一種通過基因工程構(gòu)建的短小芽胞桿菌CotA漆酶的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種底物特異性提高的短小芽胞桿菌CotA漆酶突變體，屬于基因工 程和酶工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 漆酶（laccase，E. C. 1. 10. 3. 2)是一種含銅多酚氧化酶，能催化酚類物質(zhì)的氧化 還原反應(yīng)，在木質(zhì)素及其前體類似物的生物降解中發(fā)揮重要作用。漆酶的氧化底物極為廣 泛，包括酚類及其衍生物、芳胺及其衍生物、芳香羧酸及其衍生物等，因此漆酶應(yīng)用潛力巨 大。在木材加工領(lǐng)域，漆酶能代替化學(xué)膠合劑，不但能提高產(chǎn)品質(zhì)量，而且能減輕對人體健 康的傷害及對環(huán)境的污染；在造紙工業(yè)中，漆酶用于紙張生物漂白和制漿，可減少制漿造紙 廠的污染，有助于造紙業(yè)最終實現(xiàn)清潔生產(chǎn)；在食品加工領(lǐng)域，漆酶可用于除去果汁中酚類 化合物引起的混濁，從而提高果汁的質(zhì)量。此外，漆酶還可氧化氯酚及其衍生物，降低其毒 性，減少以氯酚類為工業(yè)原料生產(chǎn)染料、防腐劑、除草劑、殺蟲劑等化工產(chǎn)品而造成的環(huán)境 污染。
[0003] 漆酶按來源不同可分為三大類：植物漆酶、真菌漆酶和細(xì)菌漆酶。細(xì)菌漆酶包括芽 胞桿菌屬的CotA蛋白、海單胞菌的PpoA蛋白、大腸桿菌的CueO蛋白、灰色鏈霉菌的EpoA 蛋白等，與真菌及植物漆酶蛋白結(jié)構(gòu)相似，都具有4個銅離子結(jié)合位點。
[0004] 本實驗室前期已從自行篩選的短小芽胞桿菌菌株W3 (Bacillus pumilus W3)中克 隆并重組表達(dá)了 CotA漆酶，研究發(fā)現(xiàn)該CotA漆酶相對其它種類漆酶具備以下優(yōu)點：堿性 PH下酶活性高、耐高溫且熱穩(wěn)定性好、能耐受高濃度有機溶劑及鹵素離子環(huán)境等，這些優(yōu)良 特性正是目前漆酶在印染廢水處理領(lǐng)域進行工業(yè)化應(yīng)用所急需的。然而，野生短小芽胞桿 菌CotA漆酶天然表達(dá)量很低，且底物專一性差，酶催化活性較低，成為工業(yè)化應(yīng)用的瓶頸。 因此本發(fā)明利用基因工程和酶工程手段，提高短小芽胞桿菌CotA漆酶對特定底物的專一 性，進一步提高其工業(yè)化應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供了一種短小芽胞桿菌漆酶突變體，該突變體以本實驗室前期構(gòu)建的 pColdll-CotA質(zhì)粒為模板，將野生型漆酶第386位亮氨酸（Leu，L)突變?yōu)樯彼幔═rp， W)，隨后以野生型CotA漆酶為對照，驗證該突變體對底物2, 2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻 唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS)的專一性是否提高。
[0006] 所述B. pumilus CotA漆酶的親本氨基酸序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中的B. pumilus CotA 漆酶氨基酸序列一致（由本實驗室提交，GenBank登錄號：KF040050)。
[0007] 所述突變體是將野生型CotA漆酶氨基酸序列中第386位的Leu突變成了 Trp，命 名為L386W
【附圖說明】
[0008] 圖I :野生短小芽胞桿菌CotA漆酶三維模擬結(jié)構(gòu)圖
[0009] 圖2 :野生短小芽孢桿菌CotA漆酶及突變體純酶SDS-PAGE電泳圖。注1 :野生型 細(xì)菌全細(xì)胞蛋白；2 :野生型漆酶純化條帶；3 :L386W突變體漆酶純化條帶；M :蛋白分子量 標(biāo)準(zhǔn)
[0010] 圖3 :構(gòu)建突變體質(zhì)粒過程的分子操作原理示意圖
【具體實施方式】
[0011] 在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非有另外說明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常 理解的含義。
[0012] 下面結(jié)合具體的制備實施例和應(yīng)用實施例，并參照數(shù)據(jù)進一步詳細(xì)地描述本發(fā) 明。應(yīng)理解，這些實施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0013] 在以下的實施例中，未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。
[0014] 實施例1野生短小芽胞桿菌CotA漆酶的表達(dá)與純化。
[0015] 從甘油管接種前期構(gòu)建的重組表達(dá)菌株CotA/pColdII/BL21 (DE3)于LB液體培養(yǎng) 基（含100mg/L氨節(jié)青霉素）過夜培養(yǎng)，按2 %接種量將種子接入LB液體發(fā)酵培養(yǎng)基（含 100mg/L氨芐青霉素）。大腸桿菌在37°C培養(yǎng)2h后，加入0. 3mM終濃度的IPTG進行誘導(dǎo)， 并在15°C搖床繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)24h后，將發(fā)酵液于4°C、8000rpm離心10min去除上清，收集 菌體。將收集的菌體用磷酸鹽緩沖液重懸，重懸后用超聲波細(xì)胞破碎儀將菌體破碎釋放胞 內(nèi)蛋白，破碎完成后，將破碎的液體于4°C、8000rpm離心10min收集上清。收集的上清用于 CotA漆酶蛋白純化。
[0016] 由于重組表達(dá)的CotA漆酶蛋白帶有多聚組氨酸標(biāo)簽（His6. tag)，因此使用鎳離子 親和層析方法分離目標(biāo)蛋白。鎳離子親和層析純化步驟：（1)平衡：用10倍柱體積的20mM 緩沖液（含5mM的咪唑）平衡HisTrap HP鎳離子柱（ImL) ; (2)上樣：預(yù)先處理好的樣品 以lmL/min的流速上樣；（3)洗脫：用高濃度咪唑進行梯度洗脫，收集洗脫條件下峰型對應(yīng) 的管號，并做酶活檢測。最終獲得純化好的野生型CotA漆酶。
[0017] 實施例2 CotA漆酶突變體構(gòu)建并制備
[0018] ⑴定點突變
[0019] 以前期構(gòu)建的含有B. pumilus CotA漆酶基因的重組質(zhì)粒pColdll-CotA為模板， 將漆酶中第386位的亮氨酸（Leu)突變?yōu)樯彼幔═rp)，命名為L386W。
[0020] 引入L386W突變的定點突變引物為：
[0021] 正向引物 5' -TATGGGCGCCCTATTT迎TTACTAGATAAC-3'（下劃線為突變位點）
[0022] 反向引物 5' -￡￡AAATAGGGCGCCCATATTTATCTTGTGT-3'（下劃線為突變位點）
[0023] 利用上述引物，以重組質(zhì)粒pColdll-CotA為模板，進行PCR反應(yīng)。反 應(yīng)均在50 μ L體系中進行，反應(yīng)條件為：95 °C預(yù)變性3min，隨后進行25個循環(huán) (95°C 20s，57°C 20s，72°C 6min)，循環(huán)后 72°C延伸 7min，最后 4°C保溫。取 10 μ L PCR 產(chǎn)物 經(jīng)I %瓊脂糖凝膠電泳檢測。檢測到有目的產(chǎn)物后加1 μ L DMT酶于剩余的PCR產(chǎn)物中，混 勻，37°C孵育1小時。將孵育處理后的產(chǎn)物全部經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離、切膠，用凝膠回 收試劑盒回