離心1分鐘，管底溶液即為純化過的核酸適配體的PCR產(chǎn)物。
[0017] 實施例2:核酸適配體的克隆和測序以及單鏈DNA二級結(jié)構(gòu)的預測 一、大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞的制備 1、 挑取單個DH5 a菌落，接種于3 mL不含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過夜，次 日取上述菌液按比例1:100再接種于50 mL液體LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩2小時；當0D600 值達到0. 35時，收獲細菌培養(yǎng)物； 2、 將細菌培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到一個50 mL預冷的無菌聚丙烯管中，冰上放置10 min，使培養(yǎng)物 冷卻； 3、 于4°C下4000 rpm離心10 min，棄去培養(yǎng)液，并將管倒置I min以使殘留的培養(yǎng)液 流盡； 4、 各加150 μ L冰預冷的0.1 mM CaCl2溶液，合并兩管，冰浴10 min ; 5、 于4°C下4000 rpm離心10 min，棄去上清液，并將管倒置I min以使殘留的液體流 盡； 6、 先加入800 μ L冰預冷的0.1 M CaCl2溶液重懸細胞，再加入25 μ L預冷的75%的 甘油，之后于-80 °C貯存?zhèn)溆谩?br>[0018] 二、連接及連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化 1、 在微量離心管中加入0.5 yL Takara pMD19_T simple載體、4.5 yL核酸適配體 PCR產(chǎn)物及5 μ L的連接酶緩沖混合物； 2、 16°C反應3小時； 3、 全量（10 yL)加入至100 yLDH5a感受態(tài)細胞中，冰中放置30分鐘； 4、 42 °C加熱90秒鐘后，再在冰中放置1分鐘； 5、 加入37°C溫浴過的LB培養(yǎng)基890 μ L，37°C緩慢振蕩培養(yǎng)60分鐘； 6、 取200以1^涂布于含有乂-6&1、1?16、氨芐青霉素的1^培養(yǎng)基上，37°(：培養(yǎng)16小時 以形成單菌落。
[0019] 三、核酸適配體的克隆篩選和測序以及單鏈DNA二級結(jié)構(gòu)預測 挑取上述白色的單菌落于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C緩慢振蕩培養(yǎng)4小時，進 行PCR擴增；擴增引物及擴增條件同前述核酸適配體的擴增條件。將經(jīng)PCR確證的陽性克 隆進行質(zhì)粒提取后，以美國Applied Biosystems 3730A全自動核苷酸序列測定儀進行核苷 酸序列的測定；結(jié)構(gòu)表明，與α -鵝膏毒肽特異性結(jié)合的核酸適配體(命名為H06)其序列自 5'端至3'端為： TGACATATTCAGTCTGACAGCGGAAGCGGGTCAGTCCAACTCACGGTCTCGGATGCACGGGAGATGGACGAAT ATCGTCTAGCA 與α -鵝膏毒肽特異性結(jié)合的核酸適配體Η06的序列長度：84個堿基，序列類型：核 酸，鏈數(shù)：單鏈，拓撲學：直鏈狀，序列種類：ssDNA。
[0020] 通過MFOLD軟件設置溫度為26 °C、Na+濃度為150 mM，Mg 2+濃度為I mM (http://mfold.rna· albany.edu/?q=mfold/DNA-Folding-Form)和 QGRS 映射（http:// bioinformatics, ramapo. edu/QGRS/analyze. php)對與α -鶴膏毒肽特異性結(jié)合的核酸適 配體Η06單鏈DNA分子進行二級結(jié)構(gòu)預測。結(jié)果表明，適配體含有突出的環(huán)和莖，存在G-四 鏈體結(jié)構(gòu)，其吉布斯自由能DG=-15. 36,該結(jié)構(gòu)具有較高的穩(wěn)定性。
[0021] 實施例3:圓二色譜法對K +濃度與核酸適配體H06的關系的探究 1、 將適配體用20 mM Tris-HCl緩沖液（pH 7. 2)稀釋至20 μ M后，于94°C變性 0· 5 min以0· 5°C /min的速度冷卻至25°C ; 2、 用含有不同濃度（0、5、10、20、50 mM) KCl 的 20 mM Tris-HCl 緩沖液（pH 7. 2)將 核酸適配體H06稀釋至2. 5 μ M ; 3、 于25°C，220 - 340 nm波長處用圓二色譜儀進行檢測（結(jié)果見圖1)，結(jié)果顯示在不同 濃度K+溶液中均有275nm處的峰值出現(xiàn)，說明核酸配體H06具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)和G-四鏈體結(jié) 構(gòu)。
[0022] 實施例4:核酸適配體（H06)的特異性和對α -鵝膏毒肽的敏感性 一、核酸適配體Η06特異性檢測 UELONA方法 在傳統(tǒng)的ELISA方法的基礎上加以改進，用篩選出來的適配體來代替抗體，采用生物 素-親和素放大系統(tǒng)用以檢測待測樣品的一種方法。
[0023] (1)適配體-生物素的包被 篩選出來的特異性識別α -鵝膏毒肽的核酸適配體送到TaKaRa公司合成，得到用生物 素標記的適配體。使用時先短暫離心，使生物素標記的適配體聚集在試管底部。根據(jù)說明 書，用滅菌水或TE buffer (ρΗ7. 5-8. 0)充分溶解成存儲溶液，一般濃度為10 4或10 5M,置 于-20°C保存。為避免反復凍融，可分裝成小份。將生物素標記的適配體用IXPBS稀釋到工 作濃度，每個孔加100 yL，用不干膠或封口膜密封，于37°C、150 rpm振蕩器上孵育1-2 h， 孵育完后棄去孔內(nèi)液體，每孔加洗滌液200 μ L，于水平搖床上振蕩洗滌3次，每次2 min， 每次都要在干凈的吸水紙上拍干。
[0024] (2)加 α-鵝膏毒肽孵育 按核酸適配體結(jié)合緩沖液與α-鵝膏毒肽體積比1:1的比例加入到包被有生物素標 記的適配體的酶標板中，每個孔加100 μ L，用不干膠密封，于37°C、150 rpm振蕩器上孵育 1-2 h，孵育完后棄去孔內(nèi)液體，每孔加洗滌液200 μ L，于水平搖床上振蕩洗滌3次，每次2 min，同樣的每次都要在于凈的吸水紙上拍干。（對照組則將α-鵝膏毒肽換成非靶標蛋白， 方法同上)。
[0025] (3)加酶結(jié)合物孵育 往每孔中加入100 μ L辣根過氧化物酶結(jié)合物，用不干膠密封，于37°C、150 rpm振蕩 器上孵育I h，洗滌3次，每次2 min。
[0026] (4)顯色 每孔加入TMB100 yL，于37°C避光顯色10 min，拍照保存。
[0027] (5)終止 加25 μ L終止液（2 M硫酸)，并在反應終止10 min以內(nèi)用酶標儀測各孔450 nm處吸 光度值0D450。
[0028] 結(jié)果顯示，適配體H06能夠與α -鵝膏毒肽特異性的結(jié)合(結(jié)果見圖2)，核酸適配 體Η06不與其他蛋白反應，能夠快速檢測到α -鵝膏毒肽。
[0029] 2、Dot Blot 方法 (1) 將5微升的α-鵝膏毒肽（40 ng/μ L)點至圓形NC膜（半徑為0.25cm)中心，待 NC膜干燥后，置于2mL的凍存管，同時設立空白對照和陰性對照； (2) 加入100微升封閉液，與37°C孵育2h，用含0. 05% Tween-20的PBS溶液洗膜3次， 每次3min ; (3) 將制備好的標記有生物素的配體于95°C變性5min，迅速降至4°C，將適配體加到制 備好的NC膜上，37°C孵育2h后，用含0. 05% Tween-20的PBS溶液洗膜3次，每次3min ; (4) 將辣根過氧化物酶結(jié)合物加到NC膜上，37°C孵育Ih后，用含0. 05% Tween-20的 PBS溶液洗膜3次，每次3min ; (5) 加入TMB到NC膜，于37°C避光顯色10 min，觀察適配體與蘑菇毒素的結(jié)合情況，拍 照保存(結(jié)果見圖3)，結(jié)果表明核酸適配體H06具有很高的特異性，能夠快速檢測到α -鵝 膏毒肽。
[0030] 二、核酸適配體Η06最佳濃度的檢測 1、 將生物素標記的適配體用IX PBS稀釋到不同的工作濃度，每個孔加100 μ L，用不 干膠或封口膜密封，于37°C、150 rpm振蕩器上孵育1-2 h，孵育完后棄去孔內(nèi)液體，每孔加 洗滌液200 μ L，于水平搖床上振蕩洗滌3次，每次2 min，每次都要在干凈的吸水紙上拍 干； 2、 按適配體結(jié)合緩沖液與40 ng/ μ L的α -鵝膏毒肽溶液體積比1:1比例加入到包被 有生物素標記的適配體的酶標板中，每個孔加100 μ L，用不干膠密封，于37°C、150 rpm振 蕩器上孵育1-2 h，孵育完后棄去孔內(nèi)液體，每孔加洗滌液200 μ L，于水平搖床上振蕩洗滌 3次，每次2 min，同樣的每次都要在于凈的吸水紙上拍干； 3、 往每孔中加入100 μ L辣根過氧化物酶結(jié)合物，用不干膠密封，于37°C、150 rpm振 蕩器上孵育I h，洗滌3次，每次2 min ; 4、 每孔加入TMBlOO μ L，于37°C避光顯色10 min; 5、 加25 μ L終止液（2 M硫酸)，并在反應終止10 min以內(nèi)用酶標儀測各孔450 nm處 吸光度值OD450 ; 6、 結(jié)果表明，適配體H06的最佳濃度為80 nM (結(jié)果見圖4)。
[0031] 三、核酸適配體H06對α -鵝膏毒肽的靈敏度的檢測 1、 將生物素標記的適配體用IXPBS稀釋到工作濃度，每個孔加100 μ L，用不干膠或 封口膜密封，于37°C、150 rpm振蕩器上孵育1-2 h，孵育完后棄去孔內(nèi)液體，每孔加洗滌液 200 μ L，于水平搖床上振蕩洗滌3次，每次2 min，每次都要在干凈的吸水紙上拍干； 2、 按適配體結(jié)合緩沖液與不同濃度的α -鵝膏毒肽溶液體積比1:1比例加入到包被有 生物素標記的適配體的酶標板中，每個孔加100 μ L，用不干膠密封，于37°C、150 rpm振蕩 器上孵育1-2 h，孵育完后棄去孔內(nèi)液體，每孔加洗滌液200 μ L，于水平搖床上振蕩洗滌3 次，每次2 min，同樣的每次都要在于凈的吸水紙上拍干； 3、 往每孔中加入100 μ L辣根過氧化物酶結(jié)合物，用不干膠密封，于37°C、150 rpm振 蕩器上孵育I h，洗滌3次，每次2 min ; 4、 每孔加入TMB100 μ L，于37°C避光顯色10 min; 5、 加25 μ L終止液（2 M硫酸)，并在反應終止10 min以內(nèi)用酶標儀測各孔450 nm處 吸光度值0D450 ; 6、 結(jié)果表明，適配體H06能檢測到蘑菇毒素 α-鵝膏毒肽的最低濃度為8 ng/yL (結(jié) 果見圖5)。
【主權項】
1. 一種與a-鵝膏毒肽特異性結(jié)合的核酸適配體，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ IDNO:1 所示。2. 根據(jù)權利要求1所述核酸適配體，其特征在于：其二級結(jié)構(gòu)具有突出的環(huán)和莖，存在 G-四鏈體結(jié)構(gòu)，吉布斯自由能DG=-15. 36。3. 權利要求1所述核酸適配體在識別a-鵝膏毒肽或在制備檢測a-鵝膏毒肽的試劑 盒中的應用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用selex技術得到的能夠高親和力高特異性結(jié)合α-鵝膏毒肽的核酸適配體，該核酸適配體是一種單鏈DNA，由84個核苷酸組成，其核苷酸序列如SEQ？ID？NO：1所示；其二級結(jié)構(gòu)含有突出的環(huán)和莖，存在G-四鏈體結(jié)構(gòu)，吉布斯自由能DG=-15.36；該核酸適配體通過酶聯(lián)寡核苷酸吸附試驗能特異性檢測到α-鵝膏毒肽。
【IPC分類】C12N15/115, G01N33/68
【公開號】CN105177009
【申請?zhí)枴?br>【發(fā)明人】韓芹芹, 喬璞, 宋玉竹, 張金陽, 陳強
【申請人】昆明理工大學
【公開日】2015年12月23日
【申請日】2015年8月10日