上使液滴移動(dòng)來(lái)進(jìn)行固相化，由此能夠?qū)⑽叫侍岣?0%左右。
[0241]這樣地，根據(jù)本實(shí)施方式的培養(yǎng)容器的制造方法，即使在與以往相比更短的時(shí)間內(nèi)，也能夠?qū)⒏嗟目贵w固相化于培養(yǎng)容器。另外，也能夠使用比以往更少量的抗體將更多的抗體固相化于培養(yǎng)容器。
[0242][實(shí)驗(yàn)4:抗體固相化燒瓶的制造]
[0243](實(shí)施例5)
[0244]在漂浮培養(yǎng)用燒瓶800(Sumimoto Bakelite，聚苯乙烯制，底面積225cm2)中以液滴的狀態(tài)封入溶解有50yg的抗CD3抗體(Mi ltenyi B1tec株式會(huì)社制)的磷酸緩沖液(Japan Life Techno1gies株式會(huì)社制)10ml。在26°C的條件下手動(dòng)搖動(dòng)燒瓶5分鐘，使磷酸緩沖液的液滴以1m/分鐘的速度在袋內(nèi)的底面上移動(dòng)，使抗體吸附于燒瓶?jī)?nèi)的底面，制造抗體固相化燒瓶。實(shí)施例5的抗體固相化燒瓶的抗CD3抗體的濃度為27.9ng/cm20
[0245](比較例5)
[0246]在漂浮培養(yǎng)用燒瓶800( Sumimoto Bakelite，聚苯乙稀制，底面積225cm2)中裝入溶解有50口8的抗003抗體(1;[]^61171 B1tec株式會(huì)社制)的磷酸緩沖液(Japan LifeTechnologies株式會(huì)社制)1ml，使抗體溶液遍布整個(gè)底面，在26°C靜置60分鐘。由此，使抗體吸附于燒瓶的底面，制造抗體固相化燒瓶。比較例5的抗體固相化燒瓶的抗CD3抗體的濃度為 27.6ng/cm2。
[0247](比較例6)<