異轉(zhuǎn)糖基酶及其用圖
【專利說明】異轉(zhuǎn)糖基酶及其用途
[0001] 本發(fā)明設(shè)及具有除了混合鍵0-葡聚糖:木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)葡糖基酶(MXE)活性之外的 纖維素:木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)葡糖基酶(CXE)活性的異轉(zhuǎn)糖基酶化TG)蛋白。該蛋白質(zhì)可包含具有 SEQ ID N0:2、6和8中任一個的氨基酸序列或其功能片段;或者該蛋白質(zhì)可包含與SEQ ID N0:2、6和8的任一個或與沈Q ID N0:2的氨基酸22到280、與沈Q ID N0:6的氨基酸26到283、 或與SEQ ID N0:8的氨基酸29到287具有至少60%序列一致性的氨基酸序列。此外，本發(fā)明 設(shè)及編碼在此描述的蛋白質(zhì)的分離的核酸、尤其是包含在此描述的核酸的嵌合基因、包含 所述嵌合基因的載體、包含所述載體或所述嵌合基因的宿主細(xì)胞、W及包含所述嵌合基因 的轉(zhuǎn)基因植物。在此進(jìn)一步披露的是產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法和改變產(chǎn)纖維植物中的至少一 種纖維特性或用于強(qiáng)化如權(quán)利要求書中表征的植物的方法。
[0002] 在本說明書中，引用了許多文件，包括專利申請和制造商手冊。運(yùn)些文獻(xiàn)的披露內(nèi) 容，盡管認(rèn)為與本發(fā)明的可專利性不相關(guān)，通過引用W其全文結(jié)合在此。更具體地，參考的 全部文獻(xiàn)通過引用的方式W相同的程度結(jié)合，如同?？谇覀€別地指出通過引用的方式結(jié)合 每份單獨(dú)的文獻(xiàn)。
[0003] 陸生植物的結(jié)構(gòu)完整性大部分是由植物細(xì)胞周圍的細(xì)胞壁介導(dǎo)的，細(xì)胞壁負(fù)責(zé)植 物的強(qiáng)度和柔性。除了運(yùn)種功能之外，植物細(xì)胞壁對于細(xì)胞間粘聚和細(xì)胞間通訊也是重要 的。細(xì)胞壁孔隙率使水分和養(yǎng)分能夠交換。維管植物的初生細(xì)胞壁由包埋在化學(xué)復(fù)合基質(zhì) 中的纖維素微纖絲組成，該化學(xué)復(fù)合基質(zhì)由多糖組成，運(yùn)些多糖主要如在雙子葉植物和許 多單子葉植物中的木葡聚糖和果膠多糖或主要在草類和谷物中的葡糖醒酸阿拉伯糖基木 聚糖和（1，3;1，4)-0-〇-葡聚糖。雖然到目前為止已經(jīng)闡明了植物細(xì)胞壁中多糖的類型和豐 度，但是在細(xì)胞壁中的多糖之間的分子相互作用方面僅僅可得到很少的信息。廣泛的分子 間氨鍵而不是共價相互作用很久W來被認(rèn)為負(fù)責(zé)將不同的多糖保持在適當(dāng)位置（己西克 (Bacic)等人 1988;薩默維爾（Somervilie)等人2004)。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)木葡聚糖是細(xì)胞壁形態(tài)發(fā)生中的重要因子(綜述于鮑曼(Baumann)等人， 2007)，并且木葡聚糖能夠與纖維素形成氨鍵，參考文獻(xiàn)見《植物雜志》（The Plant Journal) ,1993,第1-30頁。
[0006] 多糖轉(zhuǎn)糖基酶，也稱為多糖轉(zhuǎn)聚糖酶，通過切割多糖鏈中的糖巧鍵并且將它們切 割的部分轉(zhuǎn)移到另一多糖或寡糖分子的非還原殘基的徑基上而催化多糖分子的重組（由弗 蘭科娃(化ankov自)和弗賴伊(扣y)綜述，2013; -并通過引用結(jié)合在此）。轉(zhuǎn)糖基酶的實(shí)例是 轉(zhuǎn)葡糖基酶(也稱為轉(zhuǎn)葡聚糖酶）、轉(zhuǎn)木聚糖酶和轉(zhuǎn)甘露聚糖酶。在運(yùn)些酶中，木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn) 葡糖基酶(XET;也稱為木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)葡聚糖酶，或XTH或木葡聚糖木糖葡糖基轉(zhuǎn)移酶)使包 括木賊屬和苔類在內(nèi)的陸生植物的初生和次生細(xì)胞壁中的木葡聚糖重構(gòu)（弗賴伊(Fry)等 人，1992;弗賴伊等人，2008)。不像大多數(shù)其他測試的陸生植物，木賊屬另外展現(xiàn)出被稱為 混合鍵e-葡聚糖:木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)葡糖基酶(MXE)(或混合鍵0-葡聚糖:木糖葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)葡聚 糖酶）的不同的內(nèi)轉(zhuǎn)葡糖基酶(或內(nèi)轉(zhuǎn)葡聚糖酶）。后者酶使用混合鍵（1，3; 1,4)-0-葡聚糖 (MLG)作為供體底物并且將它共價附接至木葡聚糖或或其片段(弗賴伊等人，2008)。到目前 為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)但尚未詳細(xì)表征催化異轉(zhuǎn)糖基化（即，使用性質(zhì)不同的供體和受體底物）的 酶(艾特?莫翰德(Ait Mohand)和法爾卡什（Farkag ) ,2006)，或者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)運(yùn)些酶僅僅 具有較小的異轉(zhuǎn)糖基化活性(赫爾莫瓦化rmova)等人，參見下文）。
[0007]已經(jīng)顯示，木葡聚糖共價連接至果膠多糖(湯普森(Thompson)和弗賴伊，2000)。在 懸浮培養(yǎng)的玫瑰細(xì)胞中的木葡聚糖與酸性果膠之間的共價鍵的證據(jù)描述于阿布德爾?馬 西(Abdel-Massih)等人(2003)和卡明（Gumming)等人(2005，）。此外，赫爾莫瓦(Hrmova)等 人已經(jīng)示出，來自大麥的XET將MLG、徑乙基纖維素和硫酸溶脹的纖維素（即，硫酸纖維素)連 接至木葡聚糖(赫爾莫瓦化rmova)等人2007)。在其將MLG連接至木葡聚糖的能力方面，運(yùn)種 大麥酶展現(xiàn)出MXE活性，然而，僅僅相當(dāng)于其XET活性的約0.2 %。
[000引本發(fā)明披露內(nèi)容
[0009] 到目前為止，未曾描述將不溶性纖維素共價附接至木葡聚糖的轉(zhuǎn)葡糖基酶活性。 運(yùn)種活性可在比如紡織品、紙張或木漿的纖維素材料的功能化中具有重要應(yīng)用。
[0010] 相應(yīng)地，在第一實(shí)施例中，本發(fā)明設(shè)及具有纖維素:木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)葡糖基酶(CXE) 活性的蛋白質(zhì)。
[0011] 在一個實(shí)施例中，該蛋白質(zhì)來源于木賊屬，如溪木賊巧quisetum fluviatile)、木 賊化quisetum hyemale)、或披散木賊化quisetum diffusum)。
[0012] 在另一個實(shí)施例中，該蛋白質(zhì)包括(a)具有SEQ ID N0:2、6和8中任一個的氨基酸 序列或其功能片段;或(b)與SEQ ID N0:2、6和8的任一個的序列具有至少60%序列一致性 的氨基酸序列;或(C)與SEQ ID N0:2的氨基酸22到280的序列、與SEQ ID N0:6的氨基酸26 到283的序列、或與SEQ ID NO:8的氨基酸29到287的序列具有至少60%序列一致性的氨基 酸序列。
[0013] 除非另外指明，W下針對在此披露的某些方面而描述的實(shí)施例和實(shí)例也適用于在 此披露的其他方面的對應(yīng)實(shí)施例。
[0014] 如本文所用的術(shù)語"蛋白質(zhì)"描述一組由多于30個氨基酸組成的分子，而術(shù)語"膚" 描述由至多30個氨基酸組成的分子。蛋白質(zhì)和膚可W進(jìn)一步形成二聚體、=聚體和更高級 的寡聚體，即由多于一個(多)膚分子組成。形成此類二聚體、=聚體等的蛋白質(zhì)或膚分子可 W相同或不相同。因此，相應(yīng)的更高級的結(jié)構(gòu)被稱為同或異二聚體、同或異=聚體等。術(shù)語 "蛋白質(zhì)"和"膚"也指天然修飾的蛋白質(zhì)或膚，其中修飾是例如通過糖基化、乙酷化、憐酸化 等實(shí)現(xiàn)的。此類修飾在本領(lǐng)域中是熟知的。
[0015] 纖維素:木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)葡糖基酶(CXE)活性表示本發(fā)明的蛋白質(zhì)催化葡聚糖(或纖 維寡糖）單元從作為供體分子的纖維素轉(zhuǎn)移到作為受體分子的木葡聚糖（或其寡糖）的活 性。更具體地說，本發(fā)明的蛋白質(zhì)切割纖維素鏈中的e-(i^4)-葡萄糖鍵，并且然后與作為 受體底物的木葡聚糖聚合物或寡聚體的非還原殘基再形成糖巧鍵。
[0016] 如在此本文使用的，術(shù)語"包含"應(yīng)解釋為指定所陳述的特征、整體、步驟、或部件 的存在，但不排除存在或增加一個或多個特征、整體、步驟、部件或其組。因此，例如，包含核 巧酸或氨基酸序列的核酸或蛋白質(zhì)可W包含比實(shí)際引用的更多的核巧酸或氨基酸，即被嵌 入在更大的核酸或蛋白質(zhì)中或被附接至另一個核酸或蛋白質(zhì)延伸段。一種包括功能上或結(jié) 構(gòu)上定義的DNA區(qū)的嵌合基因可W相應(yīng)地包括另外的DNA區(qū)等。然而，在本披露的上下文中， 術(shù)語"包含"也包括"由……組成"。
[0017] SEQ ID NO: 2、6和8中任一個的氨基酸序列的"功能片段'表示包含W上列出的一 段氨基酸序列的仍然發(fā)揮所希望的功能的蛋白質(zhì)或膚，即，其具有纖維素:木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)葡 糖基酶活性。用于確定功能片段是否具有纖維素:木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)葡糖基酶活性的測定法披 露在所附的實(shí)例中。SEQ ID N0:2的氨基酸序列的功能片段的實(shí)例是包含SEQ ID N0:2的氨 基酸22到280的片段;SEQ ID N0:6的氨基酸序列的功能片段的實(shí)例是包含SEQ ID N0:6的 氨基酸26到283的片段，并且SEQ ID NO:8的氨基酸序列的功能片段的實(shí)例是包含SEQ ID NO: 8的氨基酸29到287的片段。
[0018] 在一個方面，具有纖維素:木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)葡糖基酶活性的本發(fā)明蛋白質(zhì)包含與SEQ ID NO: 2或與沈Q ID NO: 2的氨基酸22到280、或與SEQ ID N0:6或與SEQ ID N0:6的氨基酸 26到283、或與沈Q ID N0:8、或與沈Q ID N0:8的氨基酸29到287具有至少50%、至少60%、 至少70 %、至少80 %、至少90 %、至少95 %或至少98 %序列一致性的氨基酸序列。運(yùn)樣的氨 基酸序列還包括人工衍生的氨基酸序列，例如像通過編碼SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 2的氨 基酸22到280或SEQ ID N0:6或SEQ ID N0:6的氨基酸26到283、或SEQ ID N0:8、或SEQ ID NO: 8的氨基酸29到287的氨基酸的核酸的誘變而產(chǎn)生的那些。通常，在此披露的氨基酸序列 與沈Q ID N0:2或SEQ ID N0:2的氨基酸22到280或沈Q ID N0:6或沈Q ID N0:6的氨基酸26 到283、或SEQ ID N0:8、或SEQ ID N0:8的氨基酸29到287的氨基酸序列可具有至少50%，如 52%、54%、56%、58%，至少60%，如62%、64%、66%、68%，至少70%，如72%、74%、75%、 76%、78%，至少80%，例如81%到84%，至少85%，例如86%、87%、88%、89%、90%、91%、 92%、93%、94%、95%、96%、97%、到98%、和99% 的序列一致性。
[0019] 如在此使用的，術(shù)語"序列一致性百分比"是指在最優(yōu)比對的氨基酸序列的窗口的 兩個區(qū)段之間的相同氨基酸的百分比。用于比對比較窗口的最佳序列比對是本領(lǐng)域技術(shù)人 員熟知的并且可W通過多種工具如史密斯（Smith)和沃特曼(Waterman)的局部同源算法 (沃特曼M.S.，查普曼(Chapman)和霍爾化all),倫敦，1995)、尼德爾曼(Needleman)和翁施 (Wunsch)的同源比對算法（1970)、皮爾森(Pearson)和李普曼化ipman)的相似性捜索方法 (1988)并且優(yōu)選地通過運(yùn)些算法的計算機(jī)化實(shí)施，如作為GCG(注冊商標(biāo)）、威斯康星軟件包 (Wisconsin Package)(來自加利福尼亞州圣地亞哥阿賽樂公司（AcceliTS Inc.)的注冊商 標(biāo))的部分可獲得的GAP、邸STFIT、FASTA和TFASTA來實(shí)施。用于測試序列和參考序列的比對 區(qū)段的"一致性分?jǐn)?shù)"是兩個比對序列間共有的相同組分?jǐn)?shù)目除W參考序列區(qū)段（即完整的 參考序列或該參考序列的較小的限定部分）中組分的總數(shù)目。序列一致性百分比表示為一 致性分?jǐn)?shù)乘W100。一個或多個氨基酸序列或DNA序列可W與全長多氨基酸序列或DNA序列 或其部分比較，或與更長的氨基酸或DNA序列比較?；谳^短的核巧酸或氨基酸序列計算序 列一致性。
[0020] 只有具有纖維素:木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)葡糖基酶活性的蛋白質(zhì)才被本發(fā)明涵蓋。具有在 此披露的纖維素:木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)葡糖基酶活性的蛋白質(zhì)包括在此披露的氨基酸序列W及具 有指示程度的序列一致性而且還具有序列缺失、單個或多個序列變化或功能元件的添加的 那些，只要其基本上保留了纖維素:木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)葡糖基酶活性即可。用于獲得運(yùn)樣的衍生 物的技術(shù)在本領(lǐng)域中是熟知的（參見，例如J. F.薩姆布魯克(J. F. Sambrook)，D. W.拉塞爾 (D.W.Russell) W及N.歐文(N. Irwin) ,2000)。例如，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可W在在此披 露的蛋白質(zhì)中界定運(yùn)些功能性元件并且缺失任何非必要元件。運(yùn)些功能元件可W被修飾或 組合W增加本發(fā)明的運(yùn)些序列用于任何特定應(yīng)用的效用或表達(dá)。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員對 于描述用于構(gòu)建、操作和分離大分子(例如DNA分子、質(zhì)粒、蛋白質(zhì)等）的具體條件和過程的 標(biāo)準(zhǔn)來源材料、連同重組生物的產(chǎn)生W及DNA分子和蛋白質(zhì)的篩選和分離是熟悉的。
[0021] 諸位本發(fā)明人首次示出，存在著能夠?qū)⒗w維素直接連接到木葡聚糖上的異轉(zhuǎn)葡糖 基酶。
[0022] 如W上所描述的，鮑曼(Baumann)等人描述了來自可使用纖維寡糖作為受體的旱 金蓮的NXGl的酶活性。他們特別觀察了纖維二糖、纖維=糖和纖維四糖產(chǎn)物。運(yùn)與艾特?莫 翰德(Ait Mohand)等人的發(fā)現(xiàn)(2006)部分地相矛盾，當(dāng)在檢測方法中應(yīng)用巧光染料而不是 當(dāng)使用放射性標(biāo)記探針時，他們可證實(shí)運(yùn)樣的產(chǎn)物。作者做出結(jié)論，檢測的活性可W是歸因 于用作受體的纖維寡糖內(nèi)的巧光染料的存在的人工活性。赫爾莫瓦化rmova)等人(2007)證 明，來自大麥苗的純化的XET催化某些可溶性底物(如徑乙基纖維素和硫酸纖維素)與木葡 聚糖之間的共價鍵的體外形成。作者指出，運(yùn)樣的活性尚未被證明其具有任何細(xì)胞壁（in muro)重要性。運(yùn)種證明將需要分離具有10個或更少的糖基殘基的短片段，所述糖基殘基可 清楚地顯示源自兩種不同的多糖類型，如纖維素和木葡聚糖。
[0023] 到目前為止，尚未證明將纖維素連接到木葡聚糖上的酶活性，與可溶性纖維素材 料如徑乙基纖維素或硫酸溶脹的纖維素相反。如在所附的實(shí)例中所示，編碼具有運(yùn)種活性 的酶的核酸已被諸位發(fā)明人發(fā)現(xiàn)于木賊屬中。通過W纖維素為供體能夠直接測量新活性的 新穎方法，他們出人意料地示出運(yùn)種新穎的酶能夠?qū)⒉蝗苄怨w纖維素轉(zhuǎn)移到可溶性木葡 聚糖上，而先前的研究僅能鑒定關(guān)于可溶性纖維素衍生物的酶活性。通過將在此獲得的運(yùn) 些結(jié)果與針對其他供體-受體組合而獲得的那些結(jié)果進(jìn)行比較，諸位本發(fā)明人另外示出，該 新穎活性是本發(fā)明蛋白質(zhì)的主要活性之一。
[0024] 在一個實(shí)施例中，所述纖維素:木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)葡糖基酶活性是該蛋白質(zhì)的主要活 性之一。
[0025] 術(shù)語"主要活性"表示在此披露的作為纖維素:木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)葡糖基酶的蛋白質(zhì)為 關(guān)于其他供體/受體的最高活性的至少5%的活性。在一個實(shí)例中，該活性為關(guān)于其他供體/ 受體的最高活性的至少10 %、至少20 %、至少30 %、至少40 %、至少50 %、至少相同（至少 100%)、至少200%、至少500%或至少1000%。本發(fā)明蛋白質(zhì)可W具有多于一種的主要活 性，如兩種或=種，優(yōu)選地相差10倍或更少。本發(fā)明的蛋白質(zhì)還可具有與可溶性纖維素衍生 物有關(guān)的一種或多種活性，運(yùn)些可溶性纖維素衍生物如水溶性乙酸纖維素、徑乙基纖維素、 簇甲基纖維素、硫酸纖維素。
[0026] 測量和比較關(guān)于不同的可溶性供體/受體組合的酶活性在本領(lǐng)域是已知的，并且 還可在所附的實(shí)例中找到。確定關(guān)于W(不溶性)纖維素作為供體分子的酶活性的方法披露 在所附的實(shí)例中?？扇苄曰虿蝗苄怨w分子的性質(zhì)不允許在嚴(yán)格相同的條件下測定酶活 性，因?yàn)槔缱鳛椴蝗苄怨w分子的纖維素比可溶性供體分子遠(yuǎn)遠(yuǎn)更少地接近酶。然而，出 于本發(fā)明的目的，在所附實(shí)例中描述的針對可溶性和不溶性供體分子的條件下，可進(jìn)行不 同活性之間的比較。
[0027] 在一個實(shí)例中，本發(fā)明的蛋白質(zhì)進(jìn)一步具有MXE活性。
[0028] 還披露的是編碼在此披露的蛋白質(zhì)的分離的核酸。
[0029] 核酸可W是單鏈或雙鏈DNA或RNA。核酸可W化學(xué)合成或通過體外或甚至體內(nèi)的生 物表達(dá)而產(chǎn)生?？蒞使用適當(dāng)受保護(hù)的核糖核巧亞憐酷胺和常規(guī)的DNA/RNA合成儀來用化 學(xué)方法合成核酸。RNA合成試劑的供應(yīng)商是普洛里格(Pro 1 igo)(漢堡(Hamburg)，德國）、達(dá) 瑪肯研究公司（Dharmacon Research)(拉斐特化afayette) ,CO,USA)、皮爾斯化學(xué)公司 (Pierce 化emical)(普達(dá)科學(xué)（Perbio Science)的一部分，羅克福德（Rockford)，IL， USA)、格倫研究公司（Glen Research)(斯特林（Sterl ing)，VA，USA)、凱姆基因公司 (加 emGenes)(亞什蘭（Ashland )，MA，USA)、和克魯凱姆公司（Cruachem)(格拉斯哥 (Glasgow),UK)O
[0030] 與本披露的嵌合基因相關(guān)，DNA包括cDNA和基因組DNA。
[0031] 如本申請中所用，"分離的核酸"或"分離的核酸序列"指如上文定義的核酸，它不 是天然存在的（例如具有與天然存在核酸不同的核巧酸序列的人工或合成核酸或比天然存 在核酸更短的核酸)或不再處于最初提供其的天然環(huán)境中的核酸，例如，嵌合基因中與異源 調(diào)節(jié)元件相關(guān)連的核酸編碼序列（例如與可植物表達(dá)的啟動子可操作地連接的細(xì)菌編碼序 列)或被轉(zhuǎn)移至另一種宿主細(xì)胞如轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞中的核酸。
[0032] 根據(jù)本發(fā)明的具有纖維素:木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)葡糖基酶(CXE)活性的蛋白質(zhì)可W是HTG 蛋白。
[00削 "HTG蛋白"，也稱為巧TG酶"，"異-轉(zhuǎn)-0-葡聚糖酶"，或"異-轉(zhuǎn)-0-葡糖基酶"，如在 此使用的，是異轉(zhuǎn)糖基酶、或異-轉(zhuǎn)聚糖酶，其主要活性是異轉(zhuǎn)葡糖基酶活性。所述主要活性 可W是總活性的至少50%、至少60%、或至少70% dHTG可具有MXE和CXE活性。
[0034] 編碼具有纖維素:木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)葡糖基酶(CXE)活性的蛋白質(zhì)或所述HTG蛋白的核 酸可被引入到其他植物中，從而在活的植物例如作物植物產(chǎn)生改性的纖維素微纖絲。
[0035] 人們認(rèn)為在植物中表達(dá)本發(fā)明核酸導(dǎo)致所得酶的活性，該所得酶將植物的一些纖 維素分子共價連接至其內(nèi)源木葡聚糖，由此強(qiáng)化例如植物纖維產(chǎn)品中的細(xì)胞壁。壁強(qiáng)化在 任何作物植物中也是有用的，例如，W將(作物)植物如谷物或油料作物的倒伏降低到最低 限度，或者增強(qiáng)木本植物或作物植物的強(qiáng)度。
[0036] 可替代地，表達(dá)在此披露的核酸的植物可被供養(yǎng)或者經(jīng)過遺傳改變而內(nèi)源性地合 成木葡聚糖，其中在供養(yǎng)的情況下，所述木葡聚糖任選地具有附接到其上的另外的有機(jī)或 無機(jī)分子(如下文進(jìn)一步描述）。潛在應(yīng)用包括:纖維素紙、纖維素紡織品（例如棉花或亞麻 布）、纖維素包裝(例如硬紙板）、纖維素建筑材料(例如木材和創(chuàng)花板）、纖維素衍生物(例如 簇甲基纖維素或乙酸纖維素）、增稠劑(例如黃原膠或其衍生物）、纖維素醫(yī)用敷料(例如原 棉、紗布、玻璃紙、透析管）、纖維素色譜柱填料;所附接的有機(jī)或無機(jī)物質(zhì)可W被選擇為能 夠進(jìn)行親和色譜。
[0037] 在另一個實(shí)例中，可W在維持例如在植物纖維中的HTG酶的活性的條件下收獲表 達(dá)在此披露的核酸的植物，使得任選地具有附接的有機(jī)或無機(jī)物質(zhì)的木葡聚糖或木葡聚糖 寡糖能夠被結(jié)合到收獲后的纖維素中，而不另外添加酶。上文列出了潛在的應(yīng)用。
[0038] 可替代地，該HTG蛋白可例如在微生物中異源表達(dá)，并且在分離之后，在存在任選 地具有附接的有機(jī)或無機(jī)分子的木葡聚糖或木葡聚糖寡糖(纖維素將與之共價附接）的情 況下，在收獲后所述HTG蛋白被應(yīng)用于未改性的植物纖維或(植物衍生的)纖維素。
[0039] 總而言之，通過將本發(fā)明蛋白質(zhì)添加至不溶性纖維素材料，即，包含纖維素的材 料，諸位本發(fā)明人能夠增加纖維素纖維之間木葡聚糖介導(dǎo)的互連的量。因此他們創(chuàng)造了用 于提高各種纖維素材料的強(qiáng)度和/或其他特性的環(huán)境友好型酶工藝，作為到目前為止已知 的化學(xué)工藝的替代方案?？商娲?，本發(fā)明的蛋白質(zhì)允許通過改性的木葡聚糖的共價連接 而將新的功能性與纖維素共價附接。
[0040] 在一個實(shí)例中，該分離的核酸包含與沈Q ID NO: 1、或SEQ ID N0:5、或沈Q ID NO: 7或其互補(bǔ)物具有至少60%序列一致性的核酸，或與SEQ ID NO: 1的核巧酸64到840或其互 補(bǔ)物、或與SEQ ID N0:5的核巧酸76到849或其互補(bǔ)物、或與SEQ ID N0:7的核巧酸85到861 或其互補(bǔ)物具有至少60%序列一致性的核酸，或在高嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO: 1、或SEQ ID N0:5、或SEQ ID N0:7的序列或其互補(bǔ)物雜交的核酸序列。所述分離的核酸還可包含或其組 成為沈Q ID NO: 1或沈Q ID NO: 1的核巧酸64到840或沈Q ID NO:5或沈Q ID NO:5的核巧酸 76到849或SEQ ID N0:7、或SEQ ID N0:7的核巧酸85到861或其互補(bǔ)物的核酸序列。進(jìn)一步 提供的是核酸，其可W是與SEQ ID NO: 1的核巧酸64到840或其互補(bǔ)物(條件是核巧酸巧化3 不存在）、或與SEQ ID NO: 5的核巧酸76到849或其互補(bǔ)物(條件是核巧酸1到75不存在）、或 與SEQ ID N0:7的核巧酸85到861或其互補(bǔ)物(條件是核巧酸巧化4不存在)具有至少60%序 列一致性的分離的核酸。進(jìn)一步提供的是核酸，其可W是編碼包含與SEQ ID N0:2、6和8的 任一個的序列具有至少60%序列一致性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的分離的核酸，其密碼子使 用適合于在細(xì)菌中表達(dá)、或在酵母中表達(dá)、或在植物中表達(dá)。
[0041 ] 可W優(yōu)化密碼子使用，例如，如莫雷拉(Moreira) ,2004所述。
[0042] 在此還披露了嵌合基因，其包含W下可操作連接的元件：（a)啟動子，例如，可在植 物、細(xì)菌或酵母中表達(dá)的啟動子；（b)能夠調(diào)節(jié)如在此所述的蛋白質(zhì)的表達(dá)的核酸；W及，任 選地，（C)轉(zhuǎn)錄終止和聚腺巧酸化區(qū)。
[0043] 能夠調(diào)節(jié)如在此所述的蛋白質(zhì)表達(dá)的核酸可W是能夠下調(diào)如在此所述的蛋白質(zhì) 表達(dá)的核酸。
[0044] 在另一個實(shí)施例中，能夠調(diào)節(jié)本發(fā)明蛋白質(zhì)表達(dá)的所述核酸選自下組，該組由W 下各項(xiàng)組成:編碼根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的核酸序列；與SEQ ID N0:l、5和7的任一個或其互 補(bǔ)物具有至少60%序列一致性的核酸序列；與SEQ ID NO: 1的核巧酸64到840的序列或其互 補(bǔ)物、與SEQ ID NO:5的核巧酸76到849的序列或其互補(bǔ)物、或與SEQ ID NO:7的核巧酸85到 861的序列或其互補(bǔ)物具有至少60%序列一致性的核酸序列；和在高嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO: 1、5和7任一個的序列或其互補(bǔ)物雜交的核酸序列。
[0045] 能夠下調(diào)或換言之降低如在此所述的蛋白質(zhì)的表達(dá)的核酸可W是編碼抑制所述 蛋白質(zhì)的表達(dá)和/或活性的蛋白質(zhì)的核酸。此外，導(dǎo)致如在此所述的蛋白質(zhì)的表達(dá)減少的所 述核酸分子也可W是抑制基因表達(dá)的核酸分子，該基因是所述蛋白質(zhì)的表達(dá)的激活劑。抑 制如本文所述的蛋白質(zhì)的表達(dá)的所述核酸分子也可W是直接抑制所述蛋白質(zhì)表達(dá)的RNA分 子，如介導(dǎo)編碼所述蛋白質(zhì)的基因的沉默的RNA。
[0046] 降低本發(fā)明蛋白質(zhì)的表達(dá)和/或活性可W是減少所產(chǎn)生的功能蛋白的量。所述減 少可W是與具有野生型表達(dá)水平和活性的細(xì)胞所產(chǎn)生的功能蛋白的量相比減少至少30%、 40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或100% (即，細(xì)胞沒有產(chǎn)生功能蛋白）。在表達(dá)上的 所述減少可W是在所產(chǎn)生的功能蛋白的量上的組成型減少。所述減少也可W是在所產(chǎn)生的 功能蛋白的量上的時間/誘導(dǎo)型減少。
[0047] 可通過內(nèi)源基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后沉默而便利地降低或消除編碼根據(jù)本發(fā)明 的蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)。為此，并且在上述嵌合基因內(nèi)，將沉默RNA分子引入到祀向編碼本 發(fā)明蛋白質(zhì)的內(nèi)源基因的植物細(xì)胞中。如在此使用的，"沉默RNA"或"沉默RNA分子"是指在 引入細(xì)胞中時降低祀基因表達(dá)的任何RNA分子。運(yùn)樣的沉默RNA可W是例如所謂的"反義 RNA"，由此該RNA分子包含與祀核酸的序列(優(yōu)選地，祀基因的編碼序列）的互補(bǔ)物具有95% 序列一致性的具有至少20個連續(xù)核巧酸的序列。然而，反義RNA也可W針對祀基因的調(diào)節(jié)序 列，包括啟動子序列W及轉(zhuǎn)錄終止和聚腺巧酸化信號。沉默RNA進(jìn)一步包括例如所謂的"有 義RNA"，由此該RNA分子包含與祀核酸的序列具有95%序列一致性的具有至少20個連續(xù)核 巧酸的序列。其他沉默RNA可W是與祀核酸的序列的互補(bǔ)物具有95%序列一致性的包含至 少20個連續(xù)核巧酸的"未經(jīng)聚腺巧酸化的RNA"，如在WO 01/12824或US 6423885中所述(兩 個文件均通過引用結(jié)合在此）。沉默RNA的又另一種類型是如描述于WO 03/076619(通過引 用結(jié)合在此）中的RNA分子，其包含與祀核酸的序列或其互補(bǔ)物具有至少95%、至少96%、至 少97%、至少98%、至少99%或100%序列一致性的至少20個連續(xù)核巧酸，并且進(jìn)一步包含 如描述于WO 03/076619中的主要為雙鏈的區(qū)域(包括包含核定位信號或包含CUGS核巧酸 重復(fù)的主要為雙鏈的區(qū)域，所述核定位信號來自馬鈴馨紡鍵塊莖類病毒類型的類病毒）。沉 默RNA還可W是包含如在此定義的有義和反義鏈的雙鏈RNA，其中該有義和反義鏈能夠彼此 堿基配對W形成雙鏈RNA區(qū)（優(yōu)選地，有義和反義RNA的所述至少20個連續(xù)核巧酸彼此互 補(bǔ)）。有義和反義區(qū)還可存在于一個RNA分子內(nèi)，使得在有義和反義區(qū)形成雙鏈RNA區(qū)時可形 成發(fā)夾RNA化pRNA) DhpRNA是本領(lǐng)域熟知的（參見，例如WO 99/53050，通過引用結(jié)合在此）。 h