制備包含穩(wěn)定活性物的產(chǎn)品和包含相同活性物的組合物的方法
【專利說明】制備包含穩(wěn)定活性物的產(chǎn)品和包含相同活性物的組合物的 方法
[00011 本發(fā)明專利申請是國際申請?zhí)枮镻CT/AU2011/000173,國際申請日為2011年2月18 日，進入中國國家階段的申請?zhí)枮?201180002271.5"，發(fā)明名稱為"制備包含穩(wěn)定活性物的 產(chǎn)品和包含相同活性物的組合物的方法"的發(fā)明專利申請的分案申請。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明廣泛涉及一種制備包含活性成分(具體是生物材料)的產(chǎn)品的方法，其中所 述活性成分是穩(wěn)定的。本發(fā)明還涉及包括所述產(chǎn)品的組合物，且具體是包括治療性生物材 料的組合物。
[0003] 發(fā)明背景
[0004] 許多用于人類和動物疾病治療和預(yù)防或用作食品補充劑的生物材料如蛋白質(zhì)和 全細胞只有有限的保存期限。所述有限的保存期限被認為是蛋白質(zhì)在儲藏溫度時的不穩(wěn)定 性的結(jié)果。雖然一些蛋白質(zhì)和細胞培養(yǎng)物的所述保存期限可通過在低溫（即4°C_8°C)保存 它們得以延長，通常保存期限少于18個月。
[0005] 生物活性蛋白一般折疊成復(fù)雜的各蛋白獨特的三維結(jié)構(gòu)形式。所述蛋白一般在3 種水平上組織;具有一級結(jié)構(gòu)，由共價結(jié)合的氨基酸殘基直鏈組成(肽鏈）；二級結(jié)構(gòu)，其中 所述肽鏈折疊為規(guī)則形狀(如α螺旋和β_折疊片層）；和三級結(jié)構(gòu)，其中所述折疊的鏈本身進 一步折疊形成壓縮結(jié)構(gòu)。此外，一些由多于一條多肽鏈組成的蛋白質(zhì)保持緊密排列以形成 所謂四級結(jié)構(gòu)。正是所述三級和/或四級結(jié)構(gòu)決定了蛋白質(zhì)最終生物活性。
[0006] 所述蛋白質(zhì)最終結(jié)構(gòu)可被許多環(huán)境因子影響，例如溫度，pH，某種輔因子或金屬的 存在或缺失，氧氣、酶、氧化或還原試劑的存在和水或濕氣的存在。當(dāng)條件沒有優(yōu)化時，蛋白 質(zhì)可能不能正確折疊或可能變性，從而喪失其生物功能或至少減弱。
[0007] 廣義而言，動物、植物和微生物的細胞可被認為是復(fù)雜的蛋白質(zhì)材料，因為其含有 附在細胞膜和/或細胞壁內(nèi)的眾多蛋白質(zhì)，所述膜或壁轉(zhuǎn)而在所述細胞表面呈遞其他蛋白 質(zhì)。因為具有蛋白質(zhì)，細胞生存力取決于其存在的環(huán)境;例如溫度，ΡΗ，某種輔因子或金屬的 存在或缺失，某些營養(yǎng)物、代謝廢料、氧氣、酶、氧化或還原試劑的存在或缺失和水或濕度的 存在可單獨或共同地作用以影響生存力。
[0008] 本領(lǐng)域有許多已知技術(shù)用于穩(wěn)定蛋白質(zhì)，其中一些簡要討論如下。
[0009 ]真空冷凍干燥(低壓凍干法)常用于制備在真空中等使用的蛋白質(zhì)。傳統(tǒng)冷凍干燥 涉及冷凍所述生物蛋白溶液并從中移去冰晶體，這是通過在真空中將其轉(zhuǎn)變?yōu)樗羝?升 華）。此方法常導(dǎo)致所述蛋白的天然結(jié)構(gòu)受損。
[0010]為了有助于增加冷凍干燥制得的生物蛋白的穩(wěn)定性，可在產(chǎn)品制劑中使用添加劑 如緩沖或穩(wěn)定劑。然而，冷凍干燥期間，當(dāng)所述溶液的溫度經(jīng)過一天緩慢降至_20°C時，所述 添加劑可能在不同的凝固點固化。結(jié)果，所述終產(chǎn)物可能是細軟塊狀物質(zhì)，其實際是由各代 表單獨組分的不同層組成。大體上，所述加入以保護所述生物蛋白的添加劑可從中物理或 化學(xué)分離，使得它們不能用作保護劑。
[0011] 食品和乳品業(yè)中制作干果濃縮物和奶粉的常用替代方法為例如熱噴霧干燥。此方 法包括從噴霧塔上方向下噴灑溶液細霧與向上的熱氣流相對。所述熱氣在水滴到達所述塔 底部時從中除去水。噴霧干燥通常在進口空氣溫度超過190°c下操作且所述產(chǎn)品溫度可能 遠超60°C。在這種操作環(huán)境下大多數(shù)所述生物蛋白或細胞變性，如細菌細胞。
[0012] 其他本領(lǐng)域已知的蛋白制備方法為超臨界液體干燥法。該方法中，生物試劑如肽、 蛋白和核酸維持在水溶液中直至形成顆粒。形成顆粒時用受控氫結(jié)合溶劑如乙醇和異丙醇 除去所述水溶劑。
[0013] 流化床噴霧干燥是改良的熱噴霧干燥技術(shù)。該方法常在所述藥學(xué)和化學(xué)工業(yè)中用 于片劑造粒和/或用于干燥熱穩(wěn)定材料。此方法包括從噴頭上向下噴灑含活性物的溶液細 霧于大量干燥賦形劑上。同時，向上的熱氣流穿過所述大量賦形劑以形成流化床。所述熱氣 流在所述流化床底部從所述流化濕固體中移去水。
[0014] 流化床噴霧干燥技術(shù)可應(yīng)用于在約50°C-60°C熱穩(wěn)定的藥物蛋白。然而，所述蛋白 的天然結(jié)構(gòu)可能受到影響且因此所述蛋白可能失去所有或至少一些生物活性。
[0015] 可能存在與上述流化床噴霧干燥相關(guān)的其他問題；例如，位于加工室頂部附近的 所述噴嘴需要在所述賦形劑材料的流化床表面上有明顯的空隙從而所述該材料不會阻塞 噴嘴；顯著量的所述涂覆材料或含有所述活性成分的液體，可能阻塞所述噴嘴的過濾系統(tǒng) 導(dǎo)致加工損失;且該頂部噴霧流化床操作可能僅適宜造粒而不是噴涂目的。所述流化床噴 霧干燥法通常也產(chǎn)生不同形狀和大小的粗糙和不規(guī)則顆粒。顆粒之間的接觸造成研磨效 果，可導(dǎo)致所述蛋白的變性。
[0016] 本發(fā)明開發(fā)前商業(yè)使用的技術(shù)中，微囊化技術(shù)可能被認為對于制備生物蛋白和細 胞最有用。通常不需要主要設(shè)備且批量大小可小到10g_20g，這使其可用于制備可能非大量 的生物蛋白。此方法使用有機溶劑溶解所述生物蛋白質(zhì)，之后用水包油包水(w/o/w)或水包 油包固體(s/〇/w)乳液法將其包埋在聚合物微球體中。通過簡單過濾除去水后將蛋白捕獲 入所述固體微球體并將溶劑蒸發(fā)掉。
[0017] 微囊化技術(shù)在造紙工業(yè)中已用于制造碳或自粘貼紙且至少在日本用明膠微膠囊 生產(chǎn)食品例如人工魚卵和裝飾品以獲得魚或肉味。
[0018] 雖然微囊化可被認為是制備用于儲藏和將來使用的生物蛋白質(zhì)和全細胞的合適 方法，但是該技術(shù)在藥物和生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)仍處于發(fā)展階段。所述技術(shù)的明顯困境在于蛋白 質(zhì)很可能被所用溶劑和所需的乳化/勻化過程變性。此外，依本方法生產(chǎn)的產(chǎn)品質(zhì)量可能被 認為不理想，因為有痕量溶劑殘留在所述微膠囊核心，其可能妨礙用本技術(shù)生產(chǎn)的產(chǎn)品的 商業(yè)化。
[0019] 本發(fā)明者基于熱噴霧干燥和微囊化技術(shù)開發(fā)了一種替代方法，其中活性成分如蛋 白質(zhì)可穩(wěn)定的時間延長。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0020] 第一方面，本發(fā)明提供用于制備包括至少一種活性成分的產(chǎn)品的方法，所述方法 包括：
[0021] (i)提供包括至少一種活性成分、糖類和水混溶性溶劑的涂布液；
[0022] (ii)提供包括一種或多種水溶性凝膠形成化合物的顆粒；
[0023] (iii)以所述顆粒在儀器的加工室內(nèi)以螺旋路徑向上移動的方式在所述室內(nèi)流化 所述顆粒；
[0024] (iv)在所述顆粒上噴灑所述涂布液以產(chǎn)生包覆顆粒；
[0025] (V)使所述包覆顆粒干燥。
[0026] 所述至少一種活性成分可能不穩(wěn)定。
[0027] 所述至少一種活性成分可能在光、熱、空氣和/或濕氣存在下不穩(wěn)定。
[0028] 所述至少一種活性成分可為生物材料，如蛋白質(zhì)、肽、活細胞或微生物。
[0029] 所述至少一種活性成分可為不穩(wěn)定的生物材料。
[0030] 所述至少一種活性成分可為對光、熱、空氣和/或濕氣敏感的生物材料。
[0031 ]所述至少一種活性成分可為細胞因子。
[0032]所述至少一種活性成分可選自下組：白介素、干擾素、ΕΡ0、艾塞那肽(Exenatide) G-CSF、人生長激素和胸腺素。
[0033]所述至少一種活性成分可選自下組:抗癌劑、消炎劑、溶血劑、抗糖尿病劑、抗過敏 劑和抗真菌劑。
[0034] 所述加工室在進行所述方法期間的溫度可為約30°C_45°C或約35°C_40°C。
[0035]所述涂布液在接觸所述顆粒前可以是微滴的形式。
[0036] 所述涂布液可在進入所述加工室一秒鐘以內(nèi)在所述顆粒上變?yōu)楣虘B(tài)。
[0037] 在步驟（iii)之前，所述顆?？稍谒黾庸な覂?nèi)流化并通過在其中施加熱量而干 燥。
[0038] 所述顆?？赏ㄟ^加熱到約30 °C -80 °C而干燥。
[0039]步驟(iii)中，所述顆?？尚D(zhuǎn)。
[0040] 可通過將向上的移動旋轉(zhuǎn)氣流引入所述加工室進行步驟（iii)，從而使所述顆粒 以螺旋路徑向上移動。
[0041] 可通過經(jīng)位于所述加工室底部或接近該底部的導(dǎo)向部件吸氣進行步驟（iii)，其 中離開所述導(dǎo)向部件的所述氣體以旋轉(zhuǎn)路徑向上移動，從而使所述顆粒以螺旋路徑向上移 動。
[0042] 所述導(dǎo)向部件可包括吸入氣體的入口和排出氣體的出口，所述導(dǎo)向部件包括作用 于穿過所述入口和所述出口氣體的氣體導(dǎo)向元件，從而該氣體從所述出口排出并以旋轉(zhuǎn)路 徑向上移動。
[0043] 所述導(dǎo)向部件可包括至少兩種適合圍繞共同軸旋轉(zhuǎn)的部件，其中第一部件含能吸 入氣體的入口且其中第二部件含一種或多種從所述第二部件表面向外凸出的氣體導(dǎo)向元 件，其中所述第二部件位于所述第一部件上方且使用時吸入入口的氣體作用在所述一種或 多種氣體導(dǎo)向元件上，使所述第二部件旋轉(zhuǎn)，從而使從所述導(dǎo)向部件排出的氣體以旋轉(zhuǎn)路 徑向上移動。
[0044] 所述氣體可為空氣或惰性氣體，例如氮氣。
[0045] 所述氣