一種液液萃取-gfaas法測(cè)定一價(jià)銅含量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于微量元素檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體地，設(shè)及一種液液萃取-GFAAS法測(cè)定一 價(jià)銅含量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 銅離子是生物體不可缺少的微量元素。在生物體內(nèi)，銅主要是W與酶、蛋白質(zhì)分子 W及一些生物小分子如氨基酸絡(luò)合的狀態(tài)存在。銅離子參與生物體一些重要的生理過(guò)程， 如細(xì)胞呼吸、神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞、抗氧化應(yīng)激和鐵離子的攝取都依賴于銅離子。人體許多疾病 與體內(nèi)銅離子失衡有關(guān)，如肝豆?fàn)詈俗冃浴偱２?、阿爾茲海默癥和癌癥等。神經(jīng)退行性疾 病與銅藍(lán)蛋白的喪失生物活性或Cu(I)毒性有關(guān)。銅離子在生物體內(nèi)發(fā)揮的作用主要是基 于它氧化還原的化學(xué)性質(zhì)，也就是Cu 2+和Cu+氧化態(tài)之間的轉(zhuǎn)換。細(xì)胞內(nèi)的一些重要生物化 學(xué)反應(yīng)是由于兩個(gè)氧化態(tài)之間的轉(zhuǎn)換而得W進(jìn)行。
[0003] 目前生物體大多只能定量測(cè)定總銅，并不能區(qū)分Cu(I)和化（n)。生物體系iig/L級(jí) 的痕量Cu(I)離子測(cè)定國(guó)內(nèi)外迄今沒(méi)有文獻(xiàn)報(bào)道。在Cu(E)離子存在下，測(cè)定Cu(I)銅離子 面臨著如何消除化（H)離子的干擾問(wèn)題。在純化學(xué)體系中測(cè)定Cu(I)離子時(shí)，Cu(I)離子很 容易被空氣的氧所氧化，在無(wú)機(jī)溶液中很不穩(wěn)定。但由于其能與聯(lián)哇嘟形成高強(qiáng)度雙配位 基Cu(I)離子配合物，且在有機(jī)溶劑中能穩(wěn)定存在，因此可用分光光度法測(cè)定。但對(duì)生物樣 本痕量的化(I)離子仍然無(wú)法用分光光度法測(cè)定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種液液萃取-GFAAS法測(cè)定一價(jià)銅含量的方 法。
[0005] 本發(fā)明的上述目的是通過(guò)W下技術(shù)方案予W實(shí)現(xiàn)。
[0006] -種液液萃取-GFAAS法測(cè)定一價(jià)銅含量的方法，包括如下步驟： 51. 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的制作:在惰性氣體的保護(hù)下，將化Cl的標(biāo)準(zhǔn)品用飽和KCl溶液定容， 得到1000 ppm的亞銅標(biāo)準(zhǔn)溶液;取亞銅標(biāo)準(zhǔn)溶液與pH 9的甘氨酸-NaOH緩沖溶液按體積比1: 9混合，再向混合溶液中加入等體積的0.06%(w/w) 2 J/-聯(lián)哇嘟的正戊醇溶液，混勻，靜置 分層，取上層有機(jī)層用2 J/-聯(lián)哇嘟的正戊醇溶液依次稀釋成10、1、0.1、0.Olppm溶液，取 0.0 lppm溶液ImL上機(jī)，制作工作曲線； 52. -價(jià)銅的檢測(cè):將樣品與等體積20%的S氯乙酸混勻，根據(jù)樣品含銅量，再與抑9的 甘氨酸-化OH緩沖溶液按不同比例稀釋，再向混合溶液中加入ImL的0.06%(w/w)2，2/ -聯(lián)哇 嘟的正戊醇溶液，混勻，靜置分層，取上層有機(jī)層，上機(jī)用石墨爐原子吸收法測(cè)定一價(jià)銅含 量； 其中，S2所述樣品為血清時(shí)，取樣品的上清液用緩沖溶液稀釋20倍;S2所述樣品為細(xì)胞 液、細(xì)胞膜液、組織液或尿液時(shí)，取樣品的上清液用緩沖溶液稀釋1倍;S2所述樣品為不含蛋 白的無(wú)機(jī)溶液時(shí)，直接將樣品用緩沖溶液稀釋1倍。
[0007] 甘氨酸與Cu(n)能形成穩(wěn)定的無(wú)機(jī)絡(luò)合物，其穩(wěn)定常數(shù)為15.1，且在pH 8-10范 圍，極易生成配位比1:2的穩(wěn)定銅氨絡(luò)合物，所形成的甘氨酸馨合銅不溶于有機(jī)溶劑，其中 抑為卵寸最優(yōu)。2,2/-亞銅試劑（2,2/-聯(lián)哇嘟）是測(cè)定化（I)的特效試劑，與Cu(I)形成 的絡(luò)合物能很好地溶解在有機(jī)溶劑而難溶于水。當(dāng)含有甘氨酸的水溶液生物樣本用含有2， 2/-聯(lián)哇嘟的有機(jī)溶劑萃取時(shí)，就能將兩者很好地分離在水相和有機(jī)相中，從而達(dá)到將兩 種離子分離而達(dá)到分別測(cè)定的目的。分離后的有機(jī)相用石墨爐原子吸收測(cè)定Cu(I)，就能大 大提高測(cè)定化(I)的靈敏度。
[0008] 優(yōu)選地，S2所述樣品為含蛋白的樣品時(shí)，將樣品與=氯乙酸混勻后離屯、去蛋白，再 取去蛋白后的上清液進(jìn)行后續(xù)步驟。含蛋白質(zhì)的樣品包括血清、細(xì)胞液、細(xì)胞膜液、組織液。 不含蛋白的無(wú)機(jī)溶液或其他生物體液如尿液，可減少去蛋白步驟。優(yōu)選地，所述不含蛋白的 無(wú)機(jī)溶液包括礦泉水、自來(lái)水。
[0009] 優(yōu)選地，所述離屯、為1200巧m離屯、1 Omin。
[0010] 優(yōu)選地，S2所述樣品為細(xì)胞液、細(xì)胞膜液或組織液時(shí)，另取未去蛋白前的樣品測(cè)定 蛋白濃度，W蛋白含量定量一價(jià)銅濃度。S2所述樣品為細(xì)胞液、細(xì)胞膜液或組織液時(shí)，因細(xì) 胞無(wú)法定量體積，故須另取未去蛋白前的樣品測(cè)定蛋白濃度，用同體積的樣本含銅量除W 含蛋白量，即每克蛋白所含的亞銅質(zhì)量定量一價(jià)銅濃度。
[0011] 優(yōu)選地，S2所述樣品來(lái)自細(xì)胞時(shí)，將樣品進(jìn)行如下預(yù)處理:培養(yǎng)數(shù)天后的細(xì)胞收 集，超聲或冰凍破碎后，分離得到的上清即細(xì)胞液，沉淀下來(lái)的細(xì)胞膜用適量表面活性劑溶 解，再作為樣品進(jìn)行測(cè)定。
[0012] 優(yōu)選地，S1、S2所述混勻的方法為旋滿振蕩Imin。
[OOU]優(yōu)選地，S1、S2所述緩沖溶液中的甘氨酸濃度含O.Olmol/L。
[0014] 優(yōu)選地，S2所述上層有機(jī)層的上機(jī)量為50化L。
[0015] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有益效果在于:本發(fā)明提供了一種生物樣品中痕量一價(jià) 銅離子含量的檢測(cè)方法，對(duì)探討機(jī)體銅代謝失衡有重要意義。本發(fā)明方法能夠區(qū)分Cu(I)和 Cu(n)，在測(cè)定Cu(I)時(shí)消除了 Cu(E)離子的干擾，對(duì)生物體系痕量Cu(I)離子的檢測(cè)限達(dá) 0. l〇yg/L，相對(duì)偏差<5%。回收率:95~102〇/〇。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何 形式的限定。除非特別說(shuō)明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試劑、方法 和設(shè)備。
[0017]實(shí)施例1 標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)備:5g裝的化Cl標(biāo)準(zhǔn)品開(kāi)封后，用l(m ImL塑料管分裝，小屯、充入氣氣，將管內(nèi) 空氣驅(qū)凈后用密封膠封好管口，并儲(chǔ)存于放硅膠的干燥器中。
[0018] -種液液萃取-GFAAS法測(cè)定一價(jià)銅含量的方法，包括如下步驟： SI.標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的制作：配制工作曲線時(shí)，取出其中一管，稱取CuCl的標(biāo)準(zhǔn)品 (99.999%，阿拉下)0.0156g置于10血容量瓶，用飽和KCl溶液稀釋至刻度線，即得1000 ppm亞 Cu標(biāo)準(zhǔn)溶液，從中取10化L置于5血塑料管，力的00化抑為9 Glycine(甘氨酸)-化OH緩沖溶 液，再加1000化0 . 〇6%2，2/ -聯(lián)哇嘟的正戊醇溶液，旋滿振蕩Imin,靜置分層，上層即得 I(K)PPm亞銅標(biāo)準(zhǔn)溶液，再?gòu)纳蠈佑袡C(jī)層取10化L用2,2/ -聯(lián)哇嘟的正戊醇溶液依次稀釋成 10，1,0.1,0.Olppm溶液，用0.Olppm溶液上機(jī)，正戊醇為稀釋劑做工作曲線。
[0019] S2.化（I)測(cè)定:將2(K)化血清樣品與20化L20%S氯乙酸混勻，1200轉(zhuǎn)離屯、IOmin去 蛋白，取血清上清液50化置5血塑料管內(nèi)，加入95化L抑為9的甘氨酸Glycine-NaOH緩沖溶 液，混勻后加入1000化0. 〇6%2，2/ -聯(lián)哇嘟的正戊醇溶液，旋滿振蕩Imin，靜置分層后取上層 50化L，上機(jī)用石墨爐原子吸收法測(cè)定。
[0020] 所述樣品還可為細(xì)胞液或其它生物體液等；當(dāng)測(cè)定細(xì)胞液、細(xì)胞膜液或組織液時(shí)， 去蛋白后的液體與甘氨酸Glycine-NaOH緩沖溶液按1:1稀釋，除了按上述步驟測(cè)定之外，另 取一定體積樣本測(cè)定蛋白濃度，W蛋白含量定量亞銅濃度； 如果是不含蛋白的無(wú)機(jī)液或其它生物體液如尿液，就可減少去蛋白運(yùn)個(gè)步驟。當(dāng)需檢 測(cè)細(xì)胞膜的Cu(I)時(shí)，培養(yǎng)數(shù)天后的細(xì)胞收集，超聲或冰凍破碎后，分離得到的上清即細(xì)胞 液，沉淀下來(lái)的細(xì)胞膜可用適量表面活性劑(如2%Triton X-100)溶解，再作為樣品進(jìn)行測(cè) 定。
[0021] 按照上述方法對(duì)農(nóng)夫山泉、自來(lái)水、尿血清、細(xì)胞液和細(xì)胞膜中的Cu(I)進(jìn)行測(cè)定， 結(jié)果如表1。每組樣品重復(fù)實(shí)驗(yàn)=次。
[0022] 表1不同樣品的檢測(cè)實(shí)例
注:yg/評(píng)ro:微克每克蛋白；TCu:總銅 該方法檢測(cè)限:0.1化g/L，相對(duì)偏差<5%?；厥章?95~102%。運(yùn)對(duì)探討人體銅代謝失衡 有重要意義。
[0023] 補(bǔ)充說(shuō)明：1，由于不同樣品中的亞銅均轉(zhuǎn)移到了有機(jī)相才進(jìn)行上機(jī)測(cè)定，故所有 樣品都可用同一條工作曲線測(cè)定。
[0024] 2,上機(jī)樣液一般為500至1000微升，故含萃取劑的有機(jī)相正戊醇只需要加 ImL。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種液液萃取-GFAAS法測(cè)定一價(jià)銅含量的方法，其特征在于，包括如下步驟：51. 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的制作:在惰性氣體的保護(hù)下，將CuCl的標(biāo)準(zhǔn)品用飽和KC1溶液定容， 得到lOOOppm的亞銅標(biāo)準(zhǔn)溶液;取亞銅標(biāo)準(zhǔn)溶液與pH 9的甘氨酸-NaOH緩沖溶液按體積比1: 9混合，再向混合溶液中加入等體積的0.06%(w/w) 2，2'-聯(lián)喹啉的正戊醇溶液，混勻，靜置 分層，取上層有機(jī)層用2，2'-聯(lián)喹啉的正戊醇溶液依次稀釋成10、1、0.1、0.01 ppm溶液，取 0.0 lppm溶液lmL上機(jī)，制作工作曲線；52. -價(jià)銅的檢測(cè):將樣品與等體積20%的三氯乙酸混勻，根據(jù)樣品含銅量，再與pH 9的 甘氨酸-NaOH緩沖溶液按不同比例稀釋，再向混合溶液中加入lmL的0.06%(w/w)2，2'-聯(lián)喹 啉的正戊醇溶液，混勻，靜置分層，取上層有機(jī)層，上機(jī)用石墨爐原子吸收法測(cè)定一價(jià)銅含 量； 其中，S2所述樣品為血清時(shí)，取樣品的上清液用緩沖溶液稀釋20倍;S2所述樣品為細(xì)胞 液、細(xì)胞膜液、組織液或尿液時(shí)，取樣品的上清液用緩沖溶液稀釋1倍;S2所述樣品為不含蛋 白的無(wú)機(jī)溶液時(shí)，直接將樣品用緩沖溶液稀釋1倍。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，S2所述樣品為含蛋白的樣品時(shí)，將樣品與 三氯乙酸混勻后離心去蛋白，再取去蛋白后的上清液進(jìn)行后續(xù)步驟。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述離心為1200 rpm離心10min。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，S2所述樣品為細(xì)胞液、細(xì)胞膜液或組織液 時(shí)，另取未去蛋白前的樣品測(cè)定蛋白濃度，以蛋白含量定量一價(jià)銅濃度。5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，S2所述樣品來(lái)自細(xì)胞時(shí)，將樣品進(jìn)行如下 預(yù)處理:培養(yǎng)數(shù)天后的細(xì)胞收集，超聲或冰凍破碎后，分離得到的上清即細(xì)胞液，沉淀下來(lái) 的細(xì)胞膜用適量表面活性劑溶解，再作為樣品進(jìn)行測(cè)定。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，SI、S2所述混勻的方法為旋渦振蕩lmin。7. 據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，S1、S2所述緩沖溶液中的甘氨酸濃度< 0.01mol/L〇8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，S2所述上層有機(jī)層的上機(jī)量為500yL。
【專利摘要】本發(fā)明屬于微量元素檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體公開(kāi)了一種液液萃取-GFAAS法測(cè)定一價(jià)銅含量的方法。本發(fā)明方法包括如下步驟：S1.標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的制作；S2.一價(jià)銅的檢測(cè)：將樣品與等體積20%的三氯乙酸混勻，根據(jù)樣品含銅量，再與pH9的甘氨酸-NaOH緩沖溶液按不同比例稀釋，再向混合溶液中加入1mL的0.06%(w/w)2，2′-聯(lián)喹啉的正戊醇溶液，混勻，靜置分層，取上層有機(jī)層，上機(jī)用石墨爐原子吸收法測(cè)定一價(jià)銅含量。本發(fā)明方法可用于生物樣本痕量一價(jià)銅含量的檢測(cè)，對(duì)探討機(jī)體銅代謝失衡有重要意義。
【IPC分類】G01N21/31
【公開(kāi)號(hào)】CN105527235
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201511010910
【發(fā)明人】張?jiān)? 羅文鴻, 林哲絢, 韓溟, 李慧, 羅紅軍
【申請(qǐng)人】汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院
【公開(kāi)日】2016年4月27日
【申請(qǐng)日】2015年12月30日