次沉淀產(chǎn)物重復進 行離屯、清洗后收集沉淀物B;
[0050] 優(yōu)選地，所述加水重溶是指加入水使沉淀物A重新溶解。
[0051] 更優(yōu)選地，所述沉淀物A與水加入的質(zhì)量之比為：1 :1-5。
[0052] 優(yōu)選地，所述調(diào)節(jié)抑是通過滴加堿液進行。所述堿液優(yōu)選為氨水或氨氧化鋼水溶 液。所述加水重溶并調(diào)節(jié)pH，能夠使沉淀物二次自組裝。
[0053] 優(yōu)選地，所述抑值控制在6-7之間。
[0054] 優(yōu)選地，所述靜置時間為12-2地。
[00巧]優(yōu)選地，所述再次沉淀產(chǎn)物的離屯、清洗，包括W下步驟：
[0056] A)將再次沉淀產(chǎn)物進行離屯、后收集沉淀，用水清洗后，靜置，再離屯、后收集沉淀；
[0057] 更優(yōu)選地，所述離屯、的條件為：離屯、力：1000-5000g;離屯、時間：5-30min;離屯、溫 度：2-8°C。
[0058] 更優(yōu)選地，所述水洗條件為：用量：跟腫與水的質(zhì)量之比為1 :10-50 ;清洗時間： 10-20min〇
[0059] 更優(yōu)選地，所述靜置時間為5-15min。
[0060] B)重復進行步驟A)后，收集獲得沉淀物B。
[0061] 更優(yōu)選地，所述重復次數(shù)為2-5次。所述中和產(chǎn)物的離屯、清洗能夠洗去反應沉淀 物上的多余鹽分。
[0062] 6)將步驟5)中獲得的沉淀物B，加酸溶解后純化，純化完成后收集液體；
[0063] 優(yōu)選地，所述酸為弱酸稀溶液。
[0064] 更優(yōu)選地，所述弱酸稀溶液為乙酸（醋酸）水溶液，其摩爾濃度為0. 01-0. 3M。
[0065] 優(yōu)選地，所述沉淀物B加酸溶解后溶液的濃度為1-lOmg/mL。
[0066] 優(yōu)選地，所述純化采用Akata蛋白純化系統(tǒng)，在Superdex-200凝膠柱中純化。所 述Akata蛋白純化系統(tǒng)及Superdex-200凝膠柱均為GE公司生產(chǎn)的商業(yè)化設(shè)備。
[0067] 優(yōu)選地，所述純化時，收集管數(shù)為29-39的純化膠原蛋白液。
[0068]7)將6)中收集到的純化后膠原蛋白液體進行透析，透析后脫水濃縮，獲得膠原原 液，再將膠原原液進行冷凍干燥，即得膠原蛋白海綿。
[0069] 優(yōu)選地，所述透析在透析袋中進行。
[0070] 優(yōu)選地，所述透析依次分別采用透析外液、純化水進行透析。
[0071] 更優(yōu)選地，所述透析外液為憐酸氨二鋼水溶液。
[0072] 最優(yōu)選地，所述憐酸氨二鋼水溶液的濃度為0. 001-0. 01M。
[0073] 更優(yōu)選地，所述透析條件為：透析溫度：2-8°C;透析外液的透析次數(shù)：1次；透析外 液的一次透析時間：12-24h;純化水的透析次數(shù)：2-5次；純化水的一次透析時間：3-9h。
[0074] 所述透析過后溶液的抑值與純化水的抑值接近，為中性。
[00巧]優(yōu)選地，所述脫水濃縮的條件為：透析外液：分子量十萬W上的聚乙二醇水溶 液；透析外液濃度：〇. 1-10% (m/V);脫水濃縮時間：12-20h;濃縮后膠原蛋白液體的濃度： 5-20m邑/mLc
[0076] 更優(yōu)選地，所述脫水濃縮的條件為：透析外液：分子量十萬W上的聚乙二醇水溶 液；透析外液濃度：1-5% (m/V);脫水濃縮時間：12-20h;濃縮后膠原蛋白液體的濃度： 8-16mg/mL。
[0077] 所述脫水濃縮采用透析方式，由于聚乙二醇水溶液對水具有吸附作用，通過采用 分子量十萬W上的聚乙二醇溶液為透析外液，對透析后的膠原蛋白液體進一步透析，脫水 濃縮，當脫水使透析袋中膠原蛋白液體濃縮達到一定濃度時，停止透析，即得膠原原液。
[0078] 濃縮后所述膠原蛋白液體的濃度采用藥典2010年版二部附錄WM中《蛋白質(zhì)含量 測定法第=法：雙縮脈法測定蛋白濃度》進行測定。
[0079] 優(yōu)選地，所述膠原原液要倒入不誘鋼盤中，進行冷凍干燥。
[0080] 優(yōu)選地，所述冷凍干燥采用凍干機凍干方式進行。所述凍干機為醫(yī)學生物領(lǐng)域中 常規(guī)使用的凍干機。
[0081] 更優(yōu)選地，所述凍干機凍干方式的條件為：預凍溫度：-45±5°C;預凍時間： 4-12h;冷凍干燥時間：24-72h。最優(yōu)選地，所述預凍溫度為-45°C。
[0082] 優(yōu)選地，上述用水均為純化水。所述純化水為藥典中記載的飲用水經(jīng)蒸饋法、離子 交換法、反滲透法或其他適宜的方法制得的供藥用的水，不含任何添加劑。
[0083] 優(yōu)選地，所述膠原蛋白海綿制得后，還要進行包裝、滅菌。
[0084] 更優(yōu)選地，所述滅菌采用C〇e。福射滅菌。
[0085] 本發(fā)明第二方面提供一種采用上述方法制備的具有生物活性的高純度膠原蛋白 海綿。
[0086] 優(yōu)選地，所述膠原蛋白海綿的厚度為1-lOmm。所述膠原蛋白海綿的厚度有助于海 綿外觀形態(tài)的美化。
[0087] 更優(yōu)選地，所述膠原蛋白海綿的厚度為2-5mm。
[0088] 優(yōu)選地，所述膠原蛋白海綿具有生物活性和=螺旋結(jié)構(gòu)，其純度>99%，孔徑為 50-350ym，孔隙率> 90%。
[0089] 本發(fā)明第=方面提供一種具有生物活性的膠原蛋白海綿的制備方法在制備從動 物跟腫中獲得具有生物活性的高純度膠原蛋白海綿的用途。
[0090] 如上所述，本發(fā)明的一種具有生物活性的膠原蛋白海綿及其制備方法，通過將動 物跟腫采用特殊的酶解、自組裝、凝膠層析、透析等純化過程制得純度大于99%的高純度膠 原蛋白，再通過特殊的冷凍干燥程序制備出的膠原蛋白海綿，具有W下優(yōu)益效果：
[0091] (1)本發(fā)明中制備的膠原蛋白海綿，純度高，通過二次自組裝=螺旋結(jié)構(gòu)保持完 整，分子完整性好。
[009引 似本發(fā)明中制備的膠原蛋白海綿，表面平整細膩，孔徑大小均勻，質(zhì)地柔軟，富有 彈性，可彎折，空隙率高，更有利于液體吸收，吸水倍率高，可用于自然腔道填充。
[0093] (3)本發(fā)明中制備的膠原蛋白海綿，可生物降解、具有良好的細胞適應性，促進細 胞增殖和促進血凝等特點，可用于創(chuàng)面快速止血，可有效快速止血，防止創(chuàng)面血液滲出。同 時，該膠原蛋白海綿具有促進成纖維細胞活性和各種生長因子活性的特點，良好的降解性 能可作為創(chuàng)面細胞和組織的生長支架，使止血后的創(chuàng)面更好的修復。
[0094] (4)本發(fā)明中制備的膠原蛋白海綿，具有低免疫原性、具有良好生物活性及相容 性，通過制造過程中的特殊工序，降低免疫原性，使膠原蛋白海綿的安全性得到更好的保 障。
【附圖說明】
[0095] 圖1顯示為本發(fā)明中膠原蛋白凝膠層析圖。
[0096] 圖2顯示為本發(fā)明中膠原蛋白提取過程中產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳圖。
[0097] 圖3顯示為本發(fā)明實施例中膠原蛋白的SDS-PAGE電泳圖。
[0098] 圖4顯示為本發(fā)明中膠原蛋白海綿的表面外觀示意圖。
[0099] 圖5顯示為本發(fā)明中膠原蛋白海綿的掃描電鏡圖（200倍）。
[0100] 圖6顯示為本發(fā)明中膠原蛋白海綿的透射電鏡圖。
[0101] 圖7顯示為本發(fā)明中膠原蛋白海綿的細胞毒性試驗結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0102] 下面結(jié)合具體實施例進一步闡述本發(fā)明，應理解，運些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的保護范圍。
[0103] W下通過特定的具體實例說明本發(fā)明的實施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說明書 所掲露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點與功效。本發(fā)明還可W通過另外不同的具體實 施方式加W實施或應用，本說明書中的各項細節(jié)也可W基于不同觀點與應用，在沒有背離 本發(fā)明的精神下進行各種修飾或改變。
[0104] 在進一步描述本發(fā)明【具體實施方式】之前，應理解，本發(fā)明的保護范圍不局限于下 述特定的具體實施方案；還應當理解，本發(fā)明實施例中使用的術(shù)語是為了描述特定的具體 實施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護范圍；在本發(fā)明說明書和權(quán)利要求書中，除非文中 另外明確指出，單數(shù)形式"一個"、"一"和"運個"包括復數(shù)形式。
[0105] 當實施例給出數(shù)值范圍時，應理解，除非本發(fā)明另有說明，每個數(shù)值范圍的兩個端 點W及兩個端點之間任何一個數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和 科學術(shù)語與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設(shè)備、 材料外，根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可W使用與本 發(fā)明實施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來實 現(xiàn)本發(fā)明。
[0106] 除非另外說明，本發(fā)明中所公開的實驗方法、檢測方法、制備方法均采用本技術(shù) 領(lǐng)域常規(guī)的分子生物學、生物化學、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學、細胞培養(yǎng)、重組DNA技 術(shù)及相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。運些技術(shù)在現(xiàn)有文獻中已有完善說明，具體可參見Sambrook 等MOLECULAR CLONING :A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring Harbor L油oratory Press，1989and Hiird edition，2001;Ausubel等，CURRENT