PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John Wiley&Sons，化W York,1987and periodic updates ;the series METHODS IN ENZYMOLOGY,Academic Press,San Diego；Wolffe,CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Iliird edition, Academic Press, San Diego, 1998 !METHODS IN ENZYMOLOGY， Vol. 304,Chromatin(P. M. Wassarman and A. P. Wolffe，eds. ),Academic Press，San Diego， 1999;和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, C虹omatin Protocols (P.B. Becker, ed.)Humana Press, Totowa，1999等。
[0107] 本發(fā)明中使用的儀器裝置及其試劑均為常規(guī)使用的儀器裝置及試劑，均可從市場 上購買獲得。
[010引 實施例1
[0109] 取18~24月齡新鮮牛跟腫，剔除筋膜，用純化水沖洗3次，每次4min，然后成束整 裝冰凍，冰凍在低溫冰箱中進行，冰凍溫度為-20至-40°C，冰凍時間> 12h，并避免反復(fù)凍 融。用切片機將凍好的跟腫束切成0.5mm的薄片。稱取牛跟腫薄片40g，用1% (m/V)碳酸 氨鋼的75% (V/V)乙醇水溶液作為除脂液浸泡3次，浸泡時間為20min后除去脂肪，純化水 沖洗3次，時間4min至抑與純化水接近為中性。
[0110] 取上述經(jīng)處理的跟腫片分散于化純化水中，調(diào)整抑為8. 0,加入終濃度為0. 1% 的膜蛋白酶，在37°C的反應(yīng)溫度中反應(yīng)化，純化水沖洗3次，時間4min至抑與純化水接近 為中性。
[011U 然后加入0. 5M醋酸溶液2000血浸泡，溶脹30min后，采用組織搗碎機分散，加入 胃蛋白酶2g，在16°C條件下酶解72h，期間每隔Ih攬拌器攬拌lOmin。反應(yīng)完成后采用壓 濾器壓濾，條件為：壓力0. 2MPa，篩網(wǎng)為120目，收集濾液。
[0112] 配制20 %硫酸鋼500血，加入上述濾液，緩慢攬拌5min，靜置1化后收集沉淀，并將 沉淀物在4°C離屯、力為5000g下離屯、lOmin，收集沉淀物A。
[0113] 再加水重溶沉淀物A，沉淀物A與水加入的質(zhì)量之比為1 :5,完全溶解后緩慢滴 加氨水溶液，調(diào)節(jié)抑至6. 5,靜置1化后，將自組裝后的產(chǎn)物4°C下離屯、lOmin，離屯、力為 5000g，收集沉淀加純化水清洗10-20min后，靜置lOmin，在離屯、力為5000g、4°C條件下離屯、 收集沉淀物B，重復(fù)3次。
[0114] 將清洗后的沉淀物B中加入0. 05M醋酸水溶液，配制成2mg/mL的溶液，在Akata 蛋白純化系統(tǒng)，Superdex-200凝膠柱中純化，純化完成后收集液體。
[0115] 將收集的純化產(chǎn)物裝入透析袋中，放入0.OIM憐酸氨二鋼溶液透析1化后，更換透 析外液為純化水，每隔地?fù)Q水一次，直至透析袋中原液抑與純化水抑接近為中性。透析 完成后，將透析外液換為2%聚乙二醇水溶液（分子量為十萬），透析1化脫水濃縮，測定透 析袋中膠原蛋白濃度，調(diào)節(jié)膠原原液濃度為lOmg/mL。
[0116] 將原液倒入31化不誘鋼盤中鋪平，開啟凍干機預(yù)凍將凍干盤轉(zhuǎn)移至凍干機中，并 開始凍干程序進行凍干，其中，預(yù)凍溫度為-45°C，預(yù)凍時間為化；冷凍干燥時間為4她。得 到膠原蛋白海綿樣品1#，其厚度為2-5mm。
[0117] 制備過程中的相關(guān)數(shù)據(jù)圖表如下：膠原蛋白溶液進行層析純化，見圖1，由圖1顯 示收集峰值蛋白獲得純化膠原蛋白的過程。將膠原蛋白提取步驟中的樣品進行SDS-PAGE 電泳檢測，具體結(jié)果見圖2,由圖2可知膠原蛋白在提取過程純度不斷提高。將膠原蛋白進 行凝膠電泳檢測，具體結(jié)果見圖3,由圖3可知本發(fā)明提取的膠原蛋白純度非常高，其純度 > 99 %。由圖4可知，膠原蛋白海綿表面平整細(xì)膩，孔徑大小均勻，質(zhì)地柔軟，富有彈性，可 彎折180°。將膠原蛋白海綿樣品1#進行掃描電鏡測試，具體結(jié)果見圖5,由圖5可知膠原 蛋白海綿孔徑大小較為均勻，孔徑為50-350ym，孔隙率高。膠原蛋白海綿樣品1#進行透射 電鏡測試，具體結(jié)果見圖6,由圖6可知膠原蛋白具有周期性橫紋結(jié)構(gòu)，具有生物活性。將膠 原蛋白海綿樣品1#進行細(xì)胞毒性試驗，具體結(jié)果見圖7,由圖7可知膠原蛋白海綿無細(xì)胞毒 性。由上述圖表數(shù)據(jù)可知，本發(fā)明中制備方法制備的膠原蛋白海綿具有優(yōu)異的性能。
[om] 實施例2
[011引取18~24月齡新鮮牛跟腫，剔除筋膜，純化水沖洗5次，時間5min，然后成束整 裝冰凍，冰凍在低溫冰箱中進行，冰凍溫度為-20至-40°C，冰凍時間為12h，并避免反復(fù)凍 融。用切片機將凍好的跟腫束切成0.5mm的薄片，稱取牛跟腫40g，用1% (m/V)碳酸氨鋼 的75% (V/V)乙醇水溶液作為除脂液浸泡5次，浸泡時間為30min后除去脂肪，純化水沖洗 5次，每次5min至抑與純化水接近為中性。
[0120] 取上述經(jīng)處理的跟腫片分散于IL純化水中，調(diào)整抑至8. 2,加入終濃度為0. 1% 的膜蛋白酶，在40°C的反應(yīng)溫度中反應(yīng)化，純化水沖洗5次，每次5min至抑與純化水接近 為中性。
[012。 然后加入0.OlM鹽酸溶液2000血浸泡，溶脹30min后，采用組織搗碎機分散，加入 胃蛋白酶2g，在16°C條件下酶解72h，期間每隔Ih攬拌器攬拌lOmin。反應(yīng)完成后采用離 屯、機在4°C離屯、力為5000g下lOmin，收集濾液。
[0122] 配制20 %硫酸鋼500血，加入上述濾液，緩慢攬拌5min，靜置1化后收集沉淀，并將 沉淀物在4°C下lOmin，離屯、力為5000g，收集沉淀物A。
[0123] 加水重溶沉淀，沉淀物A與水加入的質(zhì)量之比為1 :1，完全溶解后緩慢滴加氨氧化 鋼水溶液，調(diào)節(jié)抑至6. 5,靜置1化后，將自助裝后的產(chǎn)物4°C離屯、力為5000g下離屯、lOmin， 收集沉淀加純化水清洗10-20min后，靜置lOmin，在離屯、力為5000g、4°C條件下離屯、收集沉 淀物B，重復(fù)3次。
[0124] 將清洗后的沉淀物B中加入0. 05M醋酸水溶液進行溶解，配制成2mg/mL的溶液， 在Akata蛋白純化系統(tǒng)，Superdex-200凝膠柱中純化，純化完成后收集液體。
[0125] 將收集的純化產(chǎn)物裝入透析袋中，放入0.OIM憐酸氨二鋼溶液透析1化后，更換透 析外液為純化水，每隔地?fù)Q水一次，直至透析袋中原液抑與純化水抑接近為中性。透析 完成后，將透析外液換為2%聚乙二醇水溶液（分子量為十萬），透析1化脫水濃縮，測定透 析袋中膠原蛋白濃度，調(diào)節(jié)膠原原液濃度為lOmg/mL。
[0126] 將原液倒入31化不誘鋼盤中鋪平，開啟凍干機將凍干盤轉(zhuǎn)移至凍干機中，并開始 凍干程序進行凍干，其中，預(yù)凍溫度為-45°C，預(yù)凍時間為IOh;冷凍干燥時間為72h。得到 膠原蛋白海綿樣品2#，其厚度為2-5mm。
[0127] 獲得的膠原蛋白海綿樣品2#具有生物活性、無細(xì)胞毒性、純度高、表面平整細(xì)膩， 孔徑大小均勻，質(zhì)地柔軟，富有彈性等優(yōu)異性能。
[012引 實施例3
[0129] 取18~24月齡新鮮牛跟腫，剔除筋膜，純化水沖洗4次，時間3min，然后成束整 裝冰凍，冰凍在低溫冰箱中進行，冰凍溫度為-20至-40°C，冰凍時間為15h，并避免反復(fù)凍 融。用切片機將凍好的跟腫束切成5mm的薄片，稱取牛跟腫40g，用5% (m/V)碳酸氨鋼的 90% (V/V)乙醇水溶液作為除脂液浸泡2次，浸泡時間為15min后除去脂肪，純化水沖洗4 次，每次IOmin至抑與純化水接近為中性。
[0130] 取上述經(jīng)處理的跟腫片分散于400血純化水中，調(diào)整抑為8. 5,加入終濃度為 0. 025%的膜蛋白酶，在40°C的反應(yīng)溫度中反應(yīng)化，純化水沖洗4次，每次IOmin至抑與純 化水接近為中性。
[013。 然后加入0.OlM鹽酸溶液6000血浸泡，溶脹地后，采用組織搗碎機分散，加入胃 蛋白酶0. 2g，在20°C條件下酶解96h，期間每隔Ih攬拌器攬拌15min。反應(yīng)完成后采用離 屯、機在2°C離屯、力為1000 Og下60min，收集濾液。
[0132] 配制15%硫酸鋼500血，加入上述濾液，緩慢攬拌lOmin，靜置24h后收集沉淀，并 將沉淀物在8°C離屯、力為1000 g下30min，收集沉淀物A。
[0133] 加水重溶沉淀，沉淀物A與水加入的質(zhì)量之比為1 :3,完全溶解后緩慢滴加氨氧化 鋼水溶液，調(diào)節(jié)抑至6. 5,靜置24h后，將自助裝后的產(chǎn)物6°C離屯、力為3000g下離屯、20min， 收集沉淀加純化水清洗10-20min后，靜置15min，在離屯、力為3000g、6°C條件下離屯、收集沉 淀物B，重復(fù)3次。
[0134] 將清洗后的沉淀物B中加入0. 3M醋酸水溶液進行溶解，配制成5mg/mL的溶液，在 Akata蛋白純化系統(tǒng)，Superdex-20