一種含有非天然氨基酸的漆酶、制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種含有非天然氨基酸的漆酶、制備方法及 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 漆酶（EC 1. 10. 3. 2)是一種含銅多酚氧化酶，在自然界中廣泛存在。漆酶能夠催 化多達250種不同的底物的氧化，包括酚類物質(zhì)、多酚類物質(zhì)、苯硫酚、多胺、生物色素、木 質(zhì)素、染料大分子芳香化合物等。伴隨著底物的氧化，漆酶可以將分子氧還原為水，不會產(chǎn) 生過氧化氫和活性氧等有害的中間產(chǎn)物。漆酶較寬松的底物特異性以及綠色環(huán)保的催化性 能，使其在紡織、造紙、環(huán)保、家具制造和食品生產(chǎn)等行業(yè)具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0003]目前我國市場上成熟的漆酶均為真菌來源的漆酶。由于真菌漆酶需要進行翻譯后 修飾，只能依靠篩選高產(chǎn)菌株自身表達或者使用真核表達系統(tǒng)進行重組表達，存在著生產(chǎn) 周期長、產(chǎn)量低、成本高等缺點，嚴(yán)重限制了漆酶的大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。
[0004] 相比現(xiàn)有的真菌漆酶，大腸桿菌漆酶CueO具有無需翻譯后修飾、熱穩(wěn)定性好、可 大規(guī)模重組表達、生產(chǎn)周期短、產(chǎn)量高、成本低等優(yōu)勢，因此成為真菌漆酶的良好替代者。但 是CueO也存在著多酚氧化酶酶活較低和酶活依賴外源銅離子等，如果能解決CueO的這些 問題，將大大推動漆酶的大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。
[0005] 基因密碼子擴展技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一項蛋白修飾技術(shù)，利用琥珀終止密碼 子來編碼多種非天然氨基酸并在生物活體內(nèi)將非天然氨基酸定點插入蛋白中。目前這一技 術(shù)已經(jīng)將超過50種的非天然氨基酸成功地定點表達在活體細(xì)胞的蛋白質(zhì)當(dāng)中，并賦予了 這些蛋白質(zhì)各種新穎的物理、化學(xué)和生理性質(zhì)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明是針對現(xiàn)有技術(shù)和產(chǎn)品的不足，利用基因密碼子擴展技術(shù)，將可以結(jié)合銅 的非天然氨基酸定點插入到漆酶CueO中，從而提高漆酶CueO對銅離子的親和力，并進而提 高漆酶CueO的漆酶酶活，改善漆酶CueO的外源銅離子依賴性。
[0007] 本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0008] -種含非天然氨基酸的漆酶CueO突變體，所述漆酶CueO的氨基酸序列為SEQ ID NO: 1 ;所述漆酶CueO突變體為漆酶CueO的第106位的谷氨酸、第132位的天冬氨酸、第144 位的谷氨酰胺、第147位的賴氨酸、第354位的絲氨酸、第355位的甲硫氨酸、第408位的天 冬酰胺和第412位的甘氨酸中至少一個位點突變?yōu)榉翘烊话被帷?br>[0009] 進一步的改進，所述非天然氨基酸為3 -吡唑酪氨酸（PyTyr)或8 -羥基喹啉丙氨 酸（HqAla)。
[0010] 其中，3 -吡唑酪氨酸的結(jié)構(gòu)如下圖所示：
[0011] CN 105176939 A 說明書 2/5 頁
[0012] 其中，8 -羥基喹啉丙氨酸的結(jié)構(gòu)如下圖所示：
[0014] 進一步的改進，所述漆酶CueO突變體于大腸桿菌中表達。
[0015] -種利用表達漆酶CueO突變體的方法，包括如下步驟：
[0016] 1)根據(jù)漆酶CueO的氨基酸序列和蛋白空間結(jié)構(gòu)，選擇突變位點；
[0017] 2)使用定點突變PCR技術(shù)，將選定的突變位點的密碼子突變?yōu)榻K止密碼子；
[0018] 3)將突變的漆酶CueO基因序列構(gòu)建到pET - 28c表達載體上；
[0019] 4)將漆酶CueO突變體表達載體與可特異性引入3 -吡唑酪氨酸的輔助質(zhì)粒 pEVOL - tRNA - PyTyrRS或8 -羥基喹啉丙氨酸的輔助質(zhì)粒pEVOL - tRNA - HqAlaRS共同轉(zhuǎn) 化大腸桿菌BL21 (DE3)，在培養(yǎng)基中添加 IPTG、阿拉伯糖和非天然氨基酸進行CueO突變體 的誘導(dǎo)表達；
[0020] 5)將表達有目的蛋白的大腸桿菌收集后，超聲破碎，并親和純化得到含非天然氨 基酸的漆酶CueO突變體。
[0021] 進一步的改進，所述終止密碼子為琥珀密碼子TAG。
[0022] 進一步的改進，突變的漆酶CueO基因序列由SEQ ID NO: 2中第316~318位的 GAA，第 394 ~396 位 GAT，第 430 ~432 位的 CAG，第 439 ~441 位的 AAA，第 1060 ~1062 位的TCT，第1063~1065位的ATG，第1222~1224位的AAC，第1234~1236位的GGT中 的至少一個替換為TAG形成。
[0023] -種含非天然氨基酸的漆酶CueO突變體于降解苯并芘的應(yīng)用。
[0024] 與現(xiàn)有的技術(shù)相比，本發(fā)明中的漆酶CueO有如下優(yōu)點：
[0025] 大腸桿菌漆酶CueO雖有無需翻譯后修飾、熱穩(wěn)定性好、可大規(guī)模重組表達、生產(chǎn) 周期短、產(chǎn)量高、成本低等優(yōu)勢，但也存在著多酚氧化酶酶活較低和酶活依賴外源銅離子等 影響CueO大規(guī)模應(yīng)用的缺點。大量的研究表明，CueO酶活低可能與其蛋白結(jié)構(gòu)內(nèi)Cu離子 占有率不高有關(guān)。因此，目前對CueO的定向改造主要是通過分析CueO的空間結(jié)構(gòu)，對Cu 離子附近的氨基酸進行突變，篩選出高酶活的CueO突變體。但由于天然氨基酸對Cu離子 的結(jié)合能力一般，目前CueO的酶活提高都不能令人滿意。本發(fā)明通過基因密碼子擴展技術(shù) 將結(jié)合銅的非天然氨基酸定點插入到漆酶CueO中，提高了 CueO對銅離子的親和力，增加了 CueO內(nèi)部Cu離子的占有率，并進而提高了 CueO的漆酶酶活，改善了 CueO的外源銅離子依 賴性。
【附圖說明】
[0026] 為了使本發(fā)明的內(nèi)容更容易被清楚的理解，下面根據(jù)本發(fā)明的具體實施例并結(jié)合 附圖，對本發(fā)明作進一步詳細(xì)的說明，其中：
[0027] 圖1為CueO的晶體結(jié)構(gòu)示意圖，T1/T2/T3/T4分別表示CueO中發(fā)揮不同功能的 四個Cu離子；
[0028] 圖2為根據(jù)實施例3得到的CueO - M355 - HqAla及CueO - WT的重組表達SDS - PAGE電泳圖，其中：1為蛋白marker，2為CueO - M355 - HqAla，3為CueO - WT，箭頭所示即 為大腸桿菌漆酶M355突變體及野生型；
[0029] 圖3為根據(jù)實施例4得到的CueO各突變體的酶活檢測結(jié)果；
[0030] 圖4為根據(jù)實施例5得到的CueO突變體降解苯并芘的結(jié)果。
【具體實施方式】
[0031] 如下采用【具體實施方式】對本發(fā)明的技術(shù)方案進行進一步詳細(xì)說明，但應(yīng)當(dāng)理解本 發(fā)明技術(shù)方案不限于以下所列舉【具體實施方式】，任何根據(jù)本發(fā)明的原理所做的改變或替代 都應(yīng)當(dāng)落入本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
[0032] 本發(fā)明的說明書，尤其是實施例中所使用的材料、試劑、裝置等，如沒有特別地指 出，均是從商業(yè)可購得的或本領(lǐng)域常規(guī)使用的。
[0033] 實施例1 CueO突變體的構(gòu)建
[0034] 根據(jù)PDB數(shù)據(jù)庫中CueO的晶體結(jié)構(gòu)信息（PDB ID :1N68,見圖1)，分析可能與Tl/ T2/T4銅離子發(fā)生相互作用的氨基酸殘基，選定漆酶CueO突變體由漆酶CueO的第106位 的谷氨酸、第132位的天冬氨酸、第144位的谷氨酰胺、第147位的賴氨酸、第354位的絲氨 酸、第355位的甲硫氨酸、第408位的天冬酰胺和第412位的甘氨酸，這幾個突變位點。
[0035] 根據(jù)CueO的DNA序列（SEQ ID NO: 2)，分別設(shè)計能夠使上述突變位點密碼子突變 為琥珀密碼子的引物，具體引物序列如下表所示。
[0036] 表1:突變引物列表
CN 105176939 A 兄明干ι 4/5 頁
[0038] 利用定點突變PCR技術(shù)，以野生型CueO的DNA序列為模板，將E106、D132、Q144、 K147、S354、M355、N408和G412這幾個位點的密碼子突變?yōu)殓昝艽a子TAG。
[0039] 將PCR得到的CueO突變體DNA分別插入pET - 28c質(zhì)粒（Novagen，購自Merck Millipore)，得到突變體表達載體，測序驗證突變成功。
[0040] 實施例2特異性引入非天然氨基酸輔助質(zhì)粒的獲得
[0041] 根據(jù)發(fā)明人之前提交的發(fā)明專利"3 -吡唑基酪氨酸翻譯系統(tǒng)及其應(yīng)用"（公開號 CN103571804A)和"8 -羥基喹啉丙氨酸翻譯系統(tǒng)及其應(yīng)用"（公開號CN104059891A)，獲得 可特異性引入3 -吡唑酪氨酸的輔助質(zhì)粒pEVOL - tRNA - PyTyrRS和可特異性引入8 -羥基 喹啉丙氨酸的輔助質(zhì)粒pEVOL - tRNA - HqAl