專利名稱：抗β-淀粉樣肽抗體及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗P -淀粉樣肽抗體。本發(fā)明還涉及此類抗體在治療 和/或預(yù)防疾病，例如阿爾茨海默氏病中的用途。
關(guān)于聯(lián)邦政府資助的研究或開發(fā)的聲明
不適用。
背景技術(shù)：
阿爾茨海默氏病(AD)是退行性腦病變，其臨床特征在于進(jìn)行性 的記憶缺損、混亂、逐漸身體惡化，以及最終死亡。全球大約一千五 百萬人患有阿爾茨海默氏病，預(yù)期該數(shù)目將隨著人類壽命的延長而急 劇地增加。組織學(xué)上，該疾病的特征在于主要出現(xiàn)在聯(lián)絡(luò)皮層、邊緣 系統(tǒng)和基底神經(jīng)節(jié)中的神經(jīng)炎性斑塊(neuritic plaque)。這些斑塊 的主要成分是P-淀粉樣肽(AP)，該肽是P淀粉樣前體蛋白(PAPP 或APP)的切割產(chǎn)物。APP是I型跨膜糖蛋白，含有一個大的異位N 端域、 一個跨膜域和一個小的胞質(zhì)C端尾。染色體21上的APP單基
因的轉(zhuǎn)錄物的可變拼接導(dǎo)致具有不同氨基酸數(shù)目的幾種同種型。
Ap似乎在阿爾茨海默氏病的神經(jīng)病理學(xué)上具有主要作用。該疾 病的家族形式已經(jīng)與APP及早老素(presenilin)基因中的突變聯(lián)系 起來(Tanzi等，1996， Neurobiol. Dis. 3: 159-168; Hardy， 1996，
Ann. Med. 28: 255-258)。這些基因中的疾病相關(guān)突變導(dǎo)致A p的 42氨基酸形式一一淀粉樣蛋白斑中發(fā)現(xiàn)的主要形式一一的產(chǎn)生增 加。而且，用人AP免疫過表達(dá)APP的疾病相關(guān)突變形式的轉(zhuǎn)基因小 鼠，減輕了斑塊負(fù)擔(dān)及相關(guān)病理(Schenk等，1999， Nature, 400: 173-177; WO 99/27944)，并且外周施用抗A P抗體也降低腦中的斑 塊負(fù)擔(dān)(Bard等，2000， Nature Medicine 6(8): 916-919; WO 2004/032868; WO 00/72880)。
已經(jīng)有報道，F(xiàn)c介導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞和/或巨噬細(xì)胞的吞噬作用對 于體內(nèi)斑塊的清除過程是重要的。Bard等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 2023-2028 (2003)。然而，也有報道，在通過免疫療法體 內(nèi)清除P淀粉樣肽中涉及非Fc介導(dǎo)的機制。Bacskai等，J. Neurosci. 22: 7873—7878 (2002); Das等，J. Neurosci. 23: 8532-8538 (2003)。
因此，抗體療法提供了一種有希望的治療和預(yù)防阿爾茨海默氏 病的方法。然而，使用包括A P 1-42的疫苗進(jìn)行的人類臨床試驗由 于一些患者中的腦膜腦炎而被暫停。Orgogozo等，Neruology": 7-8 (2003); Ferrer等Brain Pathol. 14: 11-20 (2004)。已經(jīng)報道， 在表現(xiàn)出與人AD腦中觀察到的相似的年齡相關(guān)性淀粉樣蛋白斑發(fā)生 以及神經(jīng)變性和腦淀粉樣血管病(CAA)的轉(zhuǎn)基因小鼠中，使用N端特 異的抗A p抗體實施被動免疫，導(dǎo)致大部分彌散的淀粉樣蛋白的顯著 減少，但誘導(dǎo)腦孩i出血頻率增加。Pfeifer等，Science 298: 1379 (2002)。已經(jīng)提示，在APP轉(zhuǎn)基因小鼠中，由抗P淀粉樣肽抗體的 被動免疫引起的腦淀粉樣血管病(CAA)相關(guān)性微出血的加劇，依賴于 抗體對P淀粉樣肽的沉積形式的識別。Racke等，J. Neurosci. 25: 629-636 (2005)。為了減少發(fā)生炎癥的風(fēng)險，已經(jīng)提議用缺乏Fc區(qū) 的抗淀粉樣蛋白沉積物的肽成分的抗體被動免疫。WO 03/086310。 仍然需要具有改善的效果和安全譜并且適用于人類患者的、針對A P 的抗體和其它免疫治療劑。
在本申請中引用了各種出版物(包括專利和專利申請)。這些出
版物的公開內(nèi)容特此完整地并入作為參考。
發(fā)明概述
在此公開的本發(fā)明涉及與AP肽C端結(jié)合的抗體和多肽。一方面，
本發(fā)明提供與APh。、A^—42和APH3結(jié)合的抗體或多肽，其中所述
抗體或多肽以比其結(jié)合A p卜42和A & w的親和力更高的親和力與A P h。結(jié)合，而且其中所述抗體或多肽與APh。上包括第25-34和40位 氨基酸的表位結(jié)合。 一些實施方案中，抗體與Ap卜4。結(jié)合的親和力是 其與AP^和/或APw3結(jié)合的親和力的至少大約40倍。 一些實施方 案中，所述抗體不是抗體2294。
另一方面，本發(fā)明提供抗體6G (可以與術(shù)語"6G"互換)。6G 的重鏈和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列顯示在

圖1中?？贵w6G的互補決 定區(qū)(CDR)部分(包括Chothia和Kabat CDR)也顯示在圖1中。
另一方面，本發(fā)明還提供具有表3所示氨基酸序列的6G的抗體 變體。
另一方面，本發(fā)明提供包含抗體6G或表3所示的其變體的片段 或區(qū)域的抗體。 一個實施方案中，所述片段是抗體6G的輕鏈。另一 實施方案中，所述片段是抗體6G的重鏈。再一實施方案中，所述片 段包含來自抗體6G輕鏈和/或重鏈的一個或多個可變區(qū)。再一實施方 案中，所述片段包含來自圖1所示輕鏈和/或重鏈的一個或多個可變 區(qū)。再一實施方案中，所述片段包含來自抗體6G輕鏈和/或重鏈的一 個或多個CDR。
另一方面，本發(fā)明提供包含以下項目中的任意一個或多個的多 肽(其可以是或者可以不是抗體)a)抗體6G或其顯示在表3中的 變體的一個或多個CDR; b)來自抗體6G或其顯示在表3中的變體的 重鏈的CDR H3; c)來自抗體6G或其顯示在表3中的變體的輕鏈的 CDRL3;d)來自抗體6G或其顯示在表3中的變體的輕鏈的3個CDR; e)來自抗體6G或其顯示在表3中的變體的重鏈的3個CDR; f)來 自抗體6G或其顯示在表3中的變體的輕鏈的3個CDR以及來自抗體
6G或其顯示在表3中的變體的重鏈的3個CDR。本發(fā)明還提供包含 以下項目中的任意一個或多個的多肽(其可以是或者可以不是抗體) a)衍生自抗體6G或其顯示在表3中的變體的一個或多個(一個、兩 個、三個、四個、五個或六個)CDR; b)衍生自抗體6G重鏈CDR H3 的CDR;和/或c)衍生自抗體6G輕鏈CDRL3的CDR。 一些實施方案 中，所述CDR是圖1中所示的CDR。 一些實施方案中，所述衍生自抗 體6G或其顯示在表3中的變體的一個或多個CDR與6G或其變體的 至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個或至少六個 CDR有至少大約85。/。、至少大約86%、至少大約87%、至少大約88 %、至少大約89%、至少大約90%、至少大約91%、至少大約92 %、至少大約93%、至少大約94%、至少大約95%、至少大約96 %、至少大約97%、至少大約98%或至少大約99%的同一性。
一些實施方案中，所述CDR是Kabat CDR。 一個實施方案中，所 述CDR是Chothia CDR。其它實施方案中，所述CDR是Kabat及ChothU CDR的組合(也稱作"組合CDR"或"擴(kuò)展CDR")。換言之，對于包 含一個以上CDR的任何給定的實施方案，這些CDR可以是選自Kabat、 Chothia和/或組合CDR的任何CDR。
一些實施方案中，本發(fā)明抗體是人抗體。其它實施方案中，本 發(fā)明抗體是人源化抗體。 一些實施方案中，抗體是單克隆的。 一些實 施方案中，抗體(或多肽)是分離的。 一些實施方案中，抗體(或多肽) 是實質(zhì)上純的。
抗體重鏈恒定區(qū)可以來自任何類型的恒定區(qū)，例如IgG、 IgM、 IgD、 IgA和IgE;以及任何同種型，例如，IgGl、 IgG2、 IgG3和IgG4。
一些實施方案中，本文所述抗體或多肽具有被受損的效應(yīng)子功 能。 一些實施方案中，抗體或多肽包含具有受損的效應(yīng)子功能的重鏈 恒定區(qū)，其中所述重鏈恒定區(qū)包含F(xiàn)c區(qū)。 一些實施方案中，F(xiàn)c區(qū)中 的N-糖基化被去除。 一些實施方案中，F(xiàn)c區(qū)在N-糖基化識別序列中 包含突變，由此該抗體或多肽的Fc區(qū)不發(fā)生N-糖基化。 一些實施方 案中，F(xiàn)c區(qū)被PEG化。 一些實施方案中，抗體或多肽的重鏈恒定區(qū)
是含有以下突變的人重鏈IgG2a恒定區(qū)A330P331至S330S331 (氨 基酸編號參照野生型IgG2序列進(jìn)行)。 一些實施方案中，抗體或多 肽包含含有如下突變的 IgG4恒定區(qū)E233F234L235至 P233V234A235。這些氨基酸位置以Kabat編號方式為基礎(chǔ)。
另一方面，本發(fā)明提供包含編碼抗體6G或其顯示在表3中的變 體的片段或區(qū)域的多核苷酸的多核苷酸(其可以是分離的)。一個實施 方案中，所述片段是抗體6G的輕鏈。另一實施方案中，所述片段是 抗體6G的重鏈。再一實施方案中，所述片段含有來自抗體6G的輕鏈 和/或重鏈的一個或多個可變區(qū)。再一實施方案中，所述片段包含來 自抗體6G的輕鏈和/或重鏈的一個或多個(即， 一個、兩個、三個、 四個、五個、六個)互補決定區(qū)(CDR)。
另一方面，本發(fā)明是包含編碼抗體6G或其在表3中所示的變體 的多核苷酸的多核苷酸(其可以是分離的)。 一些實施方案中，所述多 核苷酸包含SEQ ID NO: 9和SEQ ID NO: IO中所示多核苷酸之一或 兩者。
另一方面，本發(fā)明提供編碼本文所述任何抗體(包括抗體片段) 或多肽的多核香酸。
另一方面，本發(fā)明提供包含本文所述任何多核苷酸的載體(包括表達(dá)和克隆載體)和宿主細(xì)胞。
另一方面，本發(fā)明是包含編碼本文所述任何抗體的多核普酸的 宿主細(xì)胞。
另一方面，本發(fā)明是APw。與抗體6G或其在表3中顯示的變體 結(jié)合的復(fù)合物。
另 一方面，本發(fā)明是A P w。與本文所述任何抗體或多肽結(jié)合的復(fù) 合物。
另一方面，本發(fā)明是包含有效量的任何本文所述抗體、多肽或 多核苷酸以及藥物可接受賦形劑的藥物組合物。 一些實施方案中，所 述抗體或多肽包含抗體6G的一個或多個CDR。
另一方面，本發(fā)明是制備抗體6G的方法，包括在允許抗體6G
產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞或其后代，其中所述宿主細(xì)胞包含編碼抗
體6G的表達(dá)載體；和，在一些實施方案中，純化該抗體6G。 一些實 施方案中，表達(dá)載體包含SEQ ID NO: 9和SEQ ID NO: IO中所示多 核苷酸序列之一或兩者。
另一方面，本發(fā)明提供通過如下方式制備本文所述任何抗體或 多肽的方法在適宜細(xì)胞中表達(dá)編碼所述抗體(其可以分開表達(dá)為單 獨的輕鏈或重鏈，或者從一個載體既表達(dá)輕鏈也表達(dá)重鏈)或多肽的 一種或多種多核苷酸， 一般地隨后回收和/或分離目的抗體或多肽。
本發(fā)明也提供預(yù)防、治療、抑制或延遲阿爾茨海默氏病及與改 變的Ap或P APP表達(dá)或者AP肽的累積有關(guān)的其它疾病發(fā)展的方法， 其中所述其它疾病有例如Down氏綜合癥、帕金森病、多發(fā)性腦梗塞 癡呆、輕度i人知缺損、腦淀粉樣血管病、抑郁、Creutzfeldt-Jakob 病、伴有Lewy小體的癡呆和AIDS。該方法包括給個體施用有效劑量 的包含本發(fā)明抗體、多肽或多核苷酸的藥物組合物。
本發(fā)明還提供在個體中延遲和阿爾茨海默氏病或與AP肽累積 有關(guān)的其它疾病相關(guān)的癥狀發(fā)展的方法，包括給個體施用有效劑量的 包含本發(fā)明抗體、多肽或多核苷酸的藥物組合物。
本發(fā)明還提供抑制個體中淀粉樣蛋白斑和/或淀粉樣蛋白累積 的形成的方法，包括給個體施用有效劑量的包含本發(fā)明抗體、多肽或 多核苷酸的藥物組合物。 一些實施方案中，淀粉樣蛋白斑存在于個體 的腦(腦組織)中。 一些實施方案中，淀粉樣蛋白斑存在于腦血管結(jié)構(gòu) 中。其它實施方案中，淀粉樣蛋白累積出現(xiàn)在循環(huán)系統(tǒng)中。
本發(fā)明還提供在個體中減少淀粉樣蛋白斑和/或淀粉樣蛋白累 積的方法，包括給個體施用有效劑量的包含本發(fā)明抗體、多肽或多核 苷酸的藥物組合物。 一些實施方案中，淀粉樣蛋白斑存在于個體的腦 (腦組織)中。 一些實施方案中，淀粉樣蛋白斑存在于腦血管結(jié)構(gòu)中。 其它實施方案中，淀粉樣蛋白累積出現(xiàn)在循環(huán)系統(tǒng)中。
本發(fā)明還提供在個體中除去或清除淀粉樣蛋白斑和/或淀粉樣 蛋白累積的方法，包括給個體施用有效劑量的包含本發(fā)明抗體、多肽
或多核苷酸的藥物組合物。 一些實施方案中，淀粉樣蛋白斑存在于個 體的腦(腦組織)中。 一些實施方案中，淀粉樣蛋白斑存在于腦血管結(jié) 構(gòu)中。其它實施方案中，淀粉樣蛋白累積出現(xiàn)在循環(huán)系統(tǒng)中。
此外，本發(fā)明還提供抑制AP肽在組織中累積的方法，包括使所 述組織與本發(fā)明抗體或多肽接觸。
本發(fā)明也提供在個體中減少AP肽(例如，可溶性的、寡聚體的 和沉積的形式)的方法，包括給個體施用有效量的本發(fā)明抗體、多肽 或多核苷酸。 一些實施方案中，抑制和/或降低腦中AP肽的累積。 一些實施方案中，抑制和/或降低AP肽的毒性作用。因此，本發(fā)明 方法可以用于治療其中存在或懷疑存在AP肽累積的任何疾病，例 如，阿爾茨海默氏病、Down氏綜合癥、帕金森病、多發(fā)性腦梗塞癡 呆、輕度認(rèn)知缺損、腦淀粉樣血管病、抑郁、Creutzfeldt-Jakob病 或伴有Lewy小體的癡呆。
本發(fā)明還提供在個體中改善認(rèn)知功能或逆轉(zhuǎn)與AP淀粉樣蛋白 沉積相關(guān)疾病(如，阿爾茨海默氏病)有關(guān)的認(rèn)知衰退的方法，包括給 個體施用有效劑量的包含本發(fā)明抗體、多肽或多核苷酸的藥物組合 物。
本文所述任何抗體、多肽或多核苷酸均可以用于本發(fā)明的方法。 一些實施方案中，所述抗體是抗體6G。
本發(fā)明抗體和多肽還可以用于檢測、診斷和監(jiān)測阿爾茨海默氏 病及與改變的AP或P APP表達(dá)有關(guān)的其它疾病，例如，Down氏綜合 癥和AIDS。該方法包括使懷疑具有改變的AP或PAPP表達(dá)的患者的 樣本與本發(fā)明抗體接觸，以及確定AP或P APP的水平是否不同于對 照或比較樣本的水平。 一些實施方案中，在給予抗AP抗體之前和之 后測量血清Ap水平；并且評估血清AP水平的任何增加。
本發(fā)明任何抗體或多肽的施用都可以通過本領(lǐng)域已知的任何方 式進(jìn)行，包括靜脈內(nèi)、皮下、通過吸入、動脈內(nèi)、肌內(nèi)、心內(nèi)、心 室內(nèi)、胃腸外、鞘內(nèi)、以及腹膜內(nèi)。施用可以是全身性的，例如，靜 脈內(nèi)，或局部的。 一般地，這也適用于本發(fā)明的多肽和多核苷酸。
另一方面，本發(fā)明提供包含本文所述任何一種或多種組合物的 藥盒及組合物。這些藥盒通常在適宜的包裝中并提供了適當(dāng)?shù)恼f明， 可以用于本文所述任何方法中。
附圖簡述
圖1顯示抗體6G的重鏈可變區(qū)氨基酸序列(SEQ ID NO: 1)和輕 鏈可變區(qū)氨基酸序列(SEQ ID NO: 2) 。 Kabat CDR以粗體顯示，Chothia CDR以下劃線顯示。重鏈和輕鏈可變區(qū)的氨基酸殘基順序地編號。
圖2顯示通過ELISA對抗體6G進(jìn)行的表位作圖。A0肽(l-16、 1一28、 17-40、 17-42、 22-35、 28—40、 28-42、 1-38、 1-40、 1-42、 1-43、和33-40)固定于ELISA板上。單克隆抗體6G (20 nM)與各種 固定的肽溫育1小時。使用HRP綴合的山羊抗人k二抗測量與固定的 AP肽結(jié)合的抗體6G。
圖3顯示通過ELISA對抗體6G進(jìn)行的表位作圖。將各種A P肽(序 列從上到下被指定為SEQ ID NO: 18-29)固定于ELISA板上。單克隆 抗體6G與各種固定的肽溫育1小時。使用HRP綴合的山羊抗人k二 抗測量與固定的A P肽結(jié)合的抗體6G。"NB"指未檢測到結(jié)合。
圖4是顯示AP上與抗體6G結(jié)合的表位的示意圖。顯示了 在淀粉樣前體蛋白(APP)及APP的細(xì)胞膜部分中的相對位置。"CT99" 指APP的C端99個氨基酸。所示氨基酸序列被指定為SEQ ID NO: 30。
圖5是顯示抗A P卜16的單克隆抗體(m2324)和抗體6G對APP表達(dá) 細(xì)胞進(jìn)行免疫染色的照片。頂圖顯示在細(xì)胞與m2324或6G (各5 n g/ml)溫育以及使用Cy3綴合的山羊抗小鼠或抗人二抗檢測結(jié)合后熒 光顯微鏡下觀察到的細(xì)胞。底圖顯示顯微鏡下觀察到的細(xì)胞。
圖6顯示通過ELISA對抗體2294和6G進(jìn)行的表位作圖。將各 種AP肽(序列從上到下為SEQ ID NO: 18-26、 31及27-29)固定于 ELISA板上?？贵w與各種固定的肽溫育1小時。使用HRP綴合的山羊 抗人k 二抗測量與固定的A P肽結(jié)合的抗體6G。使用山羊抗小鼠抗體 測量與固定的AP肽結(jié)合的抗體2294,其中所述山羊抗小鼠抗體能
夠既結(jié)合重鏈也結(jié)合輕鏈，是綴合了 HRP的二抗。"NB"指未檢測 到結(jié)合。在"2294"和"6G，，下的列中的數(shù)字表示450nm的吸收值。
發(fā)明詳述
此處公開的本發(fā)明提供與A P的C端結(jié)合的抗體和多肽。本發(fā)明 還提供編碼這些抗體和/或多肽的多核苦酸。本發(fā)明還提供制備和使 用這些抗體和多肽的方法。
本發(fā)明還提供通過給個體施用有效量的包含本文所述抗體、多 肽或編碼本文所述抗體或多肽的多核苷酸的藥物組合物，治療或預(yù)防 個體中與p-淀粉樣蛋白沉積有關(guān)的疾病的方法，所述疾病有例如， 阿爾茨海默氏病、Down氏綜合癥、多發(fā)性腦梗塞癡呆、輕度認(rèn)知缺 損、腦淀粉樣血管病、抑郁、Creutzfeldt-Jakob病及伴有Lewy小 體的癡呆。
一般技術(shù)
除非另有說明，否則本發(fā)明的實施將利用分子生物學(xué)(包括重組 技術(shù))、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，這 些技術(shù)屬于本領(lǐng)域技術(shù)的范圍。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中有全面的說明，例 如，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第二版(Sambrook 等，1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait編，1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J, E, Cellis, 編， 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney， 編， 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather andP. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cel 1 and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, 和D. G. Newell編，1993-1998) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir和C. C. Blackwell，編)；Gene Transfer Vectors
For Mammalian Cells (J. M. Miller和M, P. Calos編，1987); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel等，編，1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction (Mullis等編，1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan等，編，1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C. A. Janeway和P. Travers， 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A practical approach (D. Catty. 編，I壯Press, 1988-1989); Monoclonal antiboies: a practical approach (P. Shepherd和C. Dean編，Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti和 J. D. Capra編，Harwood Academic Publishers, 1995)。
定義
"抗體"是能夠通過至少一個抗原識別位點特異結(jié)合靶(例如 糖、多核苷酸、脂質(zhì)、多肽等)的免疫球蛋白分子，其中所述抗原識 別位點位于該免疫球蛋白分子的可變區(qū)中。本文中，該術(shù)語不僅包括 完整的多克隆或單克隆抗體，也包括其片段(例如Fab， Fab'， F(ab，)2， Fv)、單鏈(ScFv)、其突變體、包含抗體部分的融合蛋白、以及包含 抗原識別位點的該免疫球蛋白分子的任何其它經(jīng)修飾的構(gòu)型
(configuration )。本發(fā)明抗體包括任何類型的抗體，例如IgG, IgA 或IgM (或其亞型)，該抗體不必是任何特定類型的。根據(jù)抗體重鏈 恒定區(qū)的氨基酸序列，免疫球蛋白可以劃分為不同的類型。有五大類 的免疫球蛋白IgA, IgD， IgE， IgG和IgM，其中幾種可以進(jìn)一步 細(xì)分成亞型(同種型)，例如，IgGl， IgG2， IgG3， IgG4， IgAl和IgA2。 對應(yīng)于不同類型的免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū)被分別稱作ct、 5、 e、
Y和H。不同類型的免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型是熟知的。 本文中，"單克隆抗體"指從基本上均質(zhì)的抗體群體(即，構(gòu)
成該群體的各個抗體，除了可能微量存在的可能的天然突變外，都是 相同的)獲得的抗體。單克隆抗體是高度特異的，指向單個抗原位點。 而且，與典型地包括針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體 制備物不同，每個單克隆抗體針對抗原上的單個決定簇。修飾詞"單 克隆"指的是抗體獲自基本上均質(zhì)的抗體群的該特征，而不能理解為 需要通過任何特定的方法來產(chǎn)生該抗體。例如，根據(jù)本發(fā)明使用的單
克隆抗體可以通過Kohler和Milstein， 1975， Nature 256: 495最 先描述的雜交瘤方法制備，或者可以通過諸如美國專利4,816,567 描述的重組DNA方法制備。單克隆抗體也可以從使用例如McCafferty 等，1990， Nature, 348: 552-554中描述的技術(shù)制備的噬菌體文庫 分離。
本文中，"人源化"抗體指含有最少的源于非人免疫球蛋白的 序列的非人(例如鼠)抗體形式，該抗體形式是特異的嵌合免疫球蛋 白、免疫球蛋白鏈、或其片段(例如Fv, Fab， Fab， ， F (ab， )2或抗 體的其它抗原結(jié)合亞序列)。人源化抗體主要是人免疫球蛋白(受體抗 體)，在該蛋白中來自該受體的互補決定區(qū)(CDR)的殘基被來自具有 期望特異性、親和性和能力的、非人物種(供體抗體)例如小鼠、大鼠 或兔的CDR的殘基替換。一些情況下，人免疫球蛋白的Fv構(gòu)架區(qū)(FR) 殘基被相應(yīng)的非人殘基替換。而且，人源化抗體可以包含既不存在于 受體抗體也不存在于引入的CDR或構(gòu)架序列中但被包括在人源化抗 體中以進(jìn)一步改善和優(yōu)化抗體的性能的殘基。 一般地，人源化抗體包 含至少一個，以及典型地兩個，可變區(qū)的基本上所有部分，其中全部 或基本上全部的CDR區(qū)對應(yīng)于非人免疫球蛋白的CDR區(qū)，而全部或 基本上全部的FR區(qū)是具有人免疫球蛋白共有序列的那些FR區(qū)。最佳 地，人源化抗體還將包含免疫球蛋白(典型地，人免疫球蛋白)的恒 定區(qū)或域(Fc)的至少一部分。抗體可以具有按照W0 99/58572所述 修飾的Fc區(qū)。其它人源化抗體形式具有相對于原始抗體發(fā)生了改變 的一個或多個CDR(—個、兩個、三個、四個、五個、六個)，這些 CDR也被稱作"衍生自"原始抗體的一個或多個CDR的一個或多個
CDR。
本文中，"人抗體"指具有與人產(chǎn)生的抗體的氨基酸序列相對 應(yīng)的氨基酸序列的抗體，和/或使用本領(lǐng)域已知的或本文所述的制備 人抗體的任何技術(shù)制備的抗體。人抗體的該定義包括含有至少 一條人 重鏈多肽或至少一條人輕鏈多肽的抗體。一個這樣的實例是包含鼠輕 鏈和人重鏈多肽的抗體。人抗體可以使用本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)制 備。 一個實施方案中，從噬菌體文庫選擇人抗體，其中該噬菌體文庫 表達(dá)人抗體(Vaughan等1996， Nature Biotechnology, 14: 309-314'， Sheets等，1998， PNAS, (USA) 95: 6157-6162; Hoogenboom和Winter: 1991， J. Mol. Biol. 227: 381; Marks等，1991， J. Mol. Biol. 222: 581)。人抗體也可以通過將人免疫球蛋白基因座引入轉(zhuǎn)基因動物，例 如，內(nèi)源性免疫球蛋白基因已經(jīng)部分或完全被失活的小鼠，而制備。 該方法描述在美國專利5， 545， 807; 5, 545, 806; 5, 569, 825; 5,625, 126; 5， 633， 425和5， 661， 016中?；蛘?，人抗體可以通過佳: 產(chǎn)生抗靶抗原的抗體的人B淋巴細(xì)胞(該B淋巴細(xì)胞可以從個體回收 或者可以已經(jīng)在體外免疫)永生化而制備。見例如，Cole等， Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss， p. 77 (1985); Boerner等，1991， J. Immunol. 147 (1) 86-95;和美國專 利5， 750， 373。
本文中，術(shù)語"6G，，和"抗體6G"可互換使用，指具有SEQ ID NO: 11所示重鏈氨基酸序列和SEQ ID NO: 12所示輕鏈氨基酸序列 的抗體。圖1中顯示了重鏈和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列。圖1中圖解 顯示了抗體6G的CDR部分(包括Chothia和Kabat CDR)。編碼重鏈 和輕鏈的多核苷酸顯示在SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 14中。6G 的特征在實施例中描述。
術(shù)語"多肽"、"寡肽"、"肽"和"蛋白質(zhì)"在本文中可互 換使用，指任何長度的氨基酸聚合物。該聚合物可以是直鏈的或分支 的，它可以包含修飾的氨基酸，并且可以被非氨基酸中斷。該術(shù)語也 包括已經(jīng)天然地或通過干預(yù)的方式被修飾的氨基酸聚合物；所述修飾
有例如，二硫鍵形成、糖基化、脂質(zhì)化、乙酰化、磷酸化、或任何其 它操作或修飾，例如與標(biāo)記成分綴合。該定義也包括例如，含有一個 或多個氨基酸類似物(包括例如，非天然的氨基酸等)以及本領(lǐng)域已知 的其它修飾的多肽?？梢岳斫?，由于本發(fā)明多肽是以抗體為基礎(chǔ)的， 故該多肽可以是單鏈形式或連接在一起的多條鏈的形式。
"多核苷酸"或"核酸"在本文中可互換使用，指任何長度的
核苷酸聚合物，包括DNA和RNA。核苷酸可以是脫氧核糖核普酸、核 糖核普酸、修飾的核苷酸或堿基，和/或它們的類似物，或者是可以 通過DNA或RNA聚合酶摻入聚合物中的任何底物。多核苷酸可以包 含修飾的核苷酸，例如，甲基化的核苷酸及它們的類似物。如果存在 修飾的話，對核苷酸結(jié)構(gòu)的修飾可以在聚合物組裝之前或之后發(fā)生。 核苷酸序列可以被非核苷酸成分中斷。多核苷酸可以在聚合之后被進(jìn) 一步修飾，例如，與標(biāo)記成分綴合。其它類型的修飾包括，例如，"帶 帽"、將一個或多個天然存在的核苷酸替換成類似物、核苷酸間的修 飾，例如，不帶電荷的鍵接(例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、 phosphoamidates、 cabamates等)、帶電荷的鍵接(例如，硫代磷酸 酯、二硫代磷酸酯等)、含有吊掛部分例如蛋白質(zhì)(例如，核酸酶、毒 素、抗體、信號肽、聚-L-賴氨酸等)、具有嵌入劑(例如，吖啶、補 骨脂素等)、含有螯合劑(例如，金屬、放射性金屬、硼、氧化金屬等)、 含有烷化劑、具有修飾的鍵接(例如，ot異頭核酸等)，以及這些多核 普酸的未修飾形式。而且，任何通常存在于糖中的羥基基團(tuán)均可以被 置換為例如膦酸基團(tuán)、磷酸基團(tuán)，被標(biāo)準(zhǔn)保護(hù)基保護(hù)、或被活化以預(yù) 備與另外核苷酸的另外連接、或者可以綴合至固相支持物上。5，和 3，端0H可以被磷酸化或者替代為胺或具有1至20個碳原子的有機
封端基團(tuán)部分。其它羥基也可以被衍生化為標(biāo)準(zhǔn)的保護(hù)基。多核苷酸 也可以含有本領(lǐng)域通常已知的核糖或脫氧核糖的糖的類似形式，包括
例如，2， -0-甲基-、2， -0-烯丙基、2，-氟-或2，-疊氮-核糖、碳
環(huán)糖類似物、ot-異頭糖、差向異構(gòu)糖例如阿拉伯糖、木糖類或來蘇
糖類、吡喃糖類、呋喃糖類、景天庚酮糖類、無環(huán)類似物及脫堿基核
苷類似物例如甲基核苷?？梢詫⒁粋€或多個磷酸二酯鍵替換成備選的
連接基團(tuán)。這些備選連接基團(tuán)包括，但不限于，其中磷酸酯被P(O)S ("硫代酯")、P(S)S ( "二硫代酯")、(0)NR2 ("酰胺化物")、 P(0)R、 P(0)0R， 、 C0或CH2( "fo函cetal")替代的實施方案，其 中每一個R或R，均獨立地是H或是取代的或未取代的烷基(l-20C) (任選地含有醚(-0-)鍵)、芳基、烯基、環(huán)烷基、環(huán)烯基或araldyl。 多核苷酸中并不是所有的連接都需要相同。前面的描述適用于本文中 提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。
抗體"可變區(qū)"指單獨的抗體輕鏈可變區(qū)或抗體重鏈可變區(qū)或 者兩者的組合。重鏈和輕鏈的可變區(qū)均各自由通過三個互補決定區(qū) (CDR,也稱作超變區(qū))連接在一起的4個構(gòu)架區(qū)(FR)組成。每條鏈中 的CDR通過FR而緊靠在一起，并與來自另一鏈的CDR—起促成抗體 的抗原結(jié)合位點的形成。存在至少兩種確定CDR的技術(shù)(1)基于 交叉物種序列變異性的方法(即，Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest (第5版，1991， National Institutes of Health, Bethesda， MD));和(2)基于抗原抗體復(fù)合物的晶體學(xué) 研究(Al-lazikani等(1997)， J. Molec. Biol. 273: 927-948))。 本文中，CDR可以指通過其中一種方法或者通過這兩種方法組合確定 的CDR。
抗體"恒定區(qū)"指單獨的抗體輕鏈恒定區(qū)或抗體重鏈恒定區(qū)或 者兩者的組合。
與抗體或多肽"優(yōu)先地結(jié)合"或"特異地結(jié)合"(本文中可互換 使用)的"表位"是本領(lǐng)域熟知的術(shù)語，確定此特異結(jié)合或優(yōu)先結(jié)合 的方法也是本領(lǐng)域熟知的。如果分子與特定細(xì)胞或物質(zhì)比其與其它細(xì) 胞或物質(zhì)能以更高的頻率、更快的速度、更長的持續(xù)時間和/或更大 的親和力反應(yīng)或結(jié)合，則稱該分子表現(xiàn)出"特異的結(jié)合，，或"優(yōu)先的 結(jié)合"。如果抗體與靶的結(jié)合比其與其它物質(zhì)的結(jié)合具有更高的親和 性、親和力、更為容易和/或持續(xù)時間更長，則該抗體"特異地結(jié) 合，，或"優(yōu)先地結(jié)合"靶。例如，特異地或優(yōu)先地與某APh。表位結(jié)
合的抗體是這樣的抗體，該抗體與該表位的結(jié)合比它與其它A P卜4。
表位或非ApH。表位的結(jié)合具有更高的親和性、親和力、更為容易和
/或持續(xù)時間更長。通過閱讀該定義也可以理解，例如，特異地或優(yōu) 先地與第一靶結(jié)合的抗體(或部分或表位)可以或者不可以特異地或 優(yōu)先地與第二靶結(jié)合。如此，"特異的結(jié)合"或"優(yōu)先的結(jié)合"不必 要求(盡管它可以包括)排他式的結(jié)合。 一般地，但不是必需的，提及 到結(jié)合意味著優(yōu)先的結(jié)合。
本文中，"基本上純的"指至少50%純(即，無雜質(zhì))、更優(yōu) 選地至少90 %純、更優(yōu)選地至少95 %純、更優(yōu)選地至少98 %純， 更優(yōu)先地至少99%純的物質(zhì)。
"宿主細(xì)胞，，包括單個細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物，其可以是或者已經(jīng) 是用于摻入多核苷酸插入物的栽體的受體。宿主細(xì)胞包括單個宿主 細(xì)胞的后代，該后代由于自然的、偶發(fā)的或有意的突變而可以不必 與原始親本細(xì)胞完全相同(在形態(tài)學(xué)上或在基因組DNA互補性上)。 宿主細(xì)胞包括在體內(nèi)被本發(fā)明多核苷酸轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。
術(shù)語"Fc區(qū)"用于定義免疫球蛋白重鏈的C端區(qū)域。"Fc區(qū)" 可以是天然序列的Fc區(qū)或者變異的Fc區(qū)。盡管免疫球蛋白重鏈Fc 區(qū)的界限可以變化，但人IgG重鏈Fc區(qū)通常^皮定義為自Cys"6或 Pro230位置的氨基酸殘基延伸至其羧基末端。Fc區(qū)中殘基的編號為 如Kabat等，Sequence of Proteins of Immunological Interest, 第5版，Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda， Md. ， 1991中EU索引(EU index)的編號。免疫球蛋白 Fc區(qū)一般包含兩個恒定區(qū)，CH2和CH3。
本文中，"Fc區(qū)，，和"FcR"描述與抗體Fc區(qū)結(jié)合的受體。優(yōu) 選的FcR是天然序列的人FcR。而且，優(yōu)選的FcR是與IgG抗體結(jié) 合(Y受體)的FcR，其包括Fc yRl、 Fc y RH和Fc yRHI亞型受體， 包括這些受體的等位變體和可變拼接形式。FcyRII受體包括Fcy RIIA ("激活性受體，，)和FcyRIIB ("抑制性受體，，)，兩者具 有相似氨基酸序列，它們的主要差異在于它們的胞質(zhì)域。關(guān)于FcR
的綜述見Ravetch和Kinet， 1991， Ann. Rev. Immunol. 9: 457-92; Capel等，1994， Immu議ethods， 4: 25-34;和de Haas等，1995， J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41。 "FcR"也包括新生兒受體FcRn， 該受體負(fù)責(zé)將母親的IgG轉(zhuǎn)移給胎兒(Guyer等，1976， J. Immunol. 117: 587;和Kim等，1994， J. Immunol. 24: 249)。
"補體依賴性細(xì)胞毒性"和"CDC"指靶在補體存在下發(fā)生的裂 解。補體系統(tǒng)的第一成分(Clq)與和關(guān)連抗原形成復(fù)合物的分子(例 如抗體)結(jié)合，將導(dǎo)致補體活化途徑的起始。為了評價補體活化，可 以實施CDC試驗，例如Gazzano-Santoro等，J. Immunol. Methods, 202: 163 (1996)中描述的CDC試驗。
"功能性Fc區(qū)"具有天然序列的Fc區(qū)的至少一種效應(yīng)子功能。 示例性"效應(yīng)子功能"包括Clq結(jié)合；補體依賴性細(xì)胞毒性(CDC); Fc 受體結(jié)合；抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC);吞噬作用；細(xì)胞 表面受體(例如，B細(xì)胞受體；BCR)的下調(diào)，等。該效應(yīng)子功能一般需 要Fc區(qū)與結(jié)合域(例如，抗體可變區(qū)結(jié)構(gòu)域)組合，并且可以使用本領(lǐng) 域已知用于評價此類抗體效應(yīng)子功能的各種試驗來進(jìn)行評價。
"天然序列的Fc區(qū)"包含與自然界中存在的Fc區(qū)的氨基酸序列 相同的氨基酸序列。"變異的Fc區(qū)"包含由于至少一個氨基酸修飾而 不同于天然序列的Fc區(qū)的氨基酸序列但保留了該天然序列的Fc區(qū)的 至少一種效應(yīng)子功能的氨基酸序列。優(yōu)選地，變異的Fc區(qū)與天然序列 的Fc區(qū)或者親本多肽的Fc區(qū)相比具有至少一個氨基酸替代，例如， 在天然序列的Fc區(qū)中或在親本多肽的Fc區(qū)中大約l個至大約10個氨 基酸替代，優(yōu)選地大約l個至大約5個氨基酸替代。本文中，變異的 Fc區(qū)優(yōu)選地與天然序列的Fc區(qū)和/或與親本多肽的Fc區(qū)具有至少大 約80%序列同一性，最優(yōu)選地至少大約90%序列同一性，更優(yōu)選地至 少大約95%、至少大約96%、至少大約97%、至少大約98%、至少 大約99%序列同一性。
本文中，"抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，，和"ADCC"指細(xì)胞 介導(dǎo)的反應(yīng)，其中表達(dá)Fc受體(FcR)的非特異性細(xì)胞毒性細(xì)胞(例如，
自然殺傷(NK)細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)識別乾細(xì)胞上結(jié)合的抗 體并隨后導(dǎo)致靶細(xì)胞的裂解。目的分子的ADCC活性可以使用體外ADCC 試驗，例如，美國專利5, 500， 362或5, 821, 337中所述的試驗來評價。 對于該試驗有用的效應(yīng)細(xì)胞包括外周血單核細(xì)胞(PBMC)和NK細(xì)胞。備 選地，或者此外，目的分子的ADCC活性可以在體內(nèi)，例如，在動物模 型，例如Clynes等1998 PNAS (USA) 95: 652-656中公開的動物模 型中評價。
本文中，藥物、化合物或藥物組合物的"有效劑量，，或"有效量，， 是可以有效地實現(xiàn)有益或期望結(jié)果的量。對于預(yù)防性應(yīng)用，有益的或 期望的結(jié)果包括諸如消除或降低疾病的風(fēng)險、減輕疾病的嚴(yán)重性或延 遲疾病的發(fā)作，其中所述疾病包括疾病的生物化學(xué)的、組織學(xué)的和/ 或行為上的癥狀、其并發(fā)癥以及疾病發(fā)展過程中表現(xiàn)出的中間病理學(xué) 表型。對于治療性應(yīng)用，有益的或期望的結(jié)果包括臨床結(jié)果，例如， 抑制、阻礙或降低淀粉樣蛋白斑的形成，減少、除去、清除淀粉樣蛋 白斑，改善認(rèn)知、逆轉(zhuǎn)或減慢認(rèn)知衰退、隔離或增加生物學(xué)液體中循 環(huán)的可溶性AP肽、減少因該疾病導(dǎo)致的一種或多種癥狀(生物化學(xué) 的、組織學(xué)的和/或行為上的)，包括其并發(fā)癥和疾病發(fā)展過程中出現(xiàn) 的中間病理學(xué)表型，增加該疾病患者的生活質(zhì)量，降低其它藥物治療 該疾病時所需的劑量，增強其它藥物的效果，延遲疾病進(jìn)展，和/或延 長患者的存活時間。有效劑量可以分一次或多次施用。對于本發(fā)明的 目的，藥物、化合物或藥物組合物的有效劑量是足以直接地或間接地 實現(xiàn)預(yù)防性或治療性治療的量。在臨床上可以理解，藥物、化合物或 藥物組合物的有效劑量可以通過或者可以不通過與其它藥物、化合物 或藥物組合物聯(lián)合而實現(xiàn)。因此，可以在施用一種或多種治療劑的情 況下認(rèn)定"有效劑量"，而且如果單個藥劑在與一個或多個其它藥劑 聯(lián)合時達(dá)到了或者可以達(dá)到期望的結(jié)果，則該單個藥劑可被認(rèn)為是以 有效量給予的。
本文中，"治療"或"療法"是用于獲得有益的或期望的結(jié)果(包 括臨床結(jié)果)的方法。為了本發(fā)明目的，有益的或期望的臨床結(jié)果包括，但不限于，以下之一種或多種抑制、阻礙或降低淀粉樣蛋白斑 的形成，減少、除去或清除淀粉樣蛋白斑，改善認(rèn)知、逆轉(zhuǎn)或減慢認(rèn) 知衰退、隔離在生物學(xué)液體中循環(huán)的可溶性A 0肽、減少組織(例如腦) 中的AP肽(包括，可溶性的、寡聚體的和沉積的)，抑制、減慢和/或 降低腦中AP肽的累積，抑制、減緩和/或降低Ap肽在組織(例如腦) 中的毒性作用、減少因該疾病導(dǎo)致的癥狀，增加該疾病患者的生活質(zhì) 量，降低其它藥物治療該疾病時所需的劑量，延遲疾病進(jìn)展，和/或延 長患者的存活時間。
本文中，"延遲"阿爾茨海默氏病的發(fā)展意味著推遲、阻礙、減 緩、阻止、平抑和/或延緩該疾病的發(fā)展。根據(jù)該疾病的病史和/或待 治療的個體，此延遲可以具有不同的時間長度。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員 明了的，充分的或顯著的延遲可以，實際上，包括預(yù)防，即，個體不 出現(xiàn)該疾病。"延遲"阿爾茨海默氏病的發(fā)展的方法是，與未使用該 方法相比，在給定的時間框架內(nèi)降低疾病發(fā)展的可能性和/或在給定的 時間框架內(nèi)降低疾病的程度的方法。該比較典型地使用統(tǒng)計學(xué)顯著數(shù) 量的個體基于臨床研究進(jìn)行。
阿爾茨海默氏病的"發(fā)展"意味著阿爾茨海默氏病在個體內(nèi)發(fā)作 和/或進(jìn)展?？梢允褂帽疚乃龅臉?biāo)準(zhǔn)臨床技術(shù)檢測阿爾茨海默氏病的 發(fā)展。然而，發(fā)展也指最初可能檢測不到的疾病進(jìn)展。為了本發(fā)明的 目的，進(jìn)展指疾病狀態(tài)的生物學(xué)過程，在此情況下，可以通過標(biāo)準(zhǔn)神 經(jīng)學(xué)檢查、或患者訪問來確定，或者可以通過更為專業(yè)的測試來確定。 各種此類診斷試驗包括，但不限于，神經(jīng)成像、檢測血清或腦脊液中 特定蛋白質(zhì)(例如，淀粉樣肽和Tau)的水平變化、計算機化的X線斷 層攝影術(shù)(CT)、和核磁共振成像(MRI)。"發(fā)展"包括發(fā)生、復(fù)發(fā)和發(fā) 作。本文中，阿爾茨海默氏病的"發(fā)作"或"發(fā)生"包括最初的發(fā)作 和/或復(fù)發(fā)。
本文中，"聯(lián)合"施用包括同時施用和/或在不同時間施用。聯(lián)合 文中，聯(lián)合施用意味著包括其中將抗A^抗體和另一藥劑施用給個體
的任何情況，其中抗AP抗體和另一藥劑的施用可以同時和/或分開進(jìn) 行。如本文中進(jìn)一步討論的，應(yīng)當(dāng)理解抗AP抗體和所述另一藥劑可 以以不同的給藥頻率或間隔施用。例如，可以每周施用抗AP抗體， 而所述另一藥劑可以以較低的頻率施用?？梢岳斫猓笰P抗體和所 述另 一 藥劑可以使用相同的施用途徑或不同的施用途徑施用。
"生物學(xué)樣品，，包括各種從個體獲得的樣品類型，其可以用于診 斷或監(jiān)測試驗中。該定義包括血液和生物學(xué)來源的其它液體樣品、固 體組織樣品例如生物活檢標(biāo)本或組織培養(yǎng)物或來源于它們的細(xì)胞及其 后代。該定義也包括在獲得之后以任何方式被操作過的樣品，所述操 作為例如用試劑處理、增溶或富集某些成分如蛋白質(zhì)或多核苷酸、或 包埋在半固體或固體基質(zhì)中以便用于切片目的。術(shù)語"生物學(xué)樣品" 包括臨床樣品，也包括培養(yǎng)的細(xì)胞、細(xì)胞上清液、細(xì)胞裂解物、血清、 血漿、生物學(xué)液體和組織樣品。
"對象，，(或者稱作"個體，，)是哺乳動物、更優(yōu)選地人。哺乳 動物也包括，但不限于，農(nóng)畜(例如奶牛)、運動動物、寵物(例如貓、 狗、馬)、靈長類動物、小鼠和大鼠。
本文中，"栽體"指能夠向宿主細(xì)胞遞送，優(yōu)選地在宿主細(xì)胞中 表達(dá)， 一個或多個目的基因或序列的構(gòu)建體。載體的例子包括，但不 限于，病毒載體、棵DNA或RNA表達(dá)栽體、質(zhì)粒、粘?；蚴删w載體、 與陽離子縮合劑結(jié)合的DNA或RNA表達(dá)載體、包在脂質(zhì)體中的DNA或 RNA表達(dá)載體、以及某些真核細(xì)胞例如生產(chǎn)細(xì)胞。
本文中，"表達(dá)控制序列，，指指導(dǎo)核酸表達(dá)的核酸序列。表達(dá)控 制序列可以是啟動子，例如組成型或誘導(dǎo)型啟動子，或增強子。表達(dá) 控制序列與待轉(zhuǎn)錄的核酸序列可操作地連接。
本文中，"藥物可接受栽體"包括當(dāng)與活性成分組合時能夠允許
物質(zhì)。實例包括，但不限于，任何標(biāo)準(zhǔn)的藥物載體，例如，磷酸緩沖 鹽水溶液、水、乳劑如油/水乳劑、和各種類型的潤濕劑。對于氣霧劑 或腸胃外施用，優(yōu)選的稀釋劑是磷酸緩沖鹽水或生理鹽水(O. 9%)。包 含此類載體的組合物可以通過熟知的常規(guī)方法配制(見例如，
Remington' s Pharmaceutical Sciences, 第18版，A. Gennaro，編, Mack Publishing Co., Easton， P.A.， 1990; 和Remington, The Science and Practice of Pharmacy 第 20版，Mack Publishing, 2000)。
術(shù)語"k。n"在本文中旨在指抗體與抗原結(jié)合的結(jié)合速率常數(shù)(on rate constant)。
術(shù)語"k。ff"在本文中旨在指抗體自抗體/抗原復(fù)合物解離的解離 速率常數(shù)(off rate constant)。
術(shù)語"KD"在本文中旨在指抗體抗原相互作用的平衡解離常數(shù)。
組合物和制備組合物的方法 抗0淀粉樣蛋白抗體和多肽
本發(fā)明提供與AP肽的C端結(jié)合的抗體。本發(fā)明提供與A0H。、 A 0 w和A^—43結(jié)合的抗體或多肽。 一些實施方案中，所述抗體或多肽 以比其結(jié)合AP^2和APw3時更高的親和性結(jié)合APh。。 一些實施方 案中，所述抗體與APh6、 A卜—37 、 APn和APw9結(jié)合。 一些實施方
案中，所述抗體與APn-35結(jié)合。一些實施方案中，所述抗體與Ap2H。
結(jié)合。 一些實施方案中，所述抗體或多肽與A0H。上包括氨基酸25-34 及40的表位結(jié)合。
本發(fā)明還提供包含本文所述任何抗體或多肽(例如，抗體6G和其 顯示在表3中的變體或者來源于抗體6G和其顯示在表3中的變體的多
肽)；或本文所述多核普酸的組合物，包括藥物組合物。本文中，組合 物包含一種或多種與APH。的C端結(jié)合的抗體或多肽(其可以是或可以 不是抗體)和/或一種或多種包含編碼一種或多種與APm。的C端結(jié)合 的抗體或多肽的序列的多核苷酸。這些組合物還可以包含適宜的賦形 劑，例如，本領(lǐng)域熟知的藥物可接受賦形劑，包括緩沖液。
本發(fā)明抗體和多肽的特征在于以下特征之任何(一個或多個)(a) 與A卩ho、 APw2和A^—"結(jié)合；(b)與AP ho、 AP卜42和A卩H3結(jié)合，
其中與ApH。結(jié)合的親和性高于與APh2和APh3結(jié)合的親和性；(c)
與A0H。上包括氨基酸25-34及40的表位結(jié)合；(d)與A P ^、 A P ^ 、 APhs和AP卜39結(jié)合，但是親和性低于其結(jié)合APw6的親和性；(e)以 小于大約1 jliM的K。與A^w7結(jié)合；(f)與AP2H5結(jié)合；(g)與Ap 2M。結(jié)合；(h)不結(jié)合細(xì)胞中表達(dá)的APP; (i)抑制個體中淀粉樣蛋白 斑的形成；(j)減少個體中的淀粉樣蛋白斑；(k)治療、預(yù)防、改善 阿爾茨海默氏病或其它AP累積相關(guān)疾病(例如，Down氏綜合癥、帕金 森病、多發(fā)性腦梗塞癡呆、輕度認(rèn)知缺損、腦淀粉樣血管病、抑郁、 Creutzfeldt-Jakob病、伴有Lewy小體的癡呆)的一個或多個癥狀； (1)改善認(rèn)知功能。本發(fā)明抗體和多肽也可以具有本文所述的受損的 效應(yīng)子功能。與報道的其它抗A^抗體不同，具有受損的效應(yīng)子功能 的抗體和多肽可以表現(xiàn)出期望的完全鐠。例如，本發(fā)明組合物可以不 造成顯著或不可接受水平的任一種或多種下列情況腦血管系統(tǒng)中的 出血(腦出血)；腦膜腦炎(包括改變的核磁共振掃描)；腦脊液中升高 的白細(xì)胞計數(shù)；中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥。
因此，本發(fā)明提供任何以下物質(zhì)，或包含任何以下物質(zhì)的組合物 (包括藥物組合物)(a)抗體6G或其顯示在表3中的變體；(b)抗 體6G或其顯示在表3中的變體的片段或區(qū)域；(c)抗體6G或其顯示 在表3中的變體的輕鏈；(d)抗體6G或其顯示在表3中的變體的重鏈； (e)來自抗體6G或其顯示在表3中的變體的輕鏈和/或重鏈的一個或 多個可變區(qū)；(f)抗體6G或其顯示在表3中的變體的一個或多個 CDR(l， 2, 3， 4， 5，或6個CDR); (g)來自抗體6G重鏈的CDR H3; (h)來自抗體6G或其顯示在表3中的變體的輕鏈的CDR L3; (i)來 自抗體6G或其顯示在表3中的變體的輕鏈的3個CDR; (j)來自抗體 6G或其顯示在表3中的變體的重鏈的3個CDR; (k)來自抗體6G或其 顯示在表3中的變體的輕鏈的3個CDR以及來自抗體6G或其顯示在表 3中的變體的重鏈的3個CDR;和(l)包含(b)至(k)中的任意一個的抗
體。本發(fā)明還提供包含以上項目任意一個或多個的多肽。
抗體6G的CDR部分(包括Chothia和Kabat CDR)圖解顯示在圖1
中。CDR區(qū)的確定是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的?？梢岳斫?，在一些實施 方案中，CDR可以是Kabat和ChothiaCDR的組合(也稱作"組合CDR，， 或"擴(kuò)展CDR，，)。 一些實施方案中，CDR是Kabat CDR。其它實施方 案中，CDR是Chothia CDR。換言之，在具有一個以上CDR的實施方案 中，所述CDR可以是Kabat、 Chothia、組合CDR或其組合中的任意一 種。
一些實施方案中，本發(fā)明提供多肽(可以是或可以不是抗體)，該 多肽包含與6G或其顯示在表3中的變體的至少一個CDR、至少兩個、 至少三個、至少四個、至少五個或全部六個CDR基本上相同的至少一 個CDR、至少兩個、至少三個、或至少四個、至少五個或全部六個CDR。 其它實施方案包括具有與6G的或衍生自6G的至少兩個、三個、四個、 五個或六個CDR基本上相同的至少兩個、三個、四個、五個或六個CDR 的抗體。 一些實施方案中，所述至少一個、兩個、三個、四個、五個、 或六個CDR與6G或其顯示在表3中的變體的至少一個、兩個、三個、 四個、五個或六個CDR有至少大約85% 、 86%、 87%、 88%、 89%、 90%、 95。/。、 96%、 97%、 98 。/?；?9 %的同 一性。可以理解，為了本 發(fā)明的目的，結(jié)合特異性和/或總的活性一般地得到保持，但是與6G 或其顯示在表3中的變體相比活性程度可以不同(可以較高或較低)。
本發(fā)明還提供包含6G或其顯示在表3中的變體的氨基酸序列的多 肽(可以是或可以不是抗體)，其中所述氨基酸序列具有以下之任一 抗體6G或其顯示在表3中的變體的序列中的至少5個連續(xù)氨基酸、至 少8個連續(xù)氨基酸、至少大約IO個連續(xù)氨基酸、至少大約15個連續(xù) 氨基酸、至少大約20個連續(xù)氨基酸、至少大約25個連續(xù)氨基酸、至 少大約30個連續(xù)氨基酸，其中這些氨基酸中的至少3個來自6G(圖1) 或其顯示在表3中的變體的可變區(qū)。 一個實施方案中，所述可變區(qū)來 自6G的輕鏈。另一實施方案中，所述可變區(qū)來自6G的重鏈。 一個示 例性多肽具有來自6G的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的連續(xù)氨基酸(長度 如上述)。另一實施方案中，所述5個(或更多個)連續(xù)氨基酸來自圖1 所示6G的互補決定區(qū)(CDR)。 一些實施方案中，所述連續(xù)氨基酸來自
6G的可變區(qū)。
本發(fā)明抗體和多肽的結(jié)合親和性可以變化，不必(但可以)是特定 的值或范圍，如下述示例性實施方案。本發(fā)明抗體和多肽與APh。的 結(jié)合親和性(L)可以是大約0. IO至大約0. 80 nM、大約0. 15至大約 0.75 nM、和大約0. 18至大約0.72 nM。 一些實施方案中，所述結(jié)合 親和性是大約2pM、大約5pM、大約10pM、大約15pM、大約20pM、大 約40pM、或大于大約40pM。 一個實施方案中，結(jié)合親和性是大約2pM 至大約22pM。其它實施方案中，結(jié)合親和性小于大約10nM、大約5nM、 大約4nM、大約3nM、大約2nM、大約lnM、大約900pM、大約800pM、 大約700pM、大約600pM、大約500pM、大約400pM、大約300pM、大 約200pM、大約150pM、大約100pM、大約90pM、大約80pM、大約70pM、 大約60pM、大約50pM、大約40pM、大約30pM、大約10pM。 一些實施 方案中，結(jié)合親和性為大約10nM。其它實施方案中，結(jié)合親和性小于 大約10nM、小于大約50nM、小于大約100nM、小于大約150nM、小于 大約200nM、小于大約250nM、小于大約500nM、或小于大約1000nM。 其它實施方案中，結(jié)合親和性小于大約5nM。其它實施方案中，結(jié)合 親和性小于大約lnM。其它實施方案中，結(jié)合親和性為大約0. lnM或 大約O. 07nM。其它實施方案中，結(jié)合親和性小于大約0, lnM或小于大 約0.07nM。其它實施方案中，結(jié)合親和性為從大約10nM、大約5nM、 大約lnM、大約900pM、大約800pM、大約700pM、大約600pM、大約 500pM、大約400pM、大約300pM、大約200pM、大約150pM、大約100pM、 大約90pM、大約80pM、大約70pM、大約60pM、大約50pM、大約40pM、 大約30pM、大約10pM中的任意一個至大約2pM、大約5pM、大約10pM、 大約15pM、大約20pM、或大約40pM中的任意一個。 一些實施方案中， 結(jié)合親和性是大約10nM、大約5nM、大約lnM、大約900pM、大約800pM、 大約700pM、大約600pM、大約500pM、大約400pM、大約300pM、大 約200pM、大約150pM、大約100pM、大約90pM、大約80pM、大約70pM、 大約60pM、大約50pM、大約40pM、大約30pM、大約10pM中的任意一 個。再其它實施方案中，結(jié)合親和性為大約2pM、大約5pM、大約10pM、
大約15pM、大約20pM、大約40pM或大于大約40pM。
本發(fā)明抗體和多肽還可以與APw6、 ApH7 、 AP卜38、 A^—39 、 A P卜42和A P h3中的任意一個或多個結(jié)合，但是與這些肽中的任意一個 或多個的結(jié)合親和性小于它們與APw。的結(jié)合親和性。 一些實施方案
中，所述抗體或多肽與A卜—36、A0卜37、A0u、A^—39、 A^-42和A
Ph3中的任意一個或多個的K。是其與APh。的K。的至少大約5倍、至 少大約10倍、至少大約20倍、至少大約30倍、至少大約40倍、至 少大約50倍、至少大約80倍、至少大約100倍、至少大約150倍、 至少大約200倍或至少大約250倍。
本發(fā)明還提供制備這些抗體或多肽中的任何抗體或多肽的方法。 本發(fā)明抗體可以通過本領(lǐng)域已知的方法制備。例如，可以通過用 肽(例如，AP 25-40作為免疫原)免疫哺乳動物，制備所述抗體。可以 通過蛋白水解或其它的方式降解抗體，或通過如上述的重組方法(即， 單個的或融合的多肽)或通過化學(xué)合成，而制備所述多肽。所述抗體的 多肽，尤其是不超過大約50個氨基酸的較短多肽，可以通過化學(xué)合成 方便地制備。化學(xué)合成方法是本領(lǐng)域已知的，并且是可以通過商業(yè)途 徑獲得的。例如，可以通過自動多肽合成儀，使用固相方法，制備抗 體。也參見美國專利5， 807， 715; 4,816, 567;和6， 331， 415。
在另一備選方案中，抗體可以使用本領(lǐng)域熟知的方法重組制備。 一個實施方案中，多核苷酸包含SEQ ID NO: 9和SEQ ID NO: 10中所 示編碼抗體6G的重鏈和/或輕鏈可變區(qū)的序列。另一實施方案中，包 含SEQ ID NO: 9和SEQ ID NO: 10中所示核苷酸序列的多核苷酸^^克 隆至一個或多個用于表達(dá)或擴(kuò)增的載體中。編碼目的抗體的序列在宿 主細(xì)胞中可以維持在載體中，然后可以擴(kuò)增宿主細(xì)胞并將之冷凍以備 用。對載體(包括表達(dá)載體)和宿主細(xì)胞，本文將進(jìn)一步作出描述。
本發(fā)明還包括本發(fā)明抗體，例如6G，的單鏈可變區(qū)片段("scFv")。 單鏈可變區(qū)片段可以通過使用短的連接肽將輕鏈和/或重鏈可變區(qū)連 接在一起而制備。Bird等(1988) Science 242: 423-426。連接肽的 一個實例是(GGGGS)3，其在一個可變區(qū)的羧基端和另一可變區(qū)的氨基 端之間形成了大約3. 5nm的橋。具有其它序列的接頭也已有設(shè)計和應(yīng) 用。Bird等(1988)。接頭反過來可以被修飾以具有額外的功能，例如 附著藥物或附著固相支持物。所述單鏈變體可以通過重組方式或合成 方式制備。對于scFv的合成制備，可以使用自動合成儀。對于scFv 的重組制備，可以將含有編碼該scFv的多核苷酸的適宜質(zhì)粒導(dǎo)入適宜 的宿主細(xì)胞，它可以是真核細(xì)胞如酵母、植物、昆蟲或哺乳動物細(xì)胞， 或者原核細(xì)胞例如大腸桿菌(E. coli)。編碼目的scFv的多核苷酸可以 通過常規(guī)操作例如多核苷酸的連接而產(chǎn)生。所得scFv可以使用本領(lǐng)域 已知的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化技術(shù)分離。
本發(fā)明也包括其它形式的單鏈抗體，例如diabody。 Diabody是二 價雙特異性抗體，其中VH和VL域表達(dá)在單——條多肽鏈上，但是通 過使用短至不允許同一條鏈上的這兩個域發(fā)生配對的接頭，從而迫使 這些域與另 一條鏈上的互補域配對而產(chǎn)生兩個抗原結(jié)合位點(見例如， Holliger， P.等(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak， R. J.等(1994) Structure 2: 1121-1123)。
例如，雙特異性抗體，對至少兩種不同抗原具有結(jié)合特異性的單 克隆抗體可以使用本文公開的抗體制備。制備雙特異性抗體的方法是 本領(lǐng)域已知的(見例如，Suresh等，1986， Methods in Enzymology 121: 210)。傳統(tǒng)上，雙特異性抗體的重組制備以共表達(dá)兩對免疫球蛋白重 鏈-輕鏈為基礎(chǔ)，其中所述兩條重鏈具有不同的特異性(Millstein和 Cuello， 1983， Nature, 305: 537-539)。
根據(jù)制備雙特異性抗體的一個方法，將具有所述期望結(jié)合特異性 的抗體可變域(抗體-抗原結(jié)合位點)與免疫球蛋白恒定域序列融合。該 融合物優(yōu)選具有包含至少一部分鉸鏈，CH2和CH3區(qū)的免疫球蛋白重 鏈恒定域。優(yōu)選地，在至少一個融合物中存在含有結(jié)合輕鏈所必需的 位點的第一重鏈恒定區(qū)(CH1)。將編碼這些免疫球蛋白重鏈融合物以 及，如果期望的話，免疫球蛋白輕鏈的DNA插入分開的表達(dá)載體中， 并共轉(zhuǎn)染至適宜的宿主生物。在所述構(gòu)建體中所用的這三條多肽鏈具 有不等比率可以提供最佳產(chǎn)率的實施方案中，這使得可以極為靈活地
調(diào)整這三個多肽片段的相互比例。然而，當(dāng)至少兩條多肽鏈以等比率 表達(dá)可以導(dǎo)致高產(chǎn)率時或者當(dāng)所述比率不具有特別意義時，將兩條或 全部三條多肽鏈的編碼序列插入一個表達(dá)載體中是可能的。
一個方法中，雙特異性抗體由位于一條臂中的具有第一結(jié)合特異 性的雜合免疫球蛋白重鏈和位于另 一臂中的雜合免疫球蛋白重鏈-輕 鏈對(提供第二結(jié)合特異性)組成。該不對稱結(jié)構(gòu)一一免疫球蛋白輕鏈 僅存在于該雙特異性分子的一半中一一有利于將期望的雙特異性化合
物與不想要的免疫球蛋白鏈組合分開。該方法描述在1994年3月3 曰7>布的PCT公布號W0 94/04690中。
包含兩個共價連接的抗體的雜綴合抗體(heteroconjugate antibody)也在本發(fā)明范圍內(nèi)。此類抗體已經(jīng)用于使免疫系統(tǒng)細(xì)胞靶向 不想要的細(xì)胞(美國專利號4， 676， 980)和用于治療HIV感染(PCT申請
發(fā)明者A·羅森塔爾, J·彭斯, 何維賢 申請人:瑞納神經(jīng)科學(xué)公司