一種具有生物活性的高純度膠原蛋白海綿及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)生物材料技術(shù)領(lǐng)域，設(shè)及一種具有生物活性的高純度膠原蛋白海 綿及其制備方法，具體設(shè)及一種在動(dòng)物跟腫中具有生物活性的高純度膠原蛋白海綿及其制 備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 膠原蛋白是一種細(xì)胞外蛋白質(zhì)，它是由3條膚鏈梓成螺旋形的纖維狀蛋白質(zhì)，膠 原蛋白是人體內(nèi)含量最豐富的蛋白質(zhì)，占全身總蛋白質(zhì)的30%W上。存在于幾乎所有組織 中，是一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，W不溶纖維形式存在，具高度抗張能力，對(duì)動(dòng)物和人體皮膚、血 管、骨、軟骨的形成十分重要，是結(jié)締組織的重要物質(zhì)，是決定結(jié)締組織初性的主要因素，膠 原蛋白也是細(xì)胞外基質(zhì)中最重要的組成部分。
[0003] 膠原蛋白和其他蛋白一樣也是由氨基酸組成的，但在其組成中甘氨酸幾乎占到了 1/3,并且脯氨酸和徑脯氨酸是各類蛋白質(zhì)中最高的，正因?yàn)榘被岬慕M成特點(diǎn)，膠原蛋白 在空間中W穩(wěn)定的=螺旋結(jié)構(gòu)存在。膠原蛋白具有諸多優(yōu)異的生物學(xué)性質(zhì)，如低免疫性：膠 原分子結(jié)構(gòu)中的重復(fù)性單元大，免疫原性非常低，對(duì)機(jī)體無排異反應(yīng)，親和性好，一般生物 機(jī)體不會(huì)對(duì)其產(chǎn)生慢性的排斥現(xiàn)象。
[0004] 其中，膠原蛋白海綿為白色海綿狀固體，是膠原蛋白的一種。作為常用的醫(yī)療耗 材，具有充當(dāng)填充物，快速止血，防止粘連，加速傷口愈合等功效，減少術(shù)后并發(fā)癥，在醫(yī)療 上用途廣泛。其主要利用了膠原特殊的四級(jí)結(jié)構(gòu)，從而使血小板活化、釋放出顆粒成分，迅 速凝血，在正常血液循環(huán)中，血小板并不與內(nèi)皮細(xì)胞表面或其他細(xì)胞發(fā)生作用，而是沿著毛 細(xì)血管內(nèi)壁排列，維持其完整性，血管局部受損時(shí)，血小板的止血兼有機(jī)械性堵塞傷口和 化學(xué)性粘附聚集作用。首先，血小板迅速粘附于暴露的膠原纖維（血小板膜上的糖蛋白 GPIIb-IIIa,由VWF介導(dǎo)與膠原結(jié)合），此時(shí)血小板被激活，血小板形態(tài)發(fā)生改變，由正常的 圓盤狀態(tài)變?yōu)閳A球形，偽足突起，血小板發(fā)生聚集（血小板膜上的糖蛋白GPIIb-IIIa由膠 原介導(dǎo)發(fā)生相互粘附聚集），此為血小板第一相聚集，促進(jìn)血小板聚集的主要物質(zhì)是膠原、 損傷內(nèi)皮細(xì)胞的二憐酸腺巧和已形成的微量凝血酶；血小板的二憐酸腺巧可加速血小板的 聚集、變性，成為不可逆的第二相聚集，形成白色血栓，構(gòu)成初步的止血屏障。
[0005] 同時(shí)，膠原激活人體內(nèi)源性凝血途徑：當(dāng)血管發(fā)生損傷，皮下組織暴露，M因子與 帶負(fù)電荷的皮下膠原接觸就被激活為Ma,少量Ma與HMK可使PK轉(zhuǎn)變?yōu)榧つw釋放酶，后 者又可與HMK-起迅速激活大量M曰，Ma又同時(shí)激活因子VI，因子VI與Ca2\因子W共同 形成復(fù)合體，從而激活因子X為Xa,繼而在Ca2+參與下激活凝血酶原為凝血酶，凝血酶激 活纖維蛋白原為纖維蛋白，然后凝固形成血栓，達(dá)到止血效果。
[0006] 但是，由于從不同組織中分離純化得到的膠原蛋白在純度、理化性質(zhì)和膠原蛋白 構(gòu)型方面有顯著的差異，其吸水速率慢，吸水倍率低，力學(xué)強(qiáng)度低，生物活性差。因此本發(fā)明 選擇生物體內(nèi)含量最為豐富的動(dòng)物跟腫作為原材料，同時(shí)，針對(duì)原料中的可能存在的危險(xiǎn) 因素在生產(chǎn)過程進(jìn)行控制，W便獲得具有生物活性的高純度膠原蛋白海綿。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 鑒于W上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供一種具有生物活性的膠原 蛋白海綿及其制備方法，用于解決現(xiàn)有技術(shù)中缺乏高純度、生物活性結(jié)構(gòu)、生物相容性良 好、表面平整細(xì)膩、質(zhì)地柔軟、富有彈性等特點(diǎn)的膠原蛋白海綿的問題。
[0008] 為實(shí)現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明第一方面提供一種具有生物活性的膠原 蛋白海綿的制備方法，包括W下步驟：
[0009] 1)取動(dòng)物跟腫，清洗、冰凍切片后除脂、清洗，備用；
[0010] 優(yōu)選地，所述動(dòng)物跟腫為牛、馬、羊、豬等動(dòng)物的跟腫。更優(yōu)選地，所述動(dòng)物跟腫為 ?；蝰R的跟腫。
[0011] 優(yōu)選地，所述動(dòng)物跟腫要剔除筋膜。所述剔除筋膜目的在于初步除去脂肪和其他 雜蛋白。
[0012] 優(yōu)選地，所述冰凍為成束整裝冰凍。
[0013] 所述成束整裝是將剔除筋膜并用水清洗后的動(dòng)物跟腫按順序并排在一起，捆成束 處理。
[0014] 更優(yōu)選地，所述冰凍在低溫冰箱中進(jìn)行。所述低溫冰箱為醫(yī)學(xué)生物領(lǐng)域中常規(guī)使 用的低溫冰箱。
[0015] 更優(yōu)選地，所述冰凍的條件為：冰凍溫度：-20至-40°c;冰凍時(shí)間> 12h;所述動(dòng)物 跟腫避免反復(fù)凍融。
[0016] 優(yōu)選地，所述切片采用切片機(jī)將凍好的跟腫束切成薄片。所述切片機(jī)為醫(yī)學(xué)生物 領(lǐng)域中常規(guī)使用的切片機(jī)。
[0017] 更優(yōu)選地，所述薄片的厚度為0. 5-5mm。所述薄片切片時(shí)只管厚度，體積由牛筋本 身形狀決定。
[0018] 優(yōu)選地，所述除脂是將跟腫片用除脂液浸泡后再用水清洗。
[0019] 更優(yōu)選地，所述除脂液為碳酸氨鋼與乙醇水溶液的混合液。所述除脂液能夠去除 跟腫片上的脂肪。
[0020] 最優(yōu)選地，所述除脂液中所含碳酸氨鋼的終濃度為0. 5-5% (m/V)，所含乙醇的終 濃度為70-90% (V/V)。所述終濃度是指溶液中溶質(zhì)的最后濃度。
[0021] 更優(yōu)選地，所述除脂液浸泡條件為：浸泡次數(shù)：2-5次；浸泡時(shí)間：15-30min。
[0022] 更優(yōu)選地，所述跟腫片與除脂液加入的質(zhì)液比為1 :10-25(g/mL)。
[002引。取步驟1)的跟腫化分散于水中，再加入膜蛋白酶處理并清洗；
[0024] 優(yōu)選地，所述含跟腫片的水的抑值調(diào)整為8. 0-8. 5。所述抑值調(diào)整采用堿液調(diào) 整。所述堿液為氨水或氨氧化鋼水溶液。
[0025] 優(yōu)選地，所述跟腫片與水溶液的質(zhì)液比為1 :10-100(g/mL)。
[002引優(yōu)選地，所述膜蛋白酶與水加入的質(zhì)液比為25-250 :100000 (g/血）。即所述膜蛋 白酶加入到水中，形成膜蛋白酶水溶液的濃度為0. 025-0. 25% (m/v)。
[0027] 優(yōu)選地，所述膜蛋白酶處理?xiàng)l件為：反應(yīng)溫度：35-40°C，優(yōu)選為37°C;反應(yīng)時(shí)間： 0. 5-2h。所述跟腫片與膜蛋白酶反應(yīng)，能夠去除跟腫片中的部分雜蛋白。
[0028] 優(yōu)選地，上述步驟1)或2)中，所述清洗均為用水清洗。所述用水清洗時(shí)，使跟腫 片的抑值與純化水的抑值接近，調(diào)整抑值至7,為中性。
[0029] 更優(yōu)選地，所述用水清洗條件為：清洗時(shí)間：3-10min，次數(shù)：2-5次。
[0030] 3)取步驟2)的跟腫片加酸浸泡后分散，再在分散液中加入胃蛋白酶，反應(yīng)后收集 酶解液；
[0031] 優(yōu)選地，所述跟腫片與酸加入的質(zhì)液比為1 :50-150 (g/mL)。
[0032] 優(yōu)選地，所述酸選自乙酸、鹽酸中的任意一種。所述酸為抑=2-4的稀酸水溶液。
[0033] 更優(yōu)選地，所述乙酸（醋酸）水溶液的摩爾濃度為0.1 -IM ;所述鹽酸水溶液的摩 爾濃度為0.01-0. 1M。
[0034] 優(yōu)選地，所述酸浸泡時(shí)間為0.5-地。所述酸浸泡能夠使跟腫片充分溶脹。
[0035] 優(yōu)選地，所述分散是將跟腫片與酸充分混合均勻。從而使成團(tuán)的跟腫片均勻的分 散在稀酸溶液中，便于在提取時(shí)更充分更均勻的反應(yīng)。
[0036] 優(yōu)選地，所述分散采用組織搗碎機(jī)進(jìn)行。所述組織搗碎機(jī)為醫(yī)學(xué)生物領(lǐng)域中常規(guī) 使用的組織搗碎機(jī)。
[0037] 優(yōu)選地，所述跟腫片與胃蛋白酶加入的質(zhì)量之比為20-200 :1。更優(yōu)選的，所述跟 腫片與胃蛋白酶加入的質(zhì)量之比為50-150 :1。
[0038] 優(yōu)選地，所述酶溶解的條件為：反應(yīng)溫度：0-20°C;反應(yīng)時(shí)間：24-96h;攬拌周期： 每隔比攬拌5-15min;攬拌速率：50~10化pm/min。
[0039] 更優(yōu)選地，所述攬拌周期為每隔比攬拌lOmin。
[0040] 優(yōu)選地，所述收集酶解液采用離屯、收集上清液或壓濾收集濾液的方式收集。
[0041] 更優(yōu)選地，所述離屯、收集上清液的條件：離屯、力：5000-10000g;離屯、時(shí)間： lO-eOmin;離屯、溫度：2-8°C。
[0042] 更優(yōu)選地，所述壓濾收集濾液的條件：壓力：0. 1-0. 5MPa;濾網(wǎng)目數(shù)：40-200目。所 述壓濾收集濾液采用壓濾器進(jìn)行。
[0043] 4)在步驟3)中獲得的酶解液中加入硫酸鋼水溶液，攬拌后靜置，取沉淀產(chǎn)物離屯、 后收集沉淀物A;
[0044] 優(yōu)選地，所述硫酸鋼水溶液的濃度為15% -20% (m/V)。更優(yōu)選地，所述硫酸鋼水 溶液的濃度為20% (m/V)。
[0045] 優(yōu)選地，所述硫酸鋼水溶液與酶解液加入的體積之比為1 :1-4。
[0046] 優(yōu)選地，所述攬拌條件為：攬拌時(shí)間為I-IOmin;攬拌器轉(zhuǎn)速：1~10巧m/min。所 述攬拌為輕微攬拌。
[0047] 優(yōu)選地，所述靜置時(shí)間為12-2地。所述靜置能夠使反應(yīng)液充分完成自組裝。
[0048] 優(yōu)選地，所述離屯、的條件為：離屯、力：1000-5000g;離屯、時(shí)間：5-30min;離屯、溫度： 2-8 °C。
[0049] 5)取步驟4)中獲得的沉淀物A，加水重溶并調(diào)節(jié)抑，靜置，將再