一種與α-鵝膏毒肽特異結(jié)合的核酸適配體及應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種與α -鵝膏毒肽特異結(jié)合的核酸適配體及應用，屬于生物醫(yī)學技 術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 核酸適配體是一類能與靶分子特異性、高親和力結(jié)合的寡核苷酸分子（DNAS RNA)，可通過SELEX技術(shù)，從特定的寡核苷酸庫中篩選得到。由于其具有靶分子范圍廣、分 子質(zhì)量小、免疫原性低、易于化學合成、改造和標記等優(yōu)點，核酸適配體在臨床診斷鑒定和 疾病治療等領(lǐng)域中具有重要的應用價值。
[0003] 鵝膏菌毒素（amanitin)是從毒蘑菇中分離出來的一種多肽類物質(zhì)，其中以Ct-鵝 膏毒肽的毒性最強（α-amanitin)。人若誤食含有α-鵝膏毒肽的鵝膏菌（Amanita)后， 輕者可產(chǎn)生腹瀉、腹痛、嘔吐，重者可出現(xiàn)幻覺、昏迷等多種癥狀，致死率較高。α-鵝膏毒 肽是從鵝膏菌中分離出來的一種八肽化合物，它是RNA聚合酶II的專一性抑制劑，能抑制 真核細胞RNA聚合酶II的活性，從而阻礙mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)的合成，這也是引起鵝膏毒 素中毒，導致死亡的主要因素。因此，利用SELEX技術(shù)篩選α-鵝膏毒肽的特異性核酸適配 體，進而及時、快速檢測出食用野生菌中是否含有鵝膏毒素，對于降低誤食蘑菇中毒及診斷 治療具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種與α -鵝膏毒肽特異性結(jié)合的核酸適配體，其核苷酸序 列如SEQ ID NO :1所示；該核酸適配體為單鏈DNA，由84個核苷酸組成，拓撲學結(jié)構(gòu)為直鏈 狀；預測的二級結(jié)構(gòu)具有突出的環(huán)和莖，存在G-四鏈體結(jié)構(gòu)，吉布斯自由能DG=-15. 36。
[0005] 本發(fā)明另一目的是將與α -鵝膏毒肽特異性結(jié)合的核酸適配體應用在識別α -鵝 膏毒肽或在制備檢測α-鵝膏毒肽的試劑盒中。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下： 1、 α-鵝膏毒肽特異性核酸適配體（Η06)的篩選、克隆、分離和測序 采用SELEX技術(shù)篩選出能夠與α -鵝膏毒肽特異性結(jié)合的核酸適配體群體，設(shè)計引 物進行PCR擴增、克隆、分離和測序。利用酶聯(lián)寡核苷酸吸附試驗（ELONA)進行驗證，得 到適配體Η06,它能夠高親和力高特異性的結(jié)合α-鵝膏毒肽。配體接頭引物序列為： Aptamer Fw: GACATATTCAGTCTGACAGC ;反向互補序列：CGCTGTCAGACTGAATATGTC ;Aptamer Rv: GCTAGACGATATTCGTCCATC，反向互補序列：GATGGACGAATATCGTCTAGC。所獲陽性單克隆進 行核苷酸序列測定，測序結(jié)果表明與α-鵝膏毒肽特異性結(jié)合的核酸適配體（H06)由84個 核苷酸組成，其序列（5'端至3'端）為： TGACATATTCAGTCTGACAGCGGAAGCGGGTCAGTCCAACTCACGGTCTCGGATGCACGGGAGATGGACGAAT ATCGTCTAGCA ； 2、 核酸適配體（Η06)單鏈DNA二級結(jié)構(gòu)表征 使用 MFOLD 軟件（http://mfold. rna. albany. edu/?q=mfold/DNA-Folding-Form)對與 α -鵝膏毒肽特異性結(jié)合的核酸適配體H06單鏈DNA分子進行二級結(jié)構(gòu)預測，結(jié)果表明，其 二級結(jié)構(gòu)具有突出的環(huán)和莖，存在G-四鏈體結(jié)構(gòu)，吉布斯自由能DG=-15. 36,顯示該結(jié)構(gòu)具 有較高的穩(wěn)定性；其二級結(jié)構(gòu)如下：
3、核酸適配體（H06)的特異性和對α -鵝膏毒肽的敏感性 根據(jù)核酸適配體Η06的序列，用體外轉(zhuǎn)錄方法合成生物素標記的核酸適配體，建立了 一種新型的酶聯(lián)寡核苷酸檢測方法，通過此方法對Η06的特異性和其對α -鵝膏毒肽的敏 感性進行檢測；結(jié)果顯示，Η06具有很高的特異性，其能檢測到蘑菇毒素 α-鵝膏毒肽的最 低濃度為8 ng/yL。
[0007] 本發(fā)明的意義在于： 利用SELEX技術(shù)篩選出的配體H06能夠高親和力高特異性的識別并結(jié)合α -鵝膏毒 肽；核酸適配體Η06的鑒別對于食用野生菌中α-鵝膏毒肽的檢測，進而降低α-鵝膏毒肽 對人體的侵害具有重要意義。
【附圖說明】
[0008] 圖1為本發(fā)明中⑶圓二色譜法對K+濃度與核酸適配體H06的關(guān)系的分析； 圖2為本發(fā)明中ELONA法對核酸適配體H06的特異性分析，圖中：空白對照1為α -鵝 膏毒肽+脫脂奶；空白對照2為α -鵝膏毒肽+不含配體的生物素；陰性對照1為蘇丹紅+ 標記有生物素的配體Η06 ;陰性對照2為三聚氰胺+標記有生物素的配體Η06 ;陰性對照3 為草甘膦+標記有生物素的配體Η06 ;陰性對照4為瘦肉精+標記有生物素的配體Η06 ;陰 性對照5為乙型腦炎NSl蛋白+標記有生物素的配體Η06 ;陰性對照6為乙型腦炎core蛋 白+標記有生物素的配體H06 ; α -鵝膏毒肽為α -鵝膏毒肽40 ng/ μ L +標記有生物素的 配體Η06 ; 圖3為本發(fā)明中Dot Blot法對核酸適配體Η06的特異性分析，圖中：1 :空白對照 (α -鵝膏毒肽+脫脂奶）；2 :空白對照（α -鵝膏毒肽+不含配體的生物素）；3 :陰性對照 (蘇丹紅+標記有生物素的配體Η06) ;4 :陰性對照（三聚氰胺+標記有生物素的配體Η06); 5 :陰性對照(草甘膦+標記有生物素的配體Η06);6 :陰性對照(瘦肉精+標記有生物素的配 體Η06);7 :陰性對照（乙型腦炎NSl蛋白+標記有生物素的配體Η06);8 :陰性對照（乙型腦 炎core蛋白+標記有生物素的配體Η06);9 : α -鵝膏毒肽40 ng/ μ L +標記有生物素的配 體 Η06 ; 圖4為本發(fā)明中ELONA法對核酸適配體Η06的最佳濃度的分析，圖中：空白對照1 : α -鵝膏毒肽+脫脂奶；空白對照2 : α -鵝膏毒肽+不含配體的生物素；配體Η06 : α -鵝 膏毒肽+標記有生物素的配體Η06 ; 圖5為本發(fā)明中ELONA法對α -鸛霄毒肽靈敏度的分析，圖中：空白對照1 : α -鸛霄毒 肽+脫脂奶；配體Η06 : α -鵝膏毒肽+標記有生物素的配體Η06。
【具體實施方式】
[0009] 下面結(jié)合附圖和實施例來進一步說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，實施例僅為了更好理 解本發(fā)明但不局限與本發(fā)明范圍，實施例中方法如無特殊說明均為常規(guī)方法，使用的試劑 如無特殊說明均為常規(guī)市售試劑或按常規(guī)方法配制的試劑。
[0010] 實施例1: α -鵝膏毒肽核酸適配體（Η06)的篩選 一、配基（α -鵝膏毒肽）與基質(zhì)(瓊脂糖凝膠6Β)的偶聯(lián) 1、在3 mL蒸餾水中懸浮I g的凍干粉末瓊脂糖凝膠6Β (I g凍干的粉末能夠產(chǎn)生出 大約3. 0 mL的最終的基質(zhì)體積）； 2、立即在燒結(jié)玻璃濾器中（多空度G3)用大約每克粉末200 mL的蒸餾水沖洗1小時； 3、 用6 mL的偶聯(lián)緩沖溶液（0. 05 M，pH 9. 6的碳酸鹽緩沖液)溶解6 g的配基，使其最 終濃度為I mg/mL，或者用脫鹽柱將溶解的配基轉(zhuǎn)移到偶聯(lián)緩沖溶液中，調(diào)整水相的pH值； 4、 將基質(zhì)與上述步驟3中的濃度為I mg/mL溶解好配基的緩沖溶液的比例調(diào)整為體積 比1:2,在25°C到40°C的水浴條件下，混合16 h，并且37°C搖床過夜； 5、 在40°C到50°C的條件下，用IM的氨基乙醇封閉過剩的基團，至少4 h或者過夜； 6、 用偶聯(lián)緩沖液洗過剩的配基，4000 rpm離心2 min，吸取上清；用超純水(每次7-8 mL)清洗3次；緊接著用0.1 M NaHCO3,0. 5 M NaCl，pH 8. 0的溶液清洗3-4次；然后用0. 1 M NaCl，0.1 M醋酸鹽，pH 4. 0的溶液清洗3-4次；最后用質(zhì)量百分比濃度為20%乙醇6 mL 保存，放置于4 °C冰箱，封口膜封口，豎直放置。
[0011] 二、核酸適配體文庫（ssDNA)的PCR 采用TaKaRa公司合成的ssDNA適配體文庫； 1、 94°C 預熱 PCR 儀； 2、 將 3 yL ssDNA、30.6 yL 去離子水、5 yL 10XBuffer、3 yL MgCl2、4 yL dNTP 混合物(各2.5 μΜ)、2μL正向擴增引物、2 yL反向擴增引物以及0.4 yL Taq酶離心管 進行反應。正向擴增引物序列為5 ' - GACATATTCAGTCTGACAGC-3 '，反向擴增引物序列為 5' -GCTAGACGATATTCGTCCATC-3'。
[0012] 3、在PCR儀中按以下程序擴增 (1) 預變性 94 0C 5分鐘； (2) 40個循環(huán) 94 0C 45秒鐘 58 0C 45秒鐘 72 0C 30 秒鐘； (3) 后擴增 72 0C 7分鐘。
[0013] 三、配體庫的純化、上樣及洗脫 1、配體庫的純化 (1) 核酸適配體文庫PCR產(chǎn)物直接與膠回收試劑盒里的溶液按體積比1:1比例混合，進 行DNA片段回收； (2) DNA片段回收后，95°C水浴lOmin，冰浴IOmin ;經(jīng)過此變性處理，使雙鏈DNA變成單 鏈 DNA。
[0014] 2、親和層析 (1) 用偶聯(lián)緩沖液洗脫偶聯(lián)過的基質(zhì)：先吸取上層酒精，加偶聯(lián)緩沖液至6 mL，混勻， 離心，棄去上清液，此步驟重復3次； (2) 將上述第1步中的單鏈DNA加入到偶聯(lián)過的基質(zhì)中，于37°C溫育并40 rpm輕柔轉(zhuǎn) 動2 h ; (3) 加入前述樣品到層析柱中，用2-3柱體積的超純水沖洗柱子； (4) 然后用3-4柱體積的洗脫緩沖液（0.1 M NaCl，0.1 M醋酸鹽，pH 4.0)進行線性梯 度洗脫，收集洗脫組分； (5) 洗脫組分與膠溶液等體積混合，回收后用TE溶液溶解，得到selex溶液。
[0015] 四、PCR優(yōu)化和大量擴增核酸適配體 以上述selex溶液作為模板，按如下步驟操作： 1、 94°C 預熱 PCR 儀； 2、 將5 yL 模板、28.6 yL 去離子水、5 yL 10XBuffer、3 yL MgCl2、4 yL dNTP混 合物(各2.5uM)、2 yL正向擴增引物、2 yL反向擴增引物、0.4 yLTaq酶，于PCR離心 管中進行反應。正向擴增引物序列為5' -GACATATTCAGTCTGACAGC-3'，反向擴增引物序列 為 5' -GCTAGACGATATTCGTCCATC-3'。
[0016] 3、在PCR儀中按以下程序擴增： (1) 預變性 94 °C 5分鐘； (2) 37個循環(huán)： 94 0C 45秒鐘 58 0C 45秒鐘 72 0C 30 秒鐘； (3) 后擴增 72 0C 7分鐘； 4、循環(huán)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物用TIANGEN公司的DNA產(chǎn)物純化試劑盒進行抽提回收，步 驟如下： (1) 將PCR產(chǎn)物與等體積的膜結(jié)合緩沖顛倒混勻，然后將混和液轉(zhuǎn)入離心純化柱，室 溫靜置5分鐘，使DNA充分與硅膠膜結(jié)合，12000 rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液； (2) 加入700 μL的漂洗液(含乙醇）于離心純化柱中，12000 rpm離心1分鐘，倒掉收 集管中的廢液； (3) 重復步驟（2); (4) 12000 rpm 離心 3 分鐘； (5) 將離心純化柱置于新的離心管中； (6) 加入30 PL超純水，在室溫下靜置5分鐘； (7) 12000 rpm