經(jīng)處理的濾器的制造方法
【專利說明】經(jīng)處理的濾器
[0001] 相關(guān)申請
[0002] 該國際申請要求2013年10月7日提交的歐洲申請?zhí)?3187628的優(yōu)先權(quán)，其全文通 過引用納入本文。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明設(shè)及一種過濾包含蛋白質(zhì)的流體的方法。本發(fā)明還設(shè)及用于該方法的經(jīng)處 理的濾器和由該方法得到的濾液。
【背景技術(shù)】
[0004] 在蛋白質(zhì)物質(zhì)的加工期間，通常需要使用過濾步驟。運一過濾步驟能夠去除將對 最終產(chǎn)物不利的組分。例如，通過選擇合適孔徑的濾器，可能從病毒顆粒的大聚集體中分離 游離的、完整病毒顆粒。
[0005] EP0188104 Bl描述了通過裝置如含有濾器的屯、切開術(shù)儲器過濾血液產(chǎn)品。已經(jīng)用 聚山梨醋80處理濾器，其改善了通過裝置的血液的重力流。然而，該技術(shù)限于血液過濾并且 沒有公開純化治療性蛋白質(zhì)，如用于疫苗的病毒蛋白質(zhì)或病毒粒子。EP0188104并沒有使用 過濾來從感興趣的蛋白質(zhì)中去除大蛋白質(zhì)聚集體。此外，EP0188104需要在使用之前干燥濾 器，運在本發(fā)明中不需要。
[0006] W0/2011/051235描述了加入叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRIT0NX-100⑥）W增加 流感疫苗制造中的過濾性能。然而，在W0/2011/051235中，曲通加入病毒制備物中而不是用 于預(yù)處理濾器。此外，在W0/2011/051235中，是在裂解之后和滅活之前加入。在本發(fā)明的情 況中，優(yōu)選在裂解之前使用經(jīng)去污劑處理的濾器。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 在病毒產(chǎn)品的制備中，蛋白質(zhì)物質(zhì)的過濾、產(chǎn)物無菌性和安全性是關(guān)鍵的。采用滅 活步驟來殺死感染性物質(zhì)。通常，滅活劑，如甲醒通過誘導(dǎo)蛋白質(zhì)物質(zhì)的交聯(lián)來殺死感染性 復(fù)制機(jī)構(gòu)，也可能產(chǎn)生聚集的蛋白質(zhì)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)過濾包含蛋白質(zhì)物質(zhì)的流體是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。 例如，盡管進(jìn)行過濾和純化步驟，仍觀察到所需產(chǎn)品的量的明顯減少，即使在預(yù)期蛋白質(zhì)物 質(zhì)的粒度容易通過濾器時亦是如此。
[000引發(fā)明人已經(jīng)確定可通過在包含蛋白質(zhì)物質(zhì)的流體過濾之前或期間處理濾器來避 免感興趣的生物產(chǎn)品（例如，蛋白質(zhì)物質(zhì)）的運種意料之外的損失。具體地，已經(jīng)意外地發(fā) 現(xiàn)，與對照即其他等同條件下未處理的膜濾器相比，用表面活性劑預(yù)處理的膜濾器可導(dǎo)致 感興趣的生物產(chǎn)品回收率得到令人驚訝的改善。
[0009] 因此，本發(fā)明提供了一種從包括大聚集體雜質(zhì)的混合物中純化生物產(chǎn)品，如蛋白 質(zhì)的方法。按照本發(fā)明，生物產(chǎn)品經(jīng)過濾通過具有截留大蛋白質(zhì)聚集體雜質(zhì)的尺寸的合適 過濾膜。用降低感興趣的生物產(chǎn)品與濾膜的結(jié)合的表面活性劑預(yù)處理疏水性濾器。
[0010] 可通過本發(fā)明過濾的生物產(chǎn)品包括抗體、血液產(chǎn)品、病毒蛋白質(zhì)和多糖。
【附圖說明】
[0011] 圖1顯示了在過濾通過未處理的濾器之后流感病毒的各毒株的蛋白質(zhì)損失百分 比。
[0012] 圖2顯示了正通過未處理的濾器的流感病毒的各毒株的流速與時間的變化。
[0013] 圖3顯示了在用未處理的濾器過濾之前和之后流感病毒毒株的粒度分布。
[0014] 圖4顯示了相對于用未處理的濾器過濾，按照本發(fā)明的處理濾器產(chǎn)生的回收病毒 產(chǎn)率的增加。
[0015] 圖5顯示了用各種憐酸鹽緩沖鹽水沖洗體積去除的聚山梨醋80(吐溫)的量。
[0016] 圖6顯示了相對于經(jīng)聚山梨醋80(吐溫)處理的濾器，用經(jīng)憐酸鹽緩沖鹽水溶液處 理的濾器過濾時病毒損失百分比。
【具體實施方式】
[0017] 在一個方面中，本發(fā)明設(shè)及從大蛋白質(zhì)聚集形成的雜質(zhì)中純化感興趣的生物產(chǎn)品 的方法。因此，在一些實施方式中，提供了含有至少一種感興趣的生物產(chǎn)品的樣品（例如，流 體)中去除聚集體的方法。
[0018] 按照本發(fā)明，該方法包括使用合適的膜濾器，該膜濾器已經(jīng)用表面活性劑，例如表 面活性劑溶液預(yù)處理W提供經(jīng)預(yù)處理的膜濾器。如本文中更詳細(xì)的描述，經(jīng)預(yù)處理的膜濾 器一般不在該步驟之后干燥?？扇芜x地用合適的緩沖液或水洗涂經(jīng)預(yù)處理的膜濾器W在過 濾步驟之前從膜濾器中去除過量(例如，未結(jié)合)的表面活性劑。一旦獲得并任選地洗涂經(jīng) 預(yù)處理的膜濾器，然后使用經(jīng)預(yù)處理的膜濾器過濾含感興趣的生物產(chǎn)品的樣品（例如，流體 樣品）。感興趣的生物產(chǎn)品通過經(jīng)預(yù)處理的膜濾器過濾并收集為濾液。該步驟從樣品中去除 不需要的大聚集體。
[0019] 在一些實施方式中，提供了防止生物產(chǎn)品過濾期間損失的方法。減少制造期間產(chǎn) 品的不希望損失尤其對于生物產(chǎn)品而言是重要因素。可通過比較在過濾步驟之前樣品中存 在的生物樣品的起始量和在過濾步驟之后濾液中存在的生物產(chǎn)品的最終量來確定相對于 過濾的相對回收產(chǎn)率。希望該產(chǎn)率盡可能接近100%，例如，約100%、至少95%、至少90%、 至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少65%、至少60%等。
[0020] 因此，本發(fā)明提供了方法，其中將包含第一量的生物產(chǎn)品的流體過濾通過經(jīng)預(yù)處 理的膜濾器W回收濾液中的生物產(chǎn)品，其中濾液包含第二量的生物產(chǎn)品。在一些實施方式 中，第二量的生物產(chǎn)品是第一量的生物產(chǎn)品的至少7 5 %，例如，至少8 0 %、至少8 5 %、至少 90%、至少 95 %。
[0021] -般而言，在本發(fā)明的任意實施方式中，合適的膜濾器包括疏水性膜濾器。另外， 基于孔徑選擇合適的膜濾器W過濾感興趣的生物產(chǎn)品同時截留流體樣品中可能存在的聚 集體。如本文所示的數(shù)據(jù)所示，與未預(yù)處理的對照相比，可使用本文所述的方法實現(xiàn)濾液中 生物產(chǎn)品的明顯更高的回收產(chǎn)率。
[0022] 本發(fā)明可用于加工包含一種或多種生物產(chǎn)品的組合物，具體用于需要高純度的組 合物。因此，本發(fā)明可用于生產(chǎn)藥品、營養(yǎng)品和/或化妝品。在一些實施方式中，生物產(chǎn)品是 或包括蛋白質(zhì)、病毒樣顆粒、病毒顆粒、病毒粒子、或其任意組合。
[0023] 在一些實施方式中，生物產(chǎn)品過濾通過一定孔徑的疏水性濾膜，該孔徑截留非感 興趣產(chǎn)品的大蛋白質(zhì)聚集體雜質(zhì)，其中濾膜已經(jīng)用去污劑預(yù)處理，并且預(yù)處理降低了感興 趣的生物產(chǎn)品與濾膜的結(jié)合。該方法可包括其他步驟，尤其是將感興趣的生物產(chǎn)品配制成 適用于給予人或動物患者的形式。
[0024] 在優(yōu)選的實施方式中，感興趣的生物產(chǎn)品是蛋白質(zhì)。相對于感興趣的生物產(chǎn)品的 尺寸/重量確定大蛋白質(zhì)聚集體。大蛋白質(zhì)聚集體理解為在尺寸和/或重量上明顯大于感興 趣的生物產(chǎn)品。明顯大表示尺寸和/或重量比感興趣的產(chǎn)物高至少8倍，優(yōu)選10、15、20、30、 50倍?？赏ㄟ^，例如凝膠電泳確定蛋白質(zhì)聚集體的尺寸和重量。如果病毒是感興趣的產(chǎn)品， 則大聚集體的尺寸至少是化m，優(yōu)選> 1.5; > 2、> 3、> 4、> 5、或> 10皿。如果是病毒蛋白 質(zhì)，例如HA或NA抗原是感興趣的產(chǎn)品，則大聚集體的尺寸是至少0.2皿，優(yōu)選> 0.5、> 0.8、 > 1、含2、含3、含4、含5、或含lOiim。如果過濾的產(chǎn)物在尺寸/重量上不同于最終(治療)產(chǎn)品， 例如，因為經(jīng)過濾的產(chǎn)品經(jīng)裂解、切割、標(biāo)記等加工，則"感興趣的產(chǎn)品"表示過濾步驟的產(chǎn) 品而非最終(經(jīng)處理）的產(chǎn)品。
[0025] 在一個實施方式中，大蛋白質(zhì)聚集體通過共價鍵連接，例如，通過甲醒交聯(lián)。在另 一個實施方式中，大聚集體通過非共價鍵連接(例如，離子或疏水鍵）。蛋白質(zhì)聚集體可能含 有非蛋白質(zhì)組分，如核酸或糖。在優(yōu)選的實施方式中，如果濾器材料還未如本發(fā)明所述經(jīng)預(yù) 處理，則感興趣的生物產(chǎn)品強(qiáng)烈結(jié)合濾器材料。運種結(jié)合在截留感興趣的產(chǎn)物的完整性和/ 或生物功能的條件下甚至可能是不可逆的。
[0026] 因此，本發(fā)明的一個方面提供了一種將流體過濾通過濾器的方法，其中該流體包 含病毒蛋白質(zhì)，尤其是流感抗原，并且該方法包括W下步驟：（i)將濾器與包含表面活性劑 的溶液接觸W產(chǎn)生經(jīng)處理的濾器，和（ii)使流體通過經(jīng)處理的濾器W給出濾液。
[0027] 在優(yōu)選的實施方式中，在步驟(ii)之前進(jìn)行步驟(i)。或者，如下文所述，可同時進(jìn) 行步驟(i)和(ii)。
[0028] 在另一個方面中，提供了一種過濾流體通過濾器的方法，其中該流體包含病毒或 病毒蛋白并且濾器已經(jīng)與不同于包含表面活性劑的病毒制備物的溶液接觸W產(chǎn)生經(jīng)處理 的濾器并且該方法包括將流體通過經(jīng)處理的濾器W得到濾液的步驟。產(chǎn)生的濾液可經(jīng)進(jìn)一 步加工如色譜純化、深度過濾和/或滅菌W產(chǎn)生疫苗制劑。
[0029] 其他方法將是制備從雞蛋或細(xì)胞培養(yǎng)物中培養(yǎng)的病毒蛋白質(zhì)?？墒褂玫闹苽浼夹g(shù) 包括在培養(yǎng)的雞蛋或細(xì)胞培養(yǎng)物中生長病毒，凈化含有病毒的混合物W去除碎片，化學(xué)或 物理滅活混合物，過濾滅活的病毒通過已經(jīng)用表面活性劑處理的濾器，然后進(jìn)一步將病毒 加工成疫