一種木質(zhì)纖維素酶解發(fā)酵產(chǎn)丁醇的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物質(zhì)能源領(lǐng)域，具體涉及一種木質(zhì)纖維素酶解發(fā)酵產(chǎn)丁醇的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]丁醇作為一種重要的四碳平臺化合物，具有非常廣泛的用途，主要用于醋酸丁酯、鄰苯二甲酸正丁酯(DBP)、丙烯酸丁酯、脂肪二元酸和磷酸類增塑劑等的制造。丁醇還是一種極具潛力的新型生物燃料，被稱為第二代生物燃料，在替代汽油作為燃料方面性能優(yōu)于乙醇，表現(xiàn)在:丁醇含有的熱值比乙醇高25%，與汽油相當(dāng)；丁醇的燃點(diǎn)高于乙醇，使用更安全；與乙醇相比，丁醇更易溶于汽油和柴油，而不易溶于水；丁醇腐蝕性小，易于運(yùn)輸，可直接應(yīng)用于汽車而不必改造現(xiàn)有發(fā)動機(jī)。另外，丁醇也可以作為各種燃料的添加劑。
[0003]丁醇的生產(chǎn)工藝主要有化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法兩種。隨著石油資源的日益枯竭，采用以石油為原料丙烯羰基合成法生產(chǎn)丁醇已舉步維艱，而且由于技術(shù)落后，裝置偏小導(dǎo)致產(chǎn)能不夠，致使中國丁醇市場長期供應(yīng)不足，不能滿足國內(nèi)市場的需求。生物發(fā)酵法制備丁醇有其獨(dú)到的優(yōu)勢，發(fā)展生物丁醇將極大地緩解丁醇供應(yīng)不足的現(xiàn)狀。傳統(tǒng)的丙酮丁醇發(fā)酵以淀粉、糖蜜為主要原料，原料成本占丙酮丁醇發(fā)酵總成本的60%以上，成為影響生物丁醇價格的主要因素之一。在糧食短缺與能源危機(jī)的雙重威脅下，探索纖維質(zhì)原料生產(chǎn)燃料丁醇成為生物質(zhì)能源發(fā)展戰(zhàn)略的重要組成部分。
[0004]木質(zhì)纖維素制備丁醇過程通常包括預(yù)處理、水解、發(fā)酵、蒸餾等單元操作。其中纖維素水解為可發(fā)酵糖是纖維素丁醇煉制過程中至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。目前，木質(zhì)纖維素的降解主要有化學(xué)法水解和酶法水解。但是，在木質(zhì)纖維素預(yù)處理過程中，由于酸或熱的作用，部分纖維素、半纖維素和木質(zhì)素發(fā)生降解和分解作用產(chǎn)生甲酸、乙酸、乙酰丙酸、糠醛、羥甲基糠醛和酚類化合物等對酶解和后續(xù)發(fā)酵有抑制作用的物質(zhì)，這些物質(zhì)必須脫毒去除。木質(zhì)纖維素原料水解糖液脫毒的方法很多，主要包括石灰過量中和、活性炭吸附、離子交換、蒸汽汽提和生物脫毒等，但這些方法存在脫毒效果差、成本高，或在發(fā)酵抑制物質(zhì)脫除的同時糖分損失大等缺點(diǎn)。
[0005]CN200910088002.X公開了一種汽爆秸桿木糖發(fā)酵丙酮丁醇及提取剩余物的方法，報道了利用樹脂(包括大孔吸附樹脂和堿性離子交換樹脂)去除抑制劑的方法，使得脫毒后的汽爆秸桿酶解液可以進(jìn)行丙酮丁醇發(fā)酵，最終總?cè)軇┊a(chǎn)量達(dá)到12_22g/L，但是用吸附方法脫毒價格昂貴，而且使酶解液中還原糖損失很大，不得不再對酶解液進(jìn)行濃縮，整個過程耗時長，成本高。
[0006]CN101748158公開了一種以木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)為原料發(fā)酵制備生物丁醇的方法，玉米秸桿經(jīng)過2%的硫酸(v/v)預(yù)處理，氫氧化鈣(石灰乳)中和處理液后，用有機(jī)超濾膜濃縮處理液獲得高濃度糖，進(jìn)而用大孔吸附樹脂脫毒后，用丙酮丁醇梭菌發(fā)酵處理液，最終得到15.6 g/L的總?cè)軇?，此過程雖然省去了纖維素酶處理步驟，但繁瑣且昂貴的處理和脫毒步驟不利于實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種木質(zhì)纖維素酶解發(fā)酵產(chǎn)丁醇的方法。本發(fā)明通過選擇合適的萃取劑和脫毒劑，對預(yù)處理和酶解過程中產(chǎn)生的乙酸、糠醛、羥甲基糠醛等發(fā)酵抑制物進(jìn)行原位萃取分離，降低了抑制物對酶解和發(fā)酵的毒性，提高了丁醇產(chǎn)量。
[0008]本發(fā)明木質(zhì)纖維素酶解發(fā)酵產(chǎn)丁醇的方法，包括如下步驟:
(1)將預(yù)處理后的木質(zhì)纖維素、纖維素酶和乙酸丁酯按一定比例加入到反應(yīng)器中進(jìn)行酶解；
(2)采用氫氧化鈣調(diào)節(jié)酶解液的pH值為6?8，于50°C反應(yīng)Ih；
(3)在上述酶解液中加入除氧劑，并通入惰性氣體，使體系處于無氧狀態(tài)；
(4)在上述脫毒后的酶解液中接入丁醇發(fā)酵菌種，發(fā)酵制備丁醇。
[0009]本發(fā)明中，步驟(I)所述的木質(zhì)纖維素原料包括一切含纖維素的物料，如秸桿、木屑和能源作物等，優(yōu)選玉米秸桿。木質(zhì)纖維素原料需要機(jī)械粉碎到粒徑為0.1?30mm，優(yōu)選粒徑為0.2?1.0mm0所述預(yù)處理方式可以采用一切可提高木質(zhì)纖維素酶解性能的物理、化學(xué)和熱化學(xué)技術(shù)，包括機(jī)械粉碎、輻射、微波、酸處理、堿處理、蒸汽爆破預(yù)處理和溶劑預(yù)處理，或上述方法的組合預(yù)處理等，優(yōu)選采用稀酸蒸汽爆破組合預(yù)處理。
[0010]本發(fā)明中，步驟(I)所述酶解過程中酶加量為5?20IU/g纖維素干基。所述的纖維素酶采用可水解木質(zhì)纖維素組分的酶蛋白或酶蛋白混合物，可在工廠在線生成纖維素酶，也可采用市售商品纖維素酶，如諾維信酶或者澤生酶。酶解的條件為:干物濃度(可溶性固體和不可溶性固體質(zhì)量之和與體系總質(zhì)量的百分比，下同)為5wt%?30wt%，酶解溫度為45°C?55°C，優(yōu)選為48°C?52°C，酶解時間為12?40h，優(yōu)選為20?30h，pH值為4.5?
5.5ο
[0011]本發(fā)明中，步驟(I)所述的乙酸丁酯的加入量為0.01?0.lmol/L，優(yōu)選為0.05?
0.08mol/L。進(jìn)一步地，本發(fā)明酶解體系中優(yōu)選加入一定量的Gemini表面活性劑，加入量為
0.025 ?0.5mol/L，優(yōu)選為 0.1 ?0.25mol/L。
[0012]本發(fā)明中，步驟(2 )利用氫氧化鈣調(diào)節(jié)酶解液pH，采取直接加入氫氧化鈣固體顆粒調(diào)節(jié)酶解液的pH至6?8，離心后去除沉淀，液體即為脫毒后的酶解液。
[0013]本發(fā)明中，步驟(3)所述除氧劑為常規(guī)使用的除氧劑，優(yōu)選為保險粉，采用刃天青作為指示劑，保險粉溶液的配置方法:稱取Ig連二亞硫酸鈉與0.6g碳酸鈉溶于1mL去離子水，以0.22 μ m的微孔濾膜濾入經(jīng)滅菌的已經(jīng)除氧的厭氧小瓶內(nèi)，使用時逐滴加入，至刃天青變?yōu)闊o色為止。所述惰性氣體為氮?dú)?、氫氣或二氧化碳?xì)怏w等。具體根據(jù)反應(yīng)體系的情況，使其可以保持無氧狀態(tài)即可。
[0014]本發(fā)明中，步驟(4)所述丁醇發(fā)酵菌株為拜氏梭菌beijerinckii )或者丙酮丁醇梭菌iClostridium ace tobu tyIi cum),如可以采用丙酮丁醇梭菌{Clostridium acetobutylicum) ATCC 824,購于美國模式菌種收集中心；或者采用拜氏梭菌CM20,其分類命名為拜氏梭菌{Clostridium beijerinckii),已于2014年06月17日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.9354。本發(fā)明優(yōu)選采用拜氏梭菌CM20，該菌株是由出發(fā)菌株拜氏梭菌C/os tridium beijerinckii NCIMB8052 (購于英國國家工業(yè)、海洋和食品菌種保藏中心)經(jīng)紫外誘變后，利用淀粉平板和葡萄糖平板篩選得到高活力產(chǎn)丁醇菌株，再經(jīng)厭氧發(fā)酵篩選得到高產(chǎn)丁醇、丙酮、乙醇的目標(biāo)菌株。
[0015]本發(fā)明中，步驟(4)以脫毒后的酶解液為發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行厭氧發(fā)酵產(chǎn)丁醇。采用本領(lǐng)域常規(guī)的培養(yǎng)方式制備發(fā)酵菌種子液，優(yōu)選采用RCM培養(yǎng)基制備種子液，具體配方以g/L計為:蛋白胨10，牛肉粉10，酵母粉3.0，葡萄糖5，可溶性淀粉1.0，氯化鈉5.0，醋酸鈉3.0，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5，瓊脂0.5，以純水配置，115°C，滅菌20min。發(fā)酵菌種子液是在種子培養(yǎng)基中接入丁醇發(fā)酵菌，厭氧環(huán)境下于36-38°C下培養(yǎng)16-20h獲得的。種子液的接種量為5%-10% (v/v),發(fā)酵溫度為33-38°C，發(fā)酵時間72-84小時，即得到生物溶劑(丙酮，丁醇和乙醇)。
[0016]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn):
1、在酶解階段加入乙酸丁酯，可以高效萃取糠醛、羥甲基糠醛等毒性物質(zhì)，同時降低其對酶解和發(fā)酵的抑制作用；
2、采用氫氧化鈣調(diào)節(jié)酶解液的pH值，使得發(fā)酵過程可以在適宜條件下進(jìn)行，而且可以去除其中的酚類化合物，進(jìn)一步對酶解液進(jìn)行脫毒。此外，酶解階段加入的乙酸丁酯可以在氫氧化鈣作用下水解成乙酸鹽和丁醇，降低其對后續(xù)發(fā)酵過程的干擾；
3、加入Gemini表面活性劑，表面活性劑有助于纖維素酶的脫附，有助于提高酶解效果，而且有助于乙酸丁酯在堿性條件下更好地水解。
【具體實(shí)施方式】
[0017]下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說明。本發(fā)明中，wt%為質(zhì)量分?jǐn)?shù)。
[0018]本發(fā)明實(shí)施例采用的木質(zhì)纖維素原料為玉米秸桿，玉米秸桿中纖維素含量為38wt%，半纖維素含量為21wt%，木質(zhì)素含量為17wt%。取干燥的玉米秸桿原料機(jī)械粉碎到粒徑為0.2?1.0mm之間。采用稀酸蒸爆對玉米秸桿進(jìn)行預(yù)處理，條件為:2wt%硫酸，干物濃度30wt%，蒸煮溫度190°C，停留時間5.5min。預(yù)處理后原料的干物濃度為46.7wt%，纖維素含量為37.3wt%。
[0019]本發(fā)明實(shí)施例采用的纖維素酶為諾維信公司生產(chǎn)的用于轉(zhuǎn)化木質(zhì)纖維素原料的B1mass KU，其中包括纖維素酶復(fù)合物(NS 50013)和β -葡萄糖苷酶(NS 50010)，酶解pH值為4.5，濾紙酶活(FPA) 137 IU/g (國際單位)。
[0020]實(shí)施例1
控制酶解體系總質(zhì)量為2kg，按照干物濃度為15wt%加入預(yù)處理好的玉米秸桿(PCS)，控制酶加量為7IU/g纖維素干基，同時加入0.05mol