一種來源于鈍齒棒桿菌的2,3-丁二醇脫氫酶或乙偶姻還原酶的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程和酶工程領(lǐng)域，具體涉及一種來源于鈍齒棒桿菌的2, 3- 丁 二醇脫氫酶（乙偶姻還原酶）。
【背景技術(shù)】
[0002] 3-羥基丁酮（又名乙偶姻）是一種重要的風(fēng)味物質(zhì)和平臺化合物，在食品、化工、 醫(yī)藥等行業(yè)具有廣泛的用途。自然界很多微生物都可以代謝生產(chǎn)乙偶姻，目前用來發(fā)酵 生廣2, 3- 丁二醇的微生物主要是細囷類，包括克雷伯氏囷屬（Klebsiella)、牙抱桿囷屬 (Bacillus)、腸桿菌屬（Enterobacter)和沙雷氏菌屬（Serratia)等。雖然自然界有很多 菌株都可以合成乙偶姻，但是在這些菌株中乙偶姻往往是作為2, 3- 丁二醇的副產(chǎn)物存在。 而且以上菌株有些屬于致病菌株，無法用于工業(yè)上的大規(guī)模生產(chǎn)。
[0003] 2, 3- 丁二醇脫氫酶，又稱乙偶姻還原酶。隸屬于氧化還原酶，催化2, 3- 丁二醇和 乙偶姻之間的相互轉(zhuǎn)化，能夠在NADH存在的情況下催化乙偶姻生成2, 3- 丁二醇，同時在 NAD+存在的情況下催化2, 3-丁二醇可逆形成乙偶姻。在鈍齒棒桿菌中并未見2, 3-丁二醇 脫氫酶及其相關(guān)性質(zhì)的研究。鈍齒棒桿菌Corynebacterium crenatum SYPA5-5是一種從 土壤中分離并經(jīng)紫外誘導(dǎo)獲得的安全的，需氧的，革蘭氏陽性，不產(chǎn)孢子的，組氨酸營養(yǎng)缺 陷型的工業(yè)細菌。本發(fā)明中所用的C. crenatum SYPA 5-5通過16S rDNA鑒定后，其與谷氨 酸棒桿菌 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 同源性達 99. 4%。
[0004] 本發(fā)明通過表達載體pET_28a(+)，實現(xiàn)2, 3-丁二醇脫氫酶基因在大腸桿菌 E. coli BL21中進行表達，并通過利用Ni-NTA親和層析方法純化得到純酶，進行酶學(xué)性質(zhì) 研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是鑒定鈍齒棒桿菌中的2, 3- 丁二醇的脫氫酶，并對其酶學(xué)性質(zhì)進 行研究
[0006] 本發(fā)明獲得的2, 3 丁二醇脫氫酶基因（butA)，包含有777bp的基因，編碼一個由 258個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。
[0007] 本發(fā)明還提供用于表達上述2, 3- 丁二醇脫氫酶基因的重組表達質(zhì)粒，是將序列 為SEQ ID NO. 2的核苷酸片段插入到原核表達載體上構(gòu)建的。所述的原核表達載體為 pET_28a(+)〇
[0008] 本發(fā)明還涉及攜帶有表達上述2, 3-丁二醇脫氫酶的重組表達質(zhì)粒的重組菌 E.coli BL21/pET-28a(+)-butA〇
[0009] 本發(fā)明提供了一種來源于鈍齒棒桿菌的2, 3- 丁二醇脫氫酶，所述2, 3- 丁二醇 脫氫酶最適作用溫度為35°C，對溫度比較敏感，在高于35°C的溫度下酶活力迅速下降，在 40°C基本檢測不到酶活；最適反應(yīng)pH氧化方向為10. 0,還原方向為4.0 ;雙乙酰是除了乙 偶姻之外，2, 3- 丁二醇脫氫酶還原方向重要的底物之一。
【具體實施方式】
[0010] 實施例1 :2, 3- 丁二醇脫氫酶引物設(shè)計
[0011] 根據(jù)NCBI谷氨酸棒狀桿菌全基因組核酸序列中butA基因序列，設(shè)計2, 3- 丁二醇 脫氫酶基因的PCR引物Pl和P2。
[0012] Pl :5' -ACCGGAATTCATGAGCAAAGTTGCAATGGT-3'（EcoR I)
[0013] P2 :5' -ACCGAAGCTTCTAGTTGTAGAGCATGCCGC-3' （Hind III)
[0014] 實施例2 :2, 3- 丁二醇脫氫酶基因的克隆
[0015] 以Corynebacterium crenatum SYPA5-5總DNA為模板，利用上面提供的引物做 PCR擴增，擴增條件為：94°C預(yù)變性，5min，一個循環(huán)；94°C變性，lmin，57°C退火，lmin，72°C 延伸，90s，30個循環(huán)；72°C，10min，一個循環(huán)；15°C，10min，一個循環(huán)。PCR擴增體系：模 板2yL，上下游引物各0.5yL，dNTP Mix 4yL，10XEx Taq Buffer 5yL，滅菌的雙蒸水 37yL，Ex Taq DNA聚合酶lyL。采用凝膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進行純化和回收，電泳檢 驗回收產(chǎn)物的濃度?；厥债a(chǎn)物存放在1.5mL的離心管中，-20°C冰箱保存?zhèn)溆??；厥债a(chǎn)物 與PMD18-T Vector連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coil JM109,轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布含氨芐青霉素的LB平 板，經(jīng)37°C培養(yǎng)過夜，挑取菌落到IOmL液體LB培養(yǎng)基中，37°C搖床過夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，命 名為pMD18-T-butA，經(jīng)酶切驗證連接成功后，加入甘油至終濃度15%~20% (w/v)，-40°C 冰箱保藏。
[0016] 實施例3 :重組質(zhì)粒pET-28a(+)-butA在大腸桿菌BL21中的構(gòu)建
[0017] 提取保存于 E. coli JM109 中的質(zhì)粒 pMD18-T-butA 和 pET-28a(+)，并分別用 EcoR I和HindIII進行雙酶切，利用凝膠回收試劑盒回收后進行連接，連接體系：目的基因酶切 產(chǎn)物 7 μ L，pET-28a (+)酶切產(chǎn)物 1 μ L，T4DNA 連接酶 buffer 1 μ L，T4DNA 連接酶 1 μ L，16°C 過夜連接。將連接好的重組質(zhì)粒pET-28a(+)-butA轉(zhuǎn)化到感受態(tài)E. coil BL21，用卡那霉素 LB平板，挑取陽性菌落。37°C搖床過夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，命名為pET-28a (+)-butA，酶切驗 證正確后，加入甘油至終濃度15%~20% (w/v)，-40°C冰箱保藏備用。
[0018] 實施例4 :重組菌E. coli BL21/pET-28a(+)-butA 2, 3- 丁二醇脫氫酶活力測定
[0019] 將實施例3中構(gòu)建的重組菌E. coli BL21/pET-28a(+)-butA與原始菌E. coli BL21分別接種于IOmL含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，200rpm，37°C振蕩培養(yǎng)8h，按1%的接種 量轉(zhuǎn)接于LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至菌體OD值達0. 6時加0. 5mM的IPTG進行誘導(dǎo)7h，然后 取發(fā)酵液于4°C，lOOOOr/min離心10min，pH7. 0的磷酸鈉緩沖液清洗3次，懸浮在pH 7. 0 的50mM磷酸鈉緩沖液（含0.1 mM β -巰基乙醇，2 μ g/ml PMSF)中，超聲波破碎處理制備粗 酶液。
[0020] 酶活力測定緩沖體系：
[0021] 乙偶姻還原酶：0. 05M乙偶姻，50mM磷酸鈉緩沖液pH 4. 0, 5mM NAD+ ;
[0022] 2, 3- 丁二醇脫氫酶：0· IM 2, 3- 丁二醇，50mM 磷酸鈉緩沖液 pH 10. 0, 5mM NADH ;
[0023] 結(jié)果表明重組菌E. coli BL21/pET-28a(+)-butA中2, 3- 丁二醇脫氫酶還原方向 的比酶活為0. 44U/mg，氧化方向的比酶活為0. 07U/mg。
【主權(quán)項】
1. 一種2, 3- 丁二醇脫氫酶，又稱乙偶姻還原酶，其特征在于所述酶的氨基酸序列為 SEQIDNO. 1。2. 如權(quán)利要求1所述的2, 3- 丁二醇脫氫酶，其特征在于來源于Corynebacterium crenatumSYPA5-5,所述酶的基因序列為SEQIDN0.2。3. -種重組表達質(zhì)粒，其特征在于所述的重組表達質(zhì)粒攜帶有權(quán)利要求2所述的基 因，原核表達載體為pET-28a(+)。4. 一種重組大腸桿菌基因工程菌，其特征在于包含權(quán)利要求3所述的重組表達質(zhì)粒。
【專利摘要】一種來源于鈍齒棒桿菌中的2,3-丁二醇脫氫酶(乙偶姻還原酶)的鑒定，屬于基因工程和酶工程領(lǐng)域。本發(fā)明提供了一種2,3-丁二醇脫氫酶，其氨基酸序列為SEQ？ID？NO.1，本發(fā)明通過表達載體pET-28a(+)，實現(xiàn)2,3-丁二醇脫氫酶基因在大腸桿菌E.coli？BL21中進行表達，結(jié)果表明重組大腸桿菌中2,3-丁二醇脫氫酶還原方向的比酶活為0.44U/mg，氧化方向的比酶活為0.07U/mg。
【IPC分類】C12N15/70, C12R1/19, C12N15/53, C12N9/04, C12N1/21
【公開號】CN105176941
【申請?zhí)枴?br>【發(fā)明人】饒志明, 趙曉靜, 張顯, 李欣, 楊套偉, 徐美娟
【申請人】江南大學(xué), 江南大學(xué)（如皋）食品生物技術(shù)研究所, 如皋江大食品生物技術(shù)研究所有限公司
【公開日】2015年12月23日
【申請日】2015年8月24日