一種通過(guò)電化學(xué)系統(tǒng)強(qiáng)化微生物菌體利用甘油的方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種通過(guò)電化學(xué)系統(tǒng)強(qiáng)化微生物菌體利用甘油的方法及其應(yīng)用，屬于 生物化工技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 在還原型產(chǎn)物合成過(guò)程中，當(dāng)以葡萄糖為唯一碳源時(shí)，葡萄糖經(jīng)糖酵解途徑進(jìn)行 代謝時(shí)產(chǎn)生2分子還原力(NADH)，用于強(qiáng)還原型產(chǎn)物合成的還原力會(huì)明顯不足，產(chǎn)物收率降 低;而當(dāng)以甘油為碳源時(shí)，甘油經(jīng)代謝會(huì)產(chǎn)生2分子還原力(NADH)，在此基礎(chǔ)之上，菌株生長(zhǎng) 時(shí)也會(huì)合成一部分NADH，此時(shí)，若合成產(chǎn)物的還原性較低，菌體內(nèi)會(huì)積累NADH，此時(shí)過(guò)剩的 還原力會(huì)抑制微生物菌體的生長(zhǎng)。
[0003] 為了平衡胞內(nèi)輔酶代謝，恢復(fù)菌體生長(zhǎng)的同時(shí)保證還原型產(chǎn)物的合成，Claire Vieille等通過(guò)引入異源還原性途徑增加 NADH的消耗，同時(shí)一些研究過(guò)程中采用微厭氧條 件發(fā)酵，恢復(fù)了產(chǎn)琥珀酸放線(xiàn)桿菌利用甘油代謝生長(zhǎng)的能力。但是，微厭氧條件難以控制， 與此同時(shí)引入異源代謝途徑會(huì)增加菌體代謝負(fù)擔(dān)，經(jīng)改造的菌株甘油消耗量也只有l(wèi)〇g/L 左右，相比以葡萄糖為碳源時(shí)，細(xì)胞生物量也明顯降低。
[0004] 在燃料電池電化學(xué)系統(tǒng)中，菌體通過(guò)代謝消耗培養(yǎng)基中的有機(jī)物質(zhì)，碳源或氮源， 代謝過(guò)程中產(chǎn)生的電子可以通過(guò)某種機(jī)制運(yùn)送到胞外，并進(jìn)一步傳到陽(yáng)極電極，通過(guò)外電 路最終傳遞至陰極。在此過(guò)程中，代謝底物作為電子供體，陽(yáng)極電極作為電子受體，形成一 個(gè)完整的電子傳遞鏈，用于促進(jìn)胞內(nèi)代謝、底物利用及電能的產(chǎn)生，如Alfred M. Spormann 等通過(guò)電化學(xué)系統(tǒng)強(qiáng)化了二氧化碳的利用并加快了電能的產(chǎn)生。
[0005] 但是，不同的代謝物所需的還原力并不相同，因此所需的電化學(xué)調(diào)控手段也會(huì)存 在一定的差異。其中，電子傳遞效率與調(diào)控手段的不同有著直接的關(guān)系。一般情況下，電化 學(xué)活性菌株(如希瓦氏菌)可以合成導(dǎo)電附屬結(jié)構(gòu)(納米導(dǎo)線(xiàn))或向胞外分泌電子載體(核黃 素）以增加電子的傳遞效率。但是，對(duì)于非電化學(xué)活性菌株而言，外源電子載體的添加對(duì)于 電子在胞內(nèi)及胞外傳遞過(guò)程中起著決定性作用。由于不同的電子載體本身具有的獨(dú)特的電 化學(xué)特性，即使是同一電子載體，在不同濃度條件下對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)及電子的傳遞作用也并不 一致。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種通過(guò)電化學(xué)系統(tǒng)強(qiáng)化微生物菌體利用甘油的方法及其 應(yīng)用，將生物電化學(xué)系統(tǒng)(燃料電池系統(tǒng)）引入微生物發(fā)酵體系中，用于平衡及調(diào)控胞內(nèi)輔 酶平衡，包括降低胞內(nèi)還原力水平，平衡還原型底物甘油的消耗及細(xì)胞的生長(zhǎng)，在此基礎(chǔ)之 上獲得生物電能并增加還原型產(chǎn)物的合成。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下： 一種通過(guò)電化學(xué)系統(tǒng)強(qiáng)化微生物菌體利用甘油的方法，包括菌種活化、種子培養(yǎng)、厭氧 發(fā)酵，所述厭氧發(fā)酵采用電化學(xué)發(fā)酵，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加電子載體，所述電子載體的濃度 為0.1-1.0臟〇1/1，發(fā)酵培養(yǎng)基中甘油濃度為10~4〇8/1。
[0008] 所述菌株為任意可在厭氧條件下生長(zhǎng)并可發(fā)酵積累還原型產(chǎn)物的菌株，包括但不 限于產(chǎn)琥泊酸放線(xiàn)(Actinobacillus succinogenes)。
[0009] 所述電化學(xué)發(fā)酵中，選用石墨碳?xì)肿鳛殛庩?yáng)兩極電極，Ag/AgCl(飽和KC1)作為參 比電極，發(fā)酵培養(yǎng)基和磷酸鹽緩沖液(或鐵氰化鉀/亞鐵氰化鉀溶液)分別作為陰極和陽(yáng)極 電解液，并通過(guò)電子載體介導(dǎo)電子由微生物胞內(nèi)向電極的傳遞。
[0010] 所述電子載體為具有氧化還原對(duì)特性的化合物，可以為化學(xué)型電子載體，也可以 選擇可生物型電子載體，包括但不限于中性紅、甲基紫精、硫堇和核黃素。
[0011] 所述電化學(xué)發(fā)酵中陽(yáng)極電解液為磷酸鹽緩沖液，磷酸鹽緩沖液pH 6-7,濃度0.1- 1.0 111〇1/1，添加氯化鈉(0.1-1.0 111〇1/1)以增加電解液的導(dǎo)電率； 電化學(xué)發(fā)酵中陽(yáng)極電解液還可以為鐵氰化鉀/亞鐵氰化鉀溶液，將等量鐵氰化鉀及亞 鐵氰化鉀混合，調(diào)PH6-7，濃度控制在0.1-1.0 mol/L。
[0012] 電化學(xué)發(fā)酵時(shí)，陰極室內(nèi)填充的發(fā)酵培養(yǎng)基中包含不同濃度的電子載體，并通過(guò) 外電阻將陰陽(yáng)兩極室聯(lián)通。當(dāng)電子載體為中性紅或核黃素時(shí)，濃度為0.1-1.〇 mmol/L;當(dāng)電 子載體為甲基紫精或硫堇時(shí)，濃度為0.1-0.5_〇1/匕更優(yōu)選地，中性紅11111核黃素11111甲 基紫精 0.5 mmol/L 硫堇0.5 mmol/L。
[0013] 所述電化學(xué)系統(tǒng)為采用氣密性良好的微生物電解池裝置，通過(guò)外加電子載體的協(xié) 助，將胞內(nèi)代謝產(chǎn)生的過(guò)剩電子從胞內(nèi)傳遞至胞外，進(jìn)而傳遞至陽(yáng)極電極以產(chǎn)生電流，在利 用強(qiáng)還原型底物的同時(shí)降低胞內(nèi)還原力以恢復(fù)(促進(jìn))菌株的生長(zhǎng)。所述菌株為產(chǎn)琥珀酸放 線(xiàn)桿菌，厭氧條件下于電化學(xué)裝置中發(fā)酵時(shí)，可以以高還原型底物甘油為碳源進(jìn)行代謝并 合成還原性產(chǎn)物。
[0014] 所述陽(yáng)極磷酸鹽緩沖液中添加氯化鈉以增加電解液的導(dǎo)電率，優(yōu)選為pH 7.0，濃 度0·1-1·0 mol/L。
[0015] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基既可以為復(fù)合培養(yǎng)基，也可以是合成培養(yǎng)基。
[0016] 復(fù)合發(fā)酵培養(yǎng)基為玉米漿干粉5-10g/L，酵母粉5-15 g/L，乙酸鈉1.0-2.0 g/L， NaCl 0.5-2.0 g/L，CaCl2 0·1-0.5 g/L，MgCl2 0·1-0.5 g/L， NaH2P〇4 1.0-2.0 g/L， Na2HP 〇4 0.1-0.5 g/L，K2HP〇4 1.0-5.0 g/L，碳源甘油，甘油濃度為 10~40 g/L;優(yōu)選為甘 油 10 g/L，玉米漿干粉7.5 g/L，酵母粉 10 g/L，乙酸鈉 1.36 g/L，NaCl 1 g/L，CaCl2 0.2 g/L，MgCl2 0.2 g/L, NaH2P〇4 1.6 g/L, Na2HP 〇4 0.3 g/L, K2HPO4 3 g/L。
[0017] 合成發(fā)酵培養(yǎng)基為CH3C00Na 1.0-2.0 g/L, NaCl 0.5-2.0 g/L, MgCl2 0.1-1 ·0 g/L，CaCl2 0·卜1.0 g/L，Na2HP〇4 0· hl.0g/L，NaH2P04l.0-3.0g/L，K2HP04l.0_ 5.0 g/L，NH4HC03 1.0-2.0 g/L，甘油 10~40 g/L，生物素0.01 g/L，煙酸0.025 g/L，蛋氨 酸0.11 g/L;優(yōu)選為甘油10 g/L，生物素0.01 g/L，煙酸0.025 g/L，蛋氨酸0.11 g/L， CH3C00Na 1.36 g/L，NaCl 1 g/L，MgCh 0.2 g/L，CaCl2 0.2 g/L，Na2HP 〇4 0.31 g/L， NaH2P 〇4 1.6 g/L，K2HPO4 3 g/L，NH4HCO3 1.57 g/L。
[0018] 本發(fā)明所述的菌種活化、種子培養(yǎng)步驟是常規(guī)的放線(xiàn)桿菌菌種活化方法及種子培 養(yǎng)方法，以產(chǎn)琥泊酸放線(xiàn)桿菌即113(六(：1：；[11(^3(3；[11118 811(^；[110861168 1'0113)為例說(shuō)明菌種 活化及種子培養(yǎng)步驟:產(chǎn)琥1自酸放線(xiàn)桿菌即113(401：；[11(^30；[11118 81100；[110〖61168 1'0113)菌 株經(jīng)固體平板培養(yǎng)基活化后，37°C條件下，在厭氧血清瓶中培養(yǎng)12-14小時(shí)后轉(zhuǎn)接于種子培 養(yǎng)基，在37°C，200轉(zhuǎn)/分鐘的條件下培養(yǎng)6-8小時(shí)得到種子液； 將所述種子液按照6%(v/v)的接種量接種于含有所述發(fā)酵培養(yǎng)基的H-Cell電化學(xué)反應(yīng) 器中，同時(shí)添加不同濃度的電子載體。
[0019] 優(yōu)選地，所述固體平板培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基的配方為:葡萄糖20 g/L，玉米漿干粉 7.5 g/L，酵母粉 10 g/L，乙酸鈉 1.36 g/L，NaCl 1 g/L，CaCl2 0.2 g/L，MgCl2 0.2 g/L， NaH2P〇4 1.6 g/L，Na2HP〇4 0.3 g/L，K2HPO4 3 g/L，瓊脂粉 15-20 g/L。
[0020] 優(yōu)選地，所述發(fā)酵培養(yǎng)基中添加單一電子載體。
[0021] 通過(guò)電化學(xué)系統(tǒng)強(qiáng)化微生物菌體利用甘油的方法在微生物利用甘油發(fā)酵生產(chǎn)還 原型有機(jī)酸或者累積電能中的應(yīng)用。
[0022] 有益效果： 本發(fā)明采用微生物電化學(xué)調(diào)控手段，能明顯增加菌株的生長(zhǎng)代謝能力，特別是以甘油 為唯一碳源時(shí)菌株生長(zhǎng)受限的微生物菌株，例如產(chǎn)琥珀酸放線(xiàn)桿菌菌株NJ1 13 (Actinobacillus succinogenes NJ113)通過(guò)電化學(xué)系統(tǒng)調(diào)控策略，在發(fā)酵培養(yǎng)基中能夠 利用甘油生長(zhǎng)及代謝，能明顯增加還原型產(chǎn)物的合成。當(dāng)以甘油為主要碳源時(shí)，厭氧條件下 菌株可以利用甘油生長(zhǎng)并合成還原型代謝產(chǎn)物:厭氧條件下在復(fù)合培養(yǎng)基中添加電子載 體，發(fā)酵48小時(shí)后，甘油消耗量可達(dá)40 g/L，總還原酸累計(jì)量達(dá)66.96 g/L，在合成培養(yǎng)基中 進(jìn)行厭氧發(fā)酵時(shí)，甘油消耗量也可達(dá)到10 g/L，有機(jī)酸積累量22.07 g/L，兩種發(fā)酵模式下 能獲得的最大電壓分別為460 mV和210 mV。證明了在微生物電化學(xué)系統(tǒng)的調(diào)控下，非電化 學(xué)活性微生物菌株可以將胞內(nèi)過(guò)剩的還原力以電子的形式經(jīng)電子載體傳遞至胞外，降低胞 內(nèi)還原力水平，恢復(fù)細(xì)胞的生長(zhǎng)能力，同時(shí)在此基礎(chǔ)之上，有利于還原型產(chǎn)物的積累及電能 的產(chǎn)生。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 產(chǎn)琥泊酸放線(xiàn)桿菌NJ113(Actinobacillus succinogenes NJ113)保藏號(hào)CGMCC Νο·11716〇
[0024] 本發(fā)明中將產(chǎn)琥珀酸放線(xiàn)桿菌NJ113菌株通過(guò)固體平板培養(yǎng)基培養(yǎng)后接種至種子 培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到種子液;然后將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，并通過(guò)電化學(xué)調(diào)控強(qiáng)化菌 株的代謝性能。
[0025]固體平板培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基的配方為：葡萄糖20 g/L，玉米漿干粉7.5 g/L，酵 母粉 10 g/L，乙酸鈉 1.36 g/L，NaCl 1 g/L，CaCl2 0.2 g/L，MgCl2 0.2 g/L, NaH2P〇4 1.6 g/L，Na2HP 〇4 0.3 g/L，K2HP〇4 3 g/L，瓊脂粉 15-20 g/L。
[0026] 產(chǎn)琥珀酸放線(xiàn)桿菌NJ113菌株經(jīng)固體平板培養(yǎng)基活化后轉(zhuǎn)接至厭氧血清瓶，37°C， 厭氧條件下培養(yǎng)12-14小時(shí)后轉(zhuǎn)接于種子培養(yǎng)基，在37 °C，200轉(zhuǎn)/分鐘的條件下培養(yǎng)6-8小 時(shí)得到種子液； 將種子液按照6-10 %(v/v)的接種量接種于含有發(fā)酵培養(yǎng)基的電化學(xué)裝置中，于37°C 進(jìn)行厭氧發(fā)酵。在發(fā)酵過(guò)程中每隔一段時(shí)間進(jìn)行無(wú)菌取樣，對(duì)樣品離心處理后測(cè)定甘油及 有機(jī)酸濃度。
[0027] 根據(jù)以下實(shí)施例，可以更好的理解本發(fā)明。實(shí)施案例中所描述的具體的物料配比， 工藝條件及其結(jié)果僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書(shū)中所詳細(xì)描述的本 發(fā)明。<