制造中使用經(jīng)預(yù)處理的濾器。用包含表面活性劑的溶液處理濾器，使得蛋白質(zhì) 物質(zhì)結(jié)合濾器的趨勢(shì)降低?？扇缟纤鎏幚頌V器。濾器可具有如上所述的組成。
[0076] 還通過(guò)W下實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明，運(yùn)些實(shí)施例不應(yīng)構(gòu)成限制。
[0077] 實(shí)施例
[0078] 在選擇甲醒滅活的完整流感病毒的純化溶液上進(jìn)行過(guò)濾。在流感病毒的加工中采 用運(yùn)一步驟W在通過(guò)加入吐溫80和十六烷基S漠化錠(CTAB)表面活性劑溶解病毒之前濾 去任何大病毒絡(luò)合物或聚集體。
[0079] 雖然流感病毒具有多形結(jié)構(gòu)，其平均直徑合理估計(jì)為約120皿(0.12微米）。所采用 的凈化過(guò)濾是通過(guò)2個(gè)聚丙締濾器的兩階段過(guò)程;第一濾器孔徑是5微米，第二濾器的標(biāo)稱 孔徑是1.2微米。因此，游離的個(gè)體病毒顆粒應(yīng)該易于通過(guò)運(yùn)些濾器，而在上游加工期間可 能形成的大聚集體將被濾器截留。由于任何運(yùn)類聚集體在后續(xù)的病毒裂解階段期間不會(huì)被 有效溶解，從過(guò)程中去除它們是重要的。預(yù)測(cè)作為總過(guò)濾材料的一部分的大聚集體的數(shù)量 是非常低的，但是可能是流感病毒毒株特異性的。
[0080] 在方法的運(yùn)一階段進(jìn)行的初步質(zhì)量平衡測(cè)定顯示，經(jīng)過(guò)該過(guò)濾的原始材料中一般 大約30%的蛋白質(zhì)沒(méi)有被去除。圖1顯示了3種不同流感病毒毒株(A/Victoria(2010)、B/ F1 or i da和A/化1 i f orn i a)的多個(gè)批次中觀察到的損失。
[0081 ]使用流感病毒RNA特異性的定量PCR試驗(yàn)確認(rèn)蛋白質(zhì)損失是病毒。在進(jìn)行qPCR分析 之前用RNA酶處理所有樣品W避免檢測(cè)到非病毒RNA。對(duì)過(guò)濾前和過(guò)濾后材料的SDS-PAGE分 析也確認(rèn)從該過(guò)程中去除完整病毒蛋白質(zhì)。
[0082] 對(duì)于通過(guò)qPCR評(píng)價(jià)的S種毒株，在加工期間觀察到濾器堵塞。運(yùn)由加工過(guò)程中流 速的逐漸降低顯示（圖2)。在各實(shí)施例中，W約1.9升/分鐘的設(shè)定流速將18升的產(chǎn)品累送通 過(guò)過(guò)濾串（Sartopure PP2 5微米/1.2微米）。濾器在處理18升體積中的10-13升之后堵塞。 此時(shí)使用新的濾器串。
[0083] 沒(méi)有預(yù)料到損失大量通過(guò)運(yùn)些濾器的產(chǎn)品W及它們的后續(xù)堵塞。為了進(jìn)一步表征 產(chǎn)品，由CPS Disc Centri化ge粒度測(cè)量程序分析過(guò)濾前和過(guò)濾后樣品。
[0084] 圖3顯示了 B/化isbane批次的WS粒度測(cè)量圖。分析了過(guò)濾前和過(guò)濾后樣品并且沒(méi) 有觀察到尺寸分布曲線上的差異。
[0085] 運(yùn)些發(fā)現(xiàn)在A/Victoria(2010)流感病毒毒株上重復(fù);在任何情況下都沒(méi)有在過(guò)濾 前檢測(cè)到大量直徑超過(guò)1.2微米的顆粒。
[0086] 由于被阻止通過(guò)濾器的材料小于孔徑，結(jié)果該材料將會(huì)結(jié)合至濾器基質(zhì)并潛在地 封堵孔。用于凈化B/Brisbane的濾器在使用后拆卸并用考馬斯藍(lán)染料對(duì)蛋白質(zhì)染色并與對(duì) 照比較。在5微米和1.2微米濾器上都觀察到密集的染色，而在對(duì)照上沒(méi)有觀察到運(yùn)些。
[0087] 已經(jīng)嘗試使用乙臘、己燒、乙酸乙醋、水、氯仿和鹽水來(lái)去除結(jié)合的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì) (完整病毒)不可逆地結(jié)合并且不會(huì)被去除。
[0088] 用300ml的PBS或300ml Of 0.6%w/v聚山梨醋80沖洗的濾器樣品進(jìn)入100mL的過(guò) 濾前樣品持續(xù)10分鐘，去除并用考馬斯藍(lán)染色，如前所述。運(yùn)些結(jié)果證明在沒(méi)有將產(chǎn)品物理 累送通過(guò)濾器的情況下迅速發(fā)生濾器材料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附。運(yùn)些結(jié)果也證明如果用聚山梨 醋80處理濾器表面，則蛋白質(zhì)吸附的水平顯著降低。
[0089] 多個(gè)純化的流感病毒批料各自分成2份并且用標(biāo)準(zhǔn)聚丙締濾器或者已經(jīng)先前用聚 山梨醋80調(diào)整(預(yù)潤(rùn)濕)的濾器過(guò)濾。如蛋白質(zhì)的BCA試驗(yàn)所檢測(cè)，用經(jīng)調(diào)整的濾器觀察到所 有6個(gè)批次增加的病毒回收率，改善的范圍是21-33%，如圖4所示。
[0090] 為了實(shí)現(xiàn)流感病毒的改善的過(guò)濾特性，不需要向產(chǎn)品中加入聚山梨醋80表面活性 劑?？墒咕凵嚼娲?0結(jié)合濾器，并且在后一階段使產(chǎn)品通過(guò)濾器之前用憐酸鹽緩沖鹽水 (PBS)沖洗來(lái)去除游離的未結(jié)合的表面活性劑。圖5顯示了去除未結(jié)合的表面活性劑所需的 沖洗體積。
[0091] 另一研究比較了使用PBS潤(rùn)濕的濾器或聚山梨醋80潤(rùn)濕的濾器發(fā)生的病毒相對(duì)損 失。同時(shí)，用聚山梨醋80預(yù)調(diào)節(jié)觀察到病毒回收的明顯改善（圖6中的批次號(hào)1)。已經(jīng)成功通 過(guò)聚山梨醋80預(yù)調(diào)節(jié)的濾器的病毒材料隨后被分成2份。一部分通過(guò)正常PBS潤(rùn)濕的濾器； 第二部分通過(guò)聚山梨醋80潤(rùn)濕的濾器。圖6中，標(biāo)記的批次號(hào)2也顯示相對(duì)損失。聚山梨醋80 潤(rùn)濕的濾器觀察到可忽略的損失，而在PBS潤(rùn)濕的濾器上觀察到損失26%的病毒。因此，發(fā) 現(xiàn)已經(jīng)成功通過(guò)聚山梨醋80潤(rùn)濕的濾器的病毒中的大部分隨后結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)未處理的濾器。
[0092] 已經(jīng)參考具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述。然而，本申請(qǐng)不應(yīng)被認(rèn)為僅限于運(yùn)些 實(shí)施例。本申請(qǐng)的范圍由所附權(quán)利要求書定義。
[0093] 參考上述單個(gè)部分中的本發(fā)明的各種特征和實(shí)施方式在合適時(shí)應(yīng)用于其他部分， 細(xì)節(jié)上作必要的修改。因此，合適時(shí)，一個(gè)部分中專有的特征可與其他部分中專有的特征組 厶 1=1 O
[0094] 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解或能夠確定采用常規(guī)實(shí)驗(yàn)即可獲得本文所述的本發(fā)明具 體實(shí)施方式的許多等同形式。運(yùn)類等同形式應(yīng)包含在所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種從感興趣的生物產(chǎn)品中去除聚集體的方法，所述方法包括以下步驟： 提供用表面活性劑預(yù)處理的膜濾器，以提供經(jīng)預(yù)處理的膜濾器;并且將包含生物產(chǎn)品 的流體過(guò)濾通過(guò)所述經(jīng)預(yù)處理的膜濾器以得到包含所述生物產(chǎn)品的濾液； 其中，所述膜濾器的孔徑足夠截留所述流體中存在的聚集體;并且 其中，與未預(yù)處理的對(duì)照相比，實(shí)現(xiàn)了所述濾液中生物產(chǎn)品的較高回收產(chǎn)率。2. -種防止感興趣的生物產(chǎn)品過(guò)濾期間損失的方法，所述方法包括以下步驟： 用表面活性劑預(yù)處理膜濾器，以提供經(jīng)預(yù)處理的膜濾器； 任選地洗滌所述膜濾器;并且 將包含第一量的生物產(chǎn)品的流體過(guò)濾通過(guò)所述經(jīng)預(yù)處理的膜濾器以回收濾液中的生 物產(chǎn)品，其中所述濾液包含第二量的生物產(chǎn)品。3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述第二量的生物產(chǎn)品是所述第一量的生物 產(chǎn)品的至少75%。4. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述生物產(chǎn)品是或包括蛋白質(zhì)、 病毒樣顆粒、病毒顆粒、病毒粒子、或其任意組合。5. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述膜濾器是疏水性膜濾器。6. -種用于將流體過(guò)濾通過(guò)濾器的方法，所述方法包括以下步驟： (i) 提供包含在雞蛋或在細(xì)胞培養(yǎng)物中生長(zhǎng)的病毒的流體樣品； (ii) 將所述流體樣品過(guò)濾通過(guò)已經(jīng)用表面活性劑處理的疏水性濾器； (i i i)將所述病毒加工成疫苗制劑。7. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述病毒是流感病毒。8. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述流體樣品在過(guò)濾之前滅活。9. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法還包括在所述過(guò)濾步驟(i i)之前或 之后純化所述病毒。10. 如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述純化步驟是深度過(guò)濾。11. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法還包括在所述過(guò)濾步驟（i i)之前 或之后用裂解劑裂解所述病毒。12. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述表面活性劑的聚山梨酯 80 〇13. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述濾器包含聚丙烯。14. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述濾器的孔徑范圍是Ο.?μπι 至 ΙΟμπ?ο15. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述蛋白質(zhì)是流感表面蛋白 質(zhì)。16. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，表面活性劑溶液的質(zhì)量濃度范 圍是0.01至10 % w/v表面活性劑。17. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述流體還另外過(guò)濾通過(guò)第二 個(gè)如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的經(jīng)處理的濾器以產(chǎn)生濾液。18. 用于如權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)所述方法的經(jīng)處理的濾器。19. 一種用于生產(chǎn)免疫原性組合物的方法，所述方法包括如權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)所
【專利摘要】本申請(qǐng)?zhí)峁┝诉^(guò)濾流體通過(guò)濾器的方法，其中該流體包含感興趣的生物產(chǎn)品，如蛋白質(zhì)物質(zhì)。過(guò)濾生物產(chǎn)品通過(guò)用表面活性劑預(yù)處理的濾器。
【IPC分類】C12N7/02
【公開(kāi)號(hào)】CN105612250
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201480055163
【發(fā)明人】G·陳, K·墨菲, P·J·賽澤, A·紐曼, B·羅斯
【申請(qǐng)人】諾華股份有限公司
【公開(kāi)日】2016年5月25日
【申請(qǐng)日】2014年10月7日
【公告號(hào)】CA2922996A1, WO2015052177A1