來源于樹莓的聚酮合酶RinPKS1及其相關(guān)生物材料與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域中來源于樹莓的聚酮合酶RinPKSl及其相關(guān)生物材料 與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 樹莓（Rubus idaeus L )具有抗腫瘤、抗氧化和抗衰老等多種藥理和保健功能，已 在醫(yī)藥界和保健產(chǎn)品中廣泛使用，其果實(shí)經(jīng)炮制制成傳統(tǒng)中藥覆盆子，氣味甘、平、無毒，有 益腎固精縮尿壯陽作用。
[0003] 覆盆子酮，又名懸鉤子酮（Raspberry ketone)，化學(xué)名為4-對羥基苯基-2-丁酮， (4-(4-hydroxyphenyl)-2_butanone)，分子式為C1QH120 2。覆盆子酮在常溫下為白色針狀結(jié) 晶，其分子量為164. 20,熔點(diǎn)82-84°C，是一種經(jīng)過美國食用香料制造者協(xié)會(huì)（FEMA)和歐洲 理事會(huì)（COE)共同認(rèn)可使用的一種具有幽雅果香香韻的安全食用香料，F(xiàn)EMA編號為2588， 屬于國家海關(guān)承認(rèn)、產(chǎn)業(yè)政策鼓勵(lì)發(fā)展的高新技術(shù)產(chǎn)品，屬于具有果香味的暖香型香料，被 廣泛用于食品、化妝品及醫(yī)藥中間體的合成。覆盆子酮作為樹莓果實(shí)特征性香味物質(zhì)，但在 樹莓植物中含量很低，而且天然樹莓資源非常有限，從樹莓植物中提取天然覆盆子酮是不 經(jīng)濟(jì)的。覆盆子酮的生物合成途徑見圖1。由苯亞甲基丙酮合酶（Benzalacetone synthase， BAS)催化4-香豆酰輔酶A與丙二酰輔酶A分子反應(yīng)生成苯亞甲基丙酮（p-hydroxyphenyl but-3-ene-2-〇ne)，然后苯亞甲基丙酮在還原酶的催化下生成覆盆子酮?？梢姡絹喖谆?酮合酶是覆盆子酮生物合成途徑的關(guān)鍵酶和限速酶，也是利用基因工程技術(shù)分子調(diào)控覆盆 子酮生物合成的靶點(diǎn)。
[0004] 聚酮合酶（polyketide synthase，PKS)能催化生成一系列結(jié)構(gòu)各異、具有不同生 理活性、具有查爾酮合酶（Chalcone synthase，CHS)基本骨架的植物次生代謝產(chǎn)物，對聚 酮合酶的基因進(jìn)行調(diào)控可用于合成一些難以化學(xué)合成的新型天然化合物。近幾年來，一系 列功能不同的聚酮合酶（polyketide synthase，PKS)不斷被克隆，如查爾酮合酶、苗合酶 (Stilbene synthase，STS)、苯亞甲基丙酮合酶（benzalacetonesynthase，BAS)等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何提高覆盆子酮的產(chǎn)量。
[0006] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了一種具有聚酮合酶活性的蛋白質(zhì)，名稱 為RinPKSl，來源于樹莓（Rubus idaeus L.)，是如下a)或b)或c)的蛋白質(zhì)：
[0007] a)氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示的蛋白質(zhì)；
[0008] b)在SEQ ID No. 2所示的蛋白質(zhì)的N端或/和C端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)；
[0009] c)將SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺 失和/或添加得到的具有聚酮合酶的蛋白質(zhì)。
[0010] 其中，序列表中序列2由391個(gè)氨基酸殘基組成。
[0011] 為了使a)中的蛋白質(zhì)便于純化，可在SEQ ID No. 2所示的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧 基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。上述b)可為在SEQ ID No. 2所示的蛋白質(zhì)的N端或/ 和C端連接上如表1所示的標(biāo)簽。
[0012] 表1.標(biāo)簽的序列
[0014] 上述c)中的蛋白質(zhì)，所述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為 不超過10個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。
[0015] 上述c)中的蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。
[0016] 上述c)中的蛋白質(zhì)的編碼基因可通過將SEQ ID No. 1所示的DNA序列中缺失一 個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對的錯(cuò)義突變得到。
[0017] 與RinPKSl相關(guān)的生物材料也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0018] 本發(fā)明所提供的與RinPKSl相關(guān)生物材料，為下述BI)至B20)中的任一種：
[0019] BI)編碼RinPKSl的核酸分子；
[0020] B2)含有BI)所述核酸分子的表達(dá)盒；
[0021] B3)含有BI)所述核酸分子的重組載體；
[0022] B4)含有B2)所述表達(dá)盒的重組載體；
[0023] B5)含有BI)所述核酸分子的重組微生物；
[0024] B6)含有B2)所述表達(dá)盒的重組微生物；
[0025] B7)含有B3)所述重組載體的重組微生物；
[0026] B8)含有M)所述重組載體的重組微生物；
[0027] B9)含有BI)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；
[0028] B10)含有B2)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；
[0029] BI 1)含有B3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；
[0030] B12)含有M)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；
[0031] B13)含有BI)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物組織；
[0032] B14)含有B2)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物組織；
[0033] B15)含有B3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物組織；
[0034] B16)含有B4)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物組織；
[0035] B17)含有BI)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物器官；
[0036] B18)含有B2)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物器官；
[0037] B19)含有B3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物器官；
[0038] B20)含有M)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物器官。
[0039] 上文中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA ;所述核酸分子 也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。BI)所述核酸分子具體可為如下1)或2)或3)所示的 基因：
[0040] 1)其核苷酸序列是SEQ ID No. 1的cDNA分子或DNA分子；
[0041] 2)與1)限定的核苷酸序列具有80%或80%以上同一性，且編碼氨基酸序列為SEQ ID No. 2所示的蛋白質(zhì)的cDNA分子或基因組DNA分子；
[0042] 3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼氨基酸序列為SEQ ID No. 2所示的蛋白質(zhì)的cDNA分子或基因組DNA分子。
[0043] 其中，SEQ ID No. 1由1176個(gè)核苷酸組成，編碼SEQ ID No. 2所示的蛋白質(zhì)。
[0044] 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進(jìn)化和點(diǎn)突變的方 法，對本發(fā)明的編碼RinPKSl的核苷酸序列進(jìn)行突變。那些經(jīng)過人工修飾的，具有與本發(fā)明 分離得到的RinPKSl的核苷酸序列80%或者更高同一性的核苷酸，只要編碼RinPKSl且具 有聚酮合酶活性，均是衍生于本發(fā)明的核苷酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。
[0045] 這里使用的術(shù)語"同一性"指與天然核酸序列的序列相似性。"同一性"包括與本 發(fā)明的編碼SEQ ID No. 2所不的氣基酸序列組成的蛋白質(zhì)的核昔酸序列具有80%或更尚， 或85 %或更高，或90 %或更高，或95 %或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或 計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行評價(jià)。使用計(jì)算機(jī)軟件，兩個(gè)或多個(gè)序列之間的同一性可以用百分比（％) 表示，其可以用來評價(jià)相關(guān)序列之間的同一性。
[0046] 上述生物材料中，所述嚴(yán)格條件是在2XSSC，0. 1% SDS的溶液中，在68°C下雜交 并洗膜2次，每次5min，又于0. 5 X SSC，0. 1 % SDS的溶液中，在68°C下雜交并洗膜2次，每 次15min;或，0·lXSSPE(或0·lXSSC)、0·l%SDS的溶液中，65°C條件下雜交并洗膜。
[0047] 上述80%或80%以上同一性，可為85%、90%或95%以上的同一性。
[0048] 上述生物材料中，B2)所述的含有編碼RinPKSl的核酸分子的表達(dá)盒（RinPKSl基 因表達(dá)盒），是指能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)RinPKSl的DNA，該DNA不但可包括啟動(dòng)RinPKSl 基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，還可包括終止RinPKSl轉(zhuǎn)錄的終止子。進(jìn)一步，所述表達(dá)盒還可包括 增強(qiáng)子序列?？捎糜诒景l(fā)明的啟動(dòng)子包括但不限于：組成型啟動(dòng)子，組織、器官和發(fā)育特異 的啟動(dòng)子，和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。啟動(dòng)子的例子包括但不限于：花椰菜花葉病毒的組成型啟動(dòng) 子355:來自西紅柿的創(chuàng)傷誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，亮氨酸氨基肽酶（〃1^^〃，〇1&〇等人（1999)?1 &拉 Physiol 120:979-992);來自煙草的化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，發(fā)病機(jī)理相關(guān)I(PRl)(由水楊酸 和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羥酸S-甲酯）誘導(dǎo)）；西紅柿蛋白酶抑制劑II啟動(dòng)子（PIN2) 或LAP啟動(dòng)子（均可用茉莉酮酸甲酯誘導(dǎo)）；熱休克啟動(dòng)子（美國專利5,187,267);四環(huán) 素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子（美國專利5,057, 422);種子特異性啟動(dòng)子，如谷子種子特異性啟動(dòng)子 pF128 (CN101063139B (中國專利200710099169. 7))，種子貯存蛋白質(zhì)特異的啟動(dòng)子（例 如，菜豆球蛋白、napin，oleosin和大豆beta conglycin的啟動(dòng)子（Beachy等人（1985) EMBO J.4 :3047-3053))。它們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用。此處引用的 所有參考文獻(xiàn)均全文引用。合適的轉(zhuǎn)錄終止子包括但不限于：農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶終止子 (N0S終止子）、花椰菜花葉病毒CaMV 35S終止子、tml終止子、豌豆rbcS E9終止子和胭脂 氨酸和章魚氨酸合酶終止子（參見，例如：〇dell等人（I9S5)Nature313:810 ;Ro