0. lmol/L磷酸鉀緩沖液（溶質為磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀，溶劑為水），溶質為4-香豆酰 輔酶A、丙二酰輔酶A、實施例2得到的RinPKSl溶液。250 μ L體系2中含有實施例2制備 的 RinPKSl 溶液 16mg/L、150 μ mol/L 4-香豆酰輔酶 Α，280 μ mol/L 丙二酰輔酶 Α。
[0124] 按照上述方法，將體系2中的150 μ mol/L 4-香豆酰輔酶A分別替代為75 μ mol/ L、37. 5 μ mol/L、18. 75 μ mol/L、12. 5 μ mol/L、7. 5 μ mol/L 和 2. 5 μ mol/L 4-香豆酰輔酶 A， 其他溶質和溶劑的含量均相同，分別得到體系3、體系4、體系5、體系6、體系7和體系8。
[0125] 按照上述方法，將體系2中的280 μ mol/L丙二酰輔酶A分別替代為150 μ mol/L、 75 μ mol/L、45 μ mol/L、37. 5 μ mol/L、25 μ mol/L、15 μ mol/L 和 5 μ mol/L 丙二醜輔酶 A，其 他溶質和溶劑的含量均相同，分別得到體系9、體系10、體系11、體系12、體系13、體系14和 體系15。
[0126] 2、完成步驟1后，將體系2、體系3、體系4、體系5、體系6、體系7和體系8在50°C 下反應30min測定苯亞甲基丙酮合酶（BAS)的活性，通過Lineweaver - Burke雙倒數(shù)法作 圖，求得回歸直線方程，其中直線與X軸的交點為-〇〇 \與Y軸的交點為（Vni) \同時測定 純化后的苯亞甲基丙酮合酶（BAS)的濃度，以求得^直。實驗重復3次。
[0127] 完成步驟1后，將體系2、體系9、體系10、體系11、體系12、體系13、體系14和體系 15在50°C下反應30min測定苯亞甲基丙酮合酶（BAS)的活性，通過Lineweaver-Burke雙 倒數(shù)法作圖，求得回歸直線方程，其中直線與X軸的交點為-OO \與Y軸的交點為（Vni) \ 同時測定純化后的苯亞甲基丙酮合酶（BAS)的濃度，以求得^直。實驗重復3次。
[0128] RinPKSl的苯亞甲基丙酮合酶（BAS)活性的動力學常數(shù)測定實驗結果見表4。 RinPKSl的苯亞甲基丙酮合酶（BAS)活性的動力學常數(shù)結果對樹莓中覆盆子酮的生物合成 的調控及其應用提供了應用基礎。
[0129] 表4. RinPKSl的苯亞甲基丙酮合酶（BAS)活性的反應動力學常數(shù)Kni及催化常數(shù) Kcat
[0131] 二、RinPKSl的查爾酮合酶（CHS)活性的動力學常數(shù)測定步驟如下：
[0132] 1、制備250 μ L體外酶促反應體系A，簡稱體系A，體系A的pH為7. 0,溶劑為 0. lmol/L磷酸鉀緩沖液（溶質為磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀，溶劑為水），溶質為4-香豆酰 輔酶A、丙二酰輔酶A、實施例2得到的RinPKSl溶液。250 μ L體系A中含有實施例2制備 的 RinPKSl 溶液 4mg/L、150 μ mol/L 4-香豆酰輔酶 Α，280 μ mol/L 丙二酰輔酶 A0
[0133] 按照上述方法，將體系A中的150 μ mol/L 4-香豆酰輔酶A分別替代為75 μ mol/ L、37. 5 μ mol/L、18. 75 μ mol/L、12. 5 μ mol/L、7. 5 μ mol/L 和 2. 5 μ mol/L 4-香豆酰輔酶 A， 其他溶質和溶劑的含量均相同，分別得到體系B、體系C、體系D、體系E、體系F和體系G。
[0134] 按照上述方法，將體系A中的280 μ mol/L丙二酰輔酶A分別替代為300 μ mol/L 150 μ mol/L、75 μ mol/L、50 μ mol/L、30 μ mol/L 和 10 μ mol/L 丙二醜輔酶 A，其他溶質和溶 劑的含量均相同，分別得到體系H、體系I、體系J、體系K、體系L和體系M。
[0135] 2、完成步驟1后，將體系A、體系B、體系C、體系D、體系E、體系F和體系G在40°C 下反應15min測定查爾酮合酶（CHS)的活性，通過Lineweaver - Burke雙倒數(shù)法作圖，求得 回歸直線方程，其中直線與X軸的交點為\與Y軸的交點為（Vni) \同時測定純化后的 查爾酮合酶濃度，以求得〇直。實驗重復3次。
[0136] 完成步驟1后，將體系A、體系H、體系I、體系J、體系K、體系L和體系M在40°C下 反應15min測定查爾酮合酶（CHS)的活性，通過Lineweaver - Burke雙倒數(shù)法作圖，求得回 歸直線方程，其中直線與X軸的交點為\與Y軸的交點為（Vni) \同時測定純化后的查 爾酮合酶濃度，以求得〇直。實驗重復3次。
[0137] RinPKSl的查爾酮合酶（CHS)活性的合成的動力學常數(shù)實驗測定結果見表5。 RinPKSl的查爾酮合酶（CHS)活性的合成的動力學常數(shù)分析結果對樹莓中覆盆子酮的生物 合成的調控及其應用提供了應用基礎。
[0138] 表5. RinPKSl的查爾酮合酶（CHS)活性的反應動力學常數(shù)Kni及催化常數(shù)K
【主權項】
1. 一種蛋白質，是如下a)或b)或c)的蛋白質： a) 氨基酸序列如SEQIDNo. 2所示的蛋白質； b) 在SEQIDNo. 2所示的蛋白質的N端或/和C端連接標簽得到的融合蛋白質； c) 將SEQIDNo. 2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和 /或添加得到的具有聚酮合酶的蛋白質。2. 與權利要求1所述蛋白質的相關生物材料，為下述BI)至B20)中的任一種： BI)編碼權利要求1所述蛋白質的核酸分子； B2)含有BI)所述核酸分子的表達盒； B3)含有BI)所述核酸分子的重組載體； B4)含有B2)所述表達盒的重組載體； B5)含有BI)所述核酸分子的重組微生物； B6)含有B2)所述表達盒的重組微生物； B7)含有B3)所述重組載體的重組微生物； B8)含有B4)所述重組載體的重組微生物； B9)含有BI)所述核酸分子的轉基因植物細胞系； B10)含有B2)所述表達盒的轉基因植物細胞系； B11)含有B3)所述重組載體的轉基因植物細胞系； B12)含有B4)所述重組載體的轉基因植物細胞系； B13)含有BI)所述核酸分子的轉基因植物組織； B14)含有B2)所述表達盒的轉基因植物組織； B15)含有B3)所述重組載體的轉基因植物組織； B16)含有B4)所述重組載體的轉基因植物組織； B17)含有BI)所述核酸分子的轉基因植物器官； B18)含有B2)所述表達盒的轉基因植物器官； B19)含有B3)所述重組載體的轉基因植物器官； B20)含有B4)所述重組載體的轉基因植物器官。3. 根據(jù)權利要求2所述的生物材料，其特征在于：B1)所述核酸分子為如下1)或2)或 3)所示的基因： 1) 其核苷酸序列是SEQIDNo. 1的cDNA分子或DNA分子； 2) 與1)限定的核苷酸序列具有80%或80%以上同一性，且編碼氨基酸序列為SEQID No. 2所示的蛋白質的cDNA分子或基因組DNA分子； 3) 在嚴格條件下與1)或2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼氨基酸序列為SEQIDNo. 2 所示的蛋白質的cDNA分子或基因組DNA分子。 4. C或D的應用： C、 權利要求1所述蛋白質在作為聚酮合酶的應用或在制備聚酮合酶產品中的應用； D、 權利要求2或3所述生物材料在制備聚酮合酶產品中的應用。5. 根據(jù)權利要求1所述蛋白質、權利要求2或3所述生物材料或權利要求4所述應用， 其特征在于：所述聚酮合酶為苯亞甲基丙酮合酶和/或查爾酮合酶。6. 權利要求1所述蛋白質的制備方法，包括將所述蛋白質的編碼基因在生物細胞中進 行表達得到所述蛋白質。7. 根據(jù)權利要求6所述的制備方法，其特征在于：所述蛋白質的編碼基因為如下1)或 2)或3)所示的基因： 1) 其核苷酸序列是SEQIDNo. 1的cDNA分子或DNA分子； 2) 與1)限定的核苷酸序列具有80%或80%以上同一性，且編碼氨基酸序列為SEQID No. 2所示的蛋白質的cDNA分子或基因組DNA分子； 3) 在嚴格條件下與1)或2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼氨基酸序列為SEQIDNo. 2 所示的蛋白質的cDNA分子或基因組DNA分子。8. 根據(jù)權利要求6或7所述制備方法，其特征在于：將所述蛋白質的編碼基因在生物 細胞中進行表達包括將所述蛋白質的編碼基因導入所述生物細胞。9. 根據(jù)權利要求8所述的制備方法，其特征在于：將所述蛋白質的編碼基因導入所述 生物細胞包括通過含有所述蛋白質的編碼基因的重組表達載體導入所述生物細胞得到表 達所述蛋白質的重組細胞。10. 根據(jù)權利要求6-9任一所述的制備方法，其特征在于：所述生物細胞為微生物細 胞、植物細胞或非人動物細胞。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種來源于樹莓的聚酮合酶RinPKS1及其相關生物材料與應用。聚酮合酶RinPKS1是如下a)或b)或c)的蛋白質：a)氨基酸序列如SEQ？ID？No.2所示的蛋白質；b)在SEQ？ID？No.2所示的蛋白質的N端或/和C端連接標簽得到的融合蛋白質；c)將SEQ？ID？No.2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有聚酮合酶活性的蛋白質。實驗證明，本發(fā)明提供的聚酮合酶RinPKS1具有苯亞甲基丙酮合酶活性和/或查爾酮合酶活性，其在作為聚酮合酶中的應用或在制備聚酮合酶產品中的應用中具有重要作用。
【IPC分類】C12N15/54, C12N9/10, C12N5/10, C12N15/63
【公開號】CN105176942
【申請?zhí)枴?br>【發(fā)明人】馬蘭青, 楊亞東, 趙曉萌, 郭輝力, 劉文彬, 劉歡, 張奮強, 黃麗娜
【申請人】北京農學院
【公開日】2015年12月23日
【申請日】2015年8月4日