培養(yǎng)容器、淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)方法、培養(yǎng)容器的制造方法和固相化裝置的制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)，特別涉及用于培養(yǎng)淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)容器、和淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)方法、固相化有蛋白質(zhì)的培養(yǎng)容器的制造方法和固相化裝置。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來，在醫(yī)藥品的生產(chǎn)、基因治療、再生醫(yī)療、免疫療法等領(lǐng)域中，要求在人工環(huán)境下高效地大量培養(yǎng)細(xì)胞和組織、微生物等。
[0003]這樣的狀況下，在包含透氣性膜的培養(yǎng)袋中封入細(xì)胞和培養(yǎng)液，在封閉系統(tǒng)中大量培養(yǎng)細(xì)胞。
[0004]但是，為了使淋巴細(xì)胞增殖，最初需要使淋巴細(xì)胞活化。因此，在固相化有抗CD3抗體的基材上使淋巴細(xì)胞活化，之后將活化的淋巴細(xì)胞封入培養(yǎng)袋進(jìn)行增殖。
[0005]此時(shí)，一般如圖8所示，為了使淋巴細(xì)胞活化而使用在底面固相化有抗CD3抗體的燒瓶，在淋巴細(xì)胞被活化后，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)袋中，進(jìn)行淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)。這樣操作的理由是，由于淋巴細(xì)胞具有如下的性質(zhì):為了進(jìn)行增殖，需要抗CD3抗體所致的刺激，另一方面，若持續(xù)受到抗CD3抗體所致的刺激，則會變得難以進(jìn)行增殖。因此，在淋巴細(xì)胞活化后，需要在沒有固相化有抗CD3抗體的容器中進(jìn)行培養(yǎng)。
[0006]作為用于使淋巴細(xì)胞活化的培養(yǎng)容器，例如可舉出專利文獻(xiàn)I所述的封閉系統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)容器等。該封閉系統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)容器在容器內(nèi)的整個(gè)面上固相化有抗CD3抗體(0048段、0057段)，能夠高效地使淋巴細(xì)胞活化。
[0007]另外，如上所述，淋巴細(xì)胞的活化一般使用抗CD3抗體來進(jìn)行。即，在固相化有抗CD3抗體的容器內(nèi)進(jìn)行淋巴細(xì)胞的活化，然后將活化了的淋巴細(xì)胞封入未固相化有抗CD3抗體的培養(yǎng)袋內(nèi)進(jìn)行淋巴細(xì)胞的增殖。
[0008]因此，在活化淋巴細(xì)胞之前，在用于活化淋巴細(xì)胞的容器內(nèi)需要固相化(涂布)抗CD3抗體。
[0009]作為現(xiàn)有的固相化的方法，一般地說為:在含有抗CD3抗體的溶液中浸漬燒瓶內(nèi)的底面并將其靜置后，除去該溶液，由此進(jìn)行抗CD3抗體的固相化。
[0010]具體地，例如專利文獻(xiàn)2中記載了:在燒瓶內(nèi)的底面均勻地浸漬抗CD3抗體，在冰箱中保存過夜后，去除抗CD3抗體，制備抗體固相化燒瓶(0035?0036段、圖1)。
[0011]另外，專利文獻(xiàn)I中記載了:將溶解有抗CD3抗體的溶解液封入容器的收容部，靜置規(guī)定時(shí)間，由此將抗CD3抗體固相化到容器的膜表面(0015段、圖1)。
[0012]專利文獻(xiàn)1:日本特開2007-175028號公報(bào)
[0013]專利文獻(xiàn)2:日本專利第4399710號公報(bào)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014]發(fā)明要解決的課題
[0015]然而，在僅使用專利文獻(xiàn)I中記載的封閉系統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)容器進(jìn)行淋巴細(xì)胞培養(yǎng)的情況下，在淋巴細(xì)胞活化后也會持續(xù)受到抗CD3抗體所致的刺激，因此淋巴細(xì)胞受到過量刺激而使增殖受到抑制。因此，為了大量高效地培養(yǎng)淋巴細(xì)胞，期望使用該封閉系統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)容器作為活化專用容器，在另外的培養(yǎng)容器中進(jìn)行細(xì)胞的增殖。
[0016]因此，該現(xiàn)有技術(shù)在要大量高效地培養(yǎng)淋巴細(xì)胞的情況下，存在轉(zhuǎn)移活化了的細(xì)胞的繁雜性、產(chǎn)生污染風(fēng)險(xiǎn)的問題。
[0017]因此，本發(fā)明人等經(jīng)過廣泛深入的研究開發(fā)了一種用于培養(yǎng)淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)容器，其包含透氣性膜，僅在相對的容器內(nèi)表面的一個(gè)面固相化有抗CD3抗體，，具有固相化面和非固相化面。而且，以使固相化面成為底面的方式配置培養(yǎng)容器進(jìn)行淋巴細(xì)胞的活化，然后以使非固相化面成為底面的方式配置培養(yǎng)容器進(jìn)行淋巴細(xì)胞的增殖，由此能夠成功地在單一的容器內(nèi)高效地進(jìn)行淋巴細(xì)胞的活化和增殖。
[0018]S卩，本發(fā)明的目的在于提供能夠通過單一的培養(yǎng)容器高效地進(jìn)行淋巴細(xì)胞的活化和增殖的培養(yǎng)容器、和淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)方法。
[0019]另外，專利文獻(xiàn)1、2中記載的現(xiàn)有固相化方法中存在如下的問題:為了使抗體充分地固相化而需要很長的靜置時(shí)間。
[0020]進(jìn)一步，現(xiàn)有方法中存在如下的問題:由于大部分抗體未吸附到容器內(nèi)而殘留在溶液中，因此必須使用量大于固相化量的抗體。例如如后所述存在如下的問題:在將通過現(xiàn)有方法封入有抗體的容器靜置I小時(shí)的情況下，吸附到容器內(nèi)的抗體為10%左右，其余約90%未固相化于容器而被廢棄。
[0021 ]在此，抗體等蛋白質(zhì)不耐熱，若在高溫條件下使其進(jìn)行吸附，則其功能喪失，因此是不易固相化于容器的材料。另一方面，期望使用少量蛋白質(zhì)在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)必要量的固相化。另外，抗體一般而言是高價(jià)的，因此期望降低無端廢棄的量。
[0022]因此，本發(fā)明人等經(jīng)過廣泛深入的研究發(fā)現(xiàn)，通過將蛋白質(zhì)溶液的液滴與氣體一起封入到容器內(nèi)、并使該液滴在容器內(nèi)表面上移動，由此可將集中在液滴的氣液界面的蛋白質(zhì)分子高效地吸附于容器，從而完成了本發(fā)明。
[0023]S卩，本發(fā)明的目的在于提供一種培養(yǎng)容器的制造方法，在要將蛋白質(zhì)固相化于容器內(nèi)表面時(shí)，將蛋白質(zhì)溶液的液滴與氣體一起封入到容器內(nèi)、并使該液滴在容器內(nèi)表面上移動，由此將蛋白質(zhì)高效地固相化于容器。本發(fā)明的目的還在于提供用于進(jìn)行上述方法的固相化裝置。
[0024]解決課題的方法
[0025]為了達(dá)成上述目的，本發(fā)明的培養(yǎng)容器為用于培養(yǎng)淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)容器，包含透氣性膜，僅在相對的容器內(nèi)表面的一個(gè)面固相化有抗體，具有固相化面和非固相化面，上述固相化面中，以10?300ng/cm2的濃度固相化有抗⑶3抗體。
[0026]另外，本發(fā)明的淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)方法為使用了上述培養(yǎng)容器的淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)方法，是具有如下工序的方法:活化工序，在上述培養(yǎng)容器中封入淋巴細(xì)胞和培養(yǎng)液，以使上述培養(yǎng)容器中的上述固相化面成為底面的方式配置上述培養(yǎng)容器，使淋巴細(xì)胞活化;和增殖工序，將上述培養(yǎng)容器反轉(zhuǎn)，以使上述培養(yǎng)容器中的上述非固相化面成為底面的方式配置上述培養(yǎng)容器，使淋巴細(xì)胞擴(kuò)增。
[0027]另外，本發(fā)明的培養(yǎng)容器的制造方法為固相化有蛋白質(zhì)的培養(yǎng)容器的制造方法，是如下的方法:在上述培養(yǎng)容器中注入溶解有上述蛋白質(zhì)的液滴，使上述液滴移動到上述培養(yǎng)容器的內(nèi)表面上的一部分或全部。
[0028]另外，本發(fā)明的固相化裝置為將蛋白質(zhì)固相化于培養(yǎng)容器的內(nèi)表面的固相化裝置，其構(gòu)成在于具備:裝載臺，載置溶解有蛋白質(zhì)的液滴和培養(yǎng)容器；以及驅(qū)動單元，移動裝載臺，使培養(yǎng)容器內(nèi)的液滴在培養(yǎng)容器的內(nèi)表面上移動。
[0029]發(fā)明效果
[0030]根據(jù)本發(fā)明，能夠僅通過單一的培養(yǎng)容器在不使用專用的培養(yǎng)裝置等的情況下高效地進(jìn)行淋巴細(xì)胞的活化和增殖。因此，能夠排除更換的繁雜性、并排除污染的風(fēng)險(xiǎn)，所述更換是用于防止抗體所致的對淋巴細(xì)胞的過量刺激的操作。另外，根據(jù)本發(fā)明，能夠提供將蛋白質(zhì)高效地固相化于容器的培養(yǎng)容器的制造方法、和用于進(jìn)行該方法的固相化裝置。
【附圖說明】
[0031]圖1為示出本發(fā)明的實(shí)施方式所涉及的培養(yǎng)容器的圖。
[0032]圖2為示出將本發(fā)明的實(shí)施方式所涉及的培養(yǎng)容器在使容器內(nèi)表面貼合的狀態(tài)下保存時(shí)的抗體的移動結(jié)果的圖表的圖。
[0033]圖3A為示出本發(fā)明的實(shí)施方式所涉及的培養(yǎng)容器的保存形態(tài)的圖。
[0034]圖3B為示出本發(fā)明的實(shí)施方式所涉及的培養(yǎng)容器的保存形態(tài)的圖。
[0035]圖4為示出本發(fā)明的第一實(shí)施方式所涉及的淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)方法的圖。
[0036]圖5為示出本發(fā)明的第二實(shí)施方式所涉及的淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)方法的圖。
[0037]圖6為示出本發(fā)明的實(shí)施方式所涉及的培養(yǎng)容器、和淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)方法的實(shí)施例和比較例的示意圖。
[0038]圖7為示出本發(fā)明的實(shí)施方式所涉及的培養(yǎng)容器、和淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)方法的實(shí)施例和比較例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖表的圖。
[0039]圖8為示出現(xiàn)有的淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)方法的圖。
[0040]圖9為用于說明本發(fā)明的實(shí)施方式所涉及的培養(yǎng)容器的制造方法中的固相化的原理的圖。
[0041]圖10為示出通過本發(fā)明的實(shí)施方式所涉及的培養(yǎng)容器的制造方法而得到的抗體固相化培養(yǎng)袋的圖。
[0042]圖11為示出本發(fā)明的實(shí)施方式所涉及的固相化裝置的圖(俯視圖)。
[0043]圖12為示出本發(fā)明的實(shí)施方式所涉及的固相化裝置的圖(主視圖)。
[0044]圖13為示出利用本發(fā)明的實(shí)施方式所涉及的固相化裝置的固相化的樣子的圖。
[0045]圖14為示出本發(fā)明的實(shí)施方式所涉及的固相化裝置中的保持單元的圖(主視圖和側(cè)視圖)。
[0046]圖15為示出本發(fā)明的實(shí)施方式所涉及的固相化裝置中的保持單元的使用形態(tài)的圖。
[0047]圖16為示出本發(fā)明的實(shí)施方式所涉及的培養(yǎng)容器(抗體固相化培養(yǎng)袋)的制造方法的實(shí)施例和比較例的示意圖。
[0048]圖17為示出本發(fā)明的實(shí)施方式所涉及的培養(yǎng)容器(抗體固相化培養(yǎng)袋)的制造方法的實(shí)施例和比較例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖表的圖。
[0049]圖18為示出本發(fā)明的實(shí)施方式所涉及的培養(yǎng)容器(抗體固相化燒瓶)的制造方法的實(shí)施例和比較例的示意圖。
[0050]圖19為示出本發(fā)明的實(shí)施方式所涉及的培養(yǎng)容器(抗體固相化燒瓶)的制造方法的實(shí)施例和比較例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖表的圖。
[0051]圖20為示出本發(fā)明的實(shí)施方式所涉及的培養(yǎng)容器(纖連蛋白固相化培養(yǎng)袋)的制造方法的實(shí)施例和比較例的示意圖。
[0052]圖21為示出本發(fā)明的實(shí)施方式所涉及的培養(yǎng)容器(纖連蛋白固相化培養(yǎng)袋)的制造方法的實(shí)施例和比較例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖表的圖。
【具體實(shí)施方式】
[0053]以下對本發(fā)明的培養(yǎng)容器、和淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)方法的實(shí)施方式詳細(xì)地進(jìn)行說明。首先，參照圖1對本發(fā)明的培養(yǎng)容器的一個(gè)實(shí)施方式進(jìn)行說明。該圖中示出將培養(yǎng)容器載置于裝載臺(未圖示)后從上方觀察的簡圖、和從側(cè)面觀察的簡圖。
[0054][培養(yǎng)容器]
[0055]如圖1所示，本發(fā)明的實(shí)施方式所涉及的培養(yǎng)容器10具有上下相對的容器壁。而且，容器內(nèi)表面的一面成為固相化有抗體20的固相化面11(圖1的容器內(nèi)的底面)。另外，容器內(nèi)表面的另一面成為未固相化有抗體20的非固相化面12(圖1的容器內(nèi)的頂面)。此外，培養(yǎng)容器10具備管13，由此進(jìn)行淋巴細(xì)胞和培養(yǎng)液向培養(yǎng)容器10內(nèi)的封入、和所培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞和培養(yǎng)液的回收。該圖的例中，培養(yǎng)容器1具有I根管13，但也可以具有2根以上。
[0056]關(guān)于培養(yǎng)容器10，使用具有細(xì)胞培養(yǎng)所需要的透氣性的膜，并形成為袋狀(口袋型)。作為這樣的培養(yǎng)容器10的材料，可以適當(dāng)?shù)厥褂镁垡蚁?、聚丙烯等聚烯烴類樹脂。
[0057]作為固相化于固相化面11的抗體20，優(yōu)選使用抗CD3抗體。淋巴細(xì)胞可以被抗CD3抗體活化并進(jìn)行增殖。
[0058]固相化面11中的抗體20的固相化濃度優(yōu)選設(shè)為10?300ng/cm2，更優(yōu)選設(shè)為10?40ng/cm2。
[0059]這是因?yàn)?，若使抗體20的固相化濃度為lOng/cm2以上，則能夠有效地使淋巴細(xì)胞活化，然后能夠高效地使淋巴細(xì)胞增殖。另外是因?yàn)?，即使使抗體20的固相化濃度大于40ng/cm2，在淋巴細(xì)胞的增殖效率方面也沒有顯著的差異，且過量使用抗體會導(dǎo)致容器成本的增大。
[0060]固相化面11中的抗⑶3抗體的最密填充濃度為300ng/cm2，若為該濃度范圍之內(nèi)，則能夠充分地使淋巴細(xì)胞活化，然后高效地使淋巴細(xì)胞增殖。另一方面，若抗CD3抗體的固相化濃度超過300ng/cm2，則抗CD3抗體漂浮在培養(yǎng)容器10內(nèi)的培養(yǎng)液中，有時(shí)對淋巴細(xì)胞造成過量的刺激，因此不優(yōu)選。
[0061 ]本實(shí)施方式的培養(yǎng)容器10例如可以如下所示地進(jìn)行制造。
[0062]首先，使用塑料擠出成形裝置將低密度聚乙烯擠出成形，形成膜。然后，使用脈沖熱封機(jī)由該膜制造袋狀的培養(yǎng)容器10。如圖1所示，培養(yǎng)容器10以裝有管13的方式進(jìn)行制造。
[0063]然后，將培養(yǎng)容器10載置于裝載臺，封入規(guī)定量的氣體，并且接著封入溶解有抗體20的緩沖液。然后，通過搖動培養(yǎng)容器10等方式，使緩沖液的液滴在培養(yǎng)容器10內(nèi)的底面上移動，使緩沖液中含有的抗體20附著到培養(yǎng)容器10內(nèi)的底面上。由此，使抗體20僅附著于培養(yǎng)容器10內(nèi)的底面，形成固相化面11。此時(shí)，培養(yǎng)容器10內(nèi)的頂面以未附著有抗體20的非固相化面12的形式形成。
[0064]然后，對本實(shí)施方式的培養(yǎng)容器10的保存形態(tài)進(jìn)行說明