一種仿基底膜管結構的神經缺損修復材料的制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及外周神經缺損修復材料仿生制備技術領域，特別涉及仿基底膜管結構的神經缺損修復材料的制備方法。
【背景技術】
[0002]神經(Nerve)是由聚集成束的神經纖維所構成，而神經纖維本身是由神經元的軸突外被雪旺細胞形成的髓鞘包覆而成。其中許多神經纖維聚集成束，外面再由結締組織填充，最終構成外周神經。Sunderland根據(jù)神經損傷的程度將其分為五度，當損傷達四度以上，即神經束遭到嚴重破壞或完全離斷時，很少能自行恢復，必須依靠神經移植或人工修補材料進行治療。周圍神經缺損的修復與重建是當前治療周圍神經損傷領域的一大難題。
[0003]目前在解決治療周圍神經缺損手段，主要以自體神經移植為主。自體神經移植是一種“拆東墻補西墻”的方法，必然造成供體供區(qū)神經部位感覺功能缺失，遺留切口瘢痕，來源有限，難以修復長節(jié)段和特殊部位的周圍神經缺損。因此，科學家一直在探索可以替代自體神經移植的周圍神經缺損修復材料。
[0004]這些材料多構成中空的管狀結構，成為引導再生管，原材料包括天然材料和人工合成材料兩大類。天然材料有自體靜脈、自體骨骼肌、異體或異種神經、藻酸鹽、殼聚糖、膠原等；人工合成材料主要有硅膠、PLA、PGA等。由于靜脈、骨骼肌等天然生物活性材料存在管壁塌陷、再生不良、疤痕組織增生及粘連等問題，且來源均比較有限，不適于大批量生產。人工合成材料主要是制備成中空管狀結構的引導再生管，但這種管缺點主要是滲透性差，無取向性，不利于近端軸突的生長。
[0005]為此，許多研究對神經引導再生管的結構進行了改良。包括采用成孔技術制備管取向的多孔狀神經修復材料，但這些改進并不能真正模擬神經基底膜管的纖維排列，通過前期實驗，我們發(fā)現(xiàn)，基底膜管的纖維結構也是沿著神經長軸方向取向排列的。而接種在取向性薄膜的背根神經節(jié)，軸突生長更具方向性。
[0006]為了更好地模擬天然神經結構，顧曉松等將PLGA(poly (lactic-co-glycolicacid，聚乳酸-羥基乙酸共聚物)絲添加到神經引導再生管內，試圖通過取向排列的PLGA絲引導神經纖維再生。取得了一定效果。但這種結構的修復材料并沒有真正模擬出神經基底膜管結構，如同再生的細胞在鋼絲上爬行，理想的周圍神經缺損替代材料應具有與正常神經相似的物理和生化特性，包括(1)在材料組成方面，要有最佳的生物相容性，利于細胞粘附、增殖和分化，同時要求在人體內可降解；(2)在空間結構方面，和神經基底膜管一致，引導雪旺細胞的迀移和取向排列，進而引導軸突沿修復材料長軸取向生長至神經的遠側斷端，從而提高神經再生效能。

【發(fā)明內容】

[0007]本發(fā)明所要解決的技術問題是克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種仿神經基底膜管結構的神經缺損修復材料的制備方法。通過選用高分子材料和天然來源性材料基質為主要原料，采用電紡絲技術和成孔技術，制備具有仿纖維基底膜管結構的神經缺損修復材料。該修復材料具有高比表面積，與天然神經纖維基底膜管類似，能夠添加多種促神經生長物質，具有良好的生物相容性，便于再生神經纖維沿修復材料長軸方向生長，應用前景廣泛。
[0008]本發(fā)明所要解決的技術問題是通過以下技術途徑來實現(xiàn)的:
[0009]—種仿基底膜管結構的神經缺損修復材料的制備方法，包括以下步驟:
[0010]1)室溫(22-28°C均可)條件下，將高分子材料與天然來源性材料加入有機溶劑，配制成電紡絲原液。
[0011]2)制備微管模型。
[0012]3)將制備好的電紡絲原液分層噴涂至微管模型的底層和表層，制備具有微管結構的薄膜，室溫干燥后，將具有微管結構的薄膜，垂直于取向排列方向(即垂直于微管模型方向)，采取滾動卷曲方式，形成管狀結構。
[0013]4)去除管狀結構中的微管模型。
[0014]5)三蒸水漂洗并冷凍干燥，獲得最終成型的神經缺損修復材料。
[0015]進一步地，步驟1)配制成的電紡絲原液的質量百分濃度為4%?16%，即高分子材料與天然來源性材料的總重量占電紡絲原液總重量的百分數(shù)。高分子材料與天然來源性材料的摩爾比例可以從9:1到2:1，根據(jù)不同材料，選擇上也會有差異。
[0016]進一步地，步驟1)中，所述高分子材料選自聚己內酯、聚己內酯/左旋聚乳酸、聚乳酸-羥基乙酸共聚物、左旋聚乳酸、聚乙烯醇、蠶絲蛋白/聚環(huán)氧乙烷、聚乳酸、聚內消旋乳酸等中的一種或多種，以獲取不同的力學強度與材料特性。
[0017]所述天然來源性材料包括細胞外基質干粉、膠原、明膠、NGF、殼聚糖、甲殼素等。
[0018]所述有機溶劑選自二氯甲烷、三氯甲烷、六氟異丙醇、四氟乙烯、碳酸二甲酯、丙酮、乙酸、二甲基亞砜、四氫呋喃、二甲基甲酰胺等中的一種或多種，以獲取單根纖維表面不同的孔隙。
[0019]進一步地，步驟2)中，所述微管模型包括可溶型微管模型和不可溶型微管模型。
[0020]其中:
[0021]可溶型微管模型:原料選取可溶于水的有機材料，如PVA、蠶絲蛋白/聚環(huán)氧乙烷、聚乙二醇、聚內消旋乳酸等。依材料熔點不同選取特定溫度，熔融狀態(tài)下，選取不同直徑的針頭，鑄造平行排列的微管模型，依照需求不同決定微管直徑與排列間距。
[0022]不可溶型微管模型:采用市場上的絲線類，如尼龍絲、金屬絲如(銅絲、鎢絲等)、聚合纖維絲等。決定微管排列間距后，固定成型。
[0023]進一步地，步驟3)中，薄膜的厚度可依照最終神經修補導管的直徑調整。微管模型也可以附加多層(例如在采用收集滾軸制備具有微管結構的薄膜時，可先噴涂一層電紡絲原液后，附加上微管模型，再噴涂上電紡絲原液，可以得到一層包含微管模型的薄膜，此時，如果再附加一層微管模型，再噴涂電紡絲原液，新的薄膜中，就包含兩層微管模型。)。微管模型可復合1?3層薄膜，薄膜總厚度達0.05mm?1_。
[0024]進一步地，步驟3)中，可采用收集滾軸或帶電金屬梳等電紡絲常見收集裝置將制備好的電紡絲原液分層噴涂至微管模型的底層和表層，采用收集滾軸制備具有微管結構的薄膜的步驟包括:
[0025]將收集滾軸調速至低轉速，調整電壓，針頭前方形成泰勒錐，使電紡絲均勻噴出，形成無規(guī)則的底膜，膜厚度約0.1mm。之后再將收集滾軸調整成高轉速，收集厚度約為
0.1mm的高取向薄膜。固定微管模型，再次噴涂電紡絲，厚度約0.1mm，連帶招箔，小心取下。所述收集滾軸定速可調速至0.5?9m/min(線速度)，5?15kV正電壓加于針頭(粗細)，-2?-12kV電壓加于收集器，推注速度:10?40 μ L/min,噴射針頭到收集器之間的距離為5?20cm，溫度:-20?40°C (低溫可造成當根纖維表面多孔結構)，濕度:40%以下。
[0026]進一步地，步驟5)中，所述微管模型為可溶型微管模型時，將管狀結構放入水中，溫和震蕩3?12小時，去除可溶于水的微管模型；所述微管模型為不可溶型微管模型時，在顯微鏡下，直接抽除微管模型。
[0027]進一步地，上述方法還包括:將步驟5)獲得的神經缺損修復材料真空包裝，40?250萬拉德γ射線輻照滅菌，4°C保存。
[0028]進一步地，步驟3)中優(yōu)選室溫干燥4?24小時，步驟5)中優(yōu)選冷凍干燥12?48小時。
[0029]本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有如下優(yōu)點和有益效果:
[0030]本發(fā)明設計了一種新的制備方法，可以使取向性的靜電紡絲沿著神經導管內壁平行排列，制備成取向性神經缺損修補材料，與其它神經導管不同，該材料橫截面呈多孔微小管狀結構，管壁纖維排列高度取向，方向與微管走行方向一致，并使其具有高比表面積，同時該支架具有高滲透性，電紡絲原料可以方便添加不同促神經生長物質。
[0031]這種3D結構的修補材料，能夠通過其內部的纖維通道和有取向性的纖維通道壁引導軸突定向生長。本材料最大的好處取向性結構引導細胞生長并且沒有抑制細胞的滲透。這項新技術使神經導管管壁厚減小，為組織生長提供更大的空間。這種方法制備的修補材料密切模仿了脫細胞神經的結構，但其較大直徑的微通道可以更好地促進了神經軸突的定向生長和神經細胞的黏附和生長。
【附圖說明】
[0032]圖1為單層微管道模型建立與電紡絲薄膜的附加方式，其中(a)為平面結構示意圖；(b)為立體結構示意圖。
[0033]圖2為多層微管道模型建立與電紡絲薄膜的附加方式，其中(a)為平面結構示意圖；(b)為立體結構示意圖。