液體LB培養(yǎng)基，用移液槍槍頭沾取DH5 a大腸桿菌(美國Promega公司)的單克隆菌落后投入液體LB培養(yǎng)基中，37°C、200rpm條件下?lián)u菌15h，備用。
[0100]c)抗菌敷料準(zhǔn)備:在實施例1的步驟4)中，首先配置200mL 0.2%的膠原蛋白溶液7份，將實施例1的步驟3)中制得的殼聚糖_Ag抗菌液分別加入0mL、2mL、5mL、10mL、20mL、30mL、40mL，分別混合均勾，于-20°C預(yù)凍，凍干。切割成lcmX lcm片狀，封裝，Co 60輻照滅菌。
[0101]d)抗菌性能評價:在15ml試管中加入5ml LB液體培養(yǎng)基，lcm2抗菌敷料，震蕩使其充分浸潤LB液體培養(yǎng)基，再加入100 y 1 DH5 a大腸桿菌菌液，37°C震蕩過夜，600nm測吸光度(平行樣5個)。實驗結(jié)果如圖2所示，該圖表明加入5-40mL殼聚糖-Ag抗菌液制備的敷料均能顯著抑制細菌生長。其中，加入20-40mL殼聚糖-Ag抗菌液制備的敷料能完全殺滅培養(yǎng)基中的大腸桿菌。
[0102] (2)
[0103]a)固體LB培養(yǎng)基的準(zhǔn)備:在950ml去離子水中加入10g胰化蛋白胨、5g酵母提取物、10gNaCl、15g瓊脂糖，搖動容器使溶質(zhì)溶解或分散。然后用5M NaOH(約0.2ml)調(diào)pH= 7.0，最后用去離子水定容至1L。在1.05kg/cm2的壓力下121°C濕熱滅菌20min。待溫度降至約60°C -70°C時，輕輕搖動容器使培養(yǎng)基成為均質(zhì)溶液，在超凈工作臺內(nèi)將該培養(yǎng)基注入無菌的直徑9cm的玻璃培養(yǎng)皿中，每皿約30ml。冷卻固化后用封口膜將玻璃培養(yǎng)皿密封，4°C倒置保存。
[0104]b)抗菌敷料準(zhǔn)備:用打孔器將按照實施例1-9的方法制備的含銀抗菌敷料制成直徑d = 9mm的圓形試樣，Co 60福照滅菌。
[0105]c)抗菌性能評價:取固體LB培養(yǎng)板，用移液槍吸取100 y 1菌液[抗菌性試驗(1)b)中的方法制得]滴在固體培養(yǎng)基表面，用玻璃刮鏟按順時針、逆時針方向分別涂抹2周，使菌液均勻分布于平板表面。將實施例1-9的含銀抗菌敷料試樣均勻分布于該培養(yǎng)板。制備好的培養(yǎng)板倒置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)lh后正置培養(yǎng)，培養(yǎng)13h后取出，觀察發(fā)現(xiàn)9種含銀抗菌敷料周圍均出現(xiàn)寬度不小于1.5mm的抑菌環(huán)，說明9種含銀抗菌敷料均可殺滅其表面及周邊的細菌。
[0106]2.細胞相容性實驗
[0107](1)
[0108]a)經(jīng)由抗菌性實驗(l)c)的方法制備的含銀抗菌敷料(制備時分別加入OmL、5mL、10mL、20mL、30mL、40mL殼聚糖-Ag抗菌液)，切割成lcmXlcm。Co 60福照滅菌后，按照5ml/cm2的計量加入含10%小牛血清的1640培養(yǎng)基，置于37°C培養(yǎng)箱中浸泡24h，取出材料，4 °C保存浸提液。
[0109]b)消化L929細胞，在96孔培養(yǎng)板中按照3 X 103/孔接種該細胞，在培養(yǎng)箱(37°C，5% C02)中培養(yǎng)過夜。用浸提液替換各孔培養(yǎng)基(100 yL/孔，8個平行樣)，以含10%小牛血清的1640培養(yǎng)基換液的各孔為陰性對照。培養(yǎng)48h進行MTT檢測。方法如下:吸干各孔培養(yǎng)基，向每孔加入50ml的四甲基偶氮砜(MTT，0.5%)，37°C靜置4h。吸干MTT溶液，再向每孔加入100ml 二甲基亞砜(DMSO)，37°C靜置lh。最后，用酶標(biāo)儀(ELX800)檢測上述樣品在490nm的吸光度。
[0110]c)以空白對照矯正后的吸光度如圖3所示，該圖顯示隨著抗菌敷料制備過程中加入抗菌液體積的增加，材料的細胞相容性有所下降，但即便是加入40mL殼聚糖-Ag抗菌液制備的敷料其細胞相容性依然能滿足生物醫(yī)用材料0 — 1級毒性(細胞相對增殖率彡75% )的標(biāo)準(zhǔn)，即該材料對細胞的生長無顯著的抑制作用。
[0111](2)
[0112]將實施例1-9中制備的含銀抗菌敷料按照5ml/cm2的計量加入含10%小牛血清的1640培養(yǎng)基，置于37°C培養(yǎng)箱中浸泡24h，取出材料，4°C保存浸提液。用細胞相容性實驗
(l)b)的方法考察9種浸提液中細胞的增殖情況，實驗結(jié)果證明，9種含銀抗菌敷料浸提液中細胞相對增殖率均大于75%，即抗菌敷料滿足生物醫(yī)用材料0 — 1級毒性的標(biāo)準(zhǔn)。
【主權(quán)項】
1.一種含銀抗菌敷料的制備方法，其特征在是包括如下步驟: 1)向質(zhì)量濃度為0.1% -0.6%的多糖溶液中滴加氯離子鹽水溶液，使氯離子的濃度達5-15ppm ;所述氯離子鹽為氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂、氯化鋇、氯化鐵、氯化鈣和氯化鋅至少一種。 2)按體積比為1-9:9-1的比例，將質(zhì)量濃度為0.05% -1 %的硝酸銀水溶液與步驟I)獲得的溶液混合均勻； 3)光激發(fā)下，反應(yīng)I分鐘-30小時； 4)按體積比為1:5-10的比將步驟3)獲得的液體與質(zhì)量濃度為0.2% -0.8%的天然高分子溶液混合均勻，于-20—-80°C預(yù)凍，凍干； 5)切割、封裝、滅菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述多糖溶液為海藻酸鈉水溶液、透明質(zhì)酸水溶液、硫酸軟骨素水溶液、肝素水溶液和殼聚糖溶液至少一種，所述殼聚糖溶液的溶劑為0.05M-0.8M的乙酸水溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述光激發(fā)為紫外光激發(fā)、日光激發(fā)或波長小于500nm，照度為300-200001ux的可見光激發(fā)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述天然高分子溶液為膠原蛋白溶液、殼聚糖溶液、明膠水溶液、海藻酸鈉水溶液至少一種，膠原蛋白溶液的溶劑為0.05M-0.8M的乙酸水溶液，殼聚糖溶液的溶劑為0.05M-0.8M的乙酸水溶液。
5.權(quán)利要求1-4之一的方法制備的含銀抗菌敷料。
6.一種含銀抗菌敷料的制備方法，其特征在于它包括如下步驟: 1)向質(zhì)量濃度為0.1% -0.6%的多糖溶液中滴加氯離子鹽水溶液，使氯離子的濃度達5-15ppm ;所述氯離子鹽為氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂、氯化鋇、氯化鐵、氯化鈣和氯化鋅至少一種。 2)按體積比為1-9:9-1的比例，將質(zhì)量濃度為0.05% -1 %的硝酸銀水溶液與步驟I)獲得的溶液混合均勻； 3)光激發(fā)下，反應(yīng)I分鐘-30小時； 4)按體積比為1:5-10的比將步驟3)獲得的液體與質(zhì)量濃度為0.2% -0.8%的天然高分子溶液混合均勻，于-20—-80°C預(yù)凍，凍干； 5)室溫下，按l_5mg:lmL的比例，將步驟4)獲得的產(chǎn)物浸泡于50mML2-嗎啉乙烷磺酸溶液，浸泡10-120min ;取出，浸泡在交聯(lián)液中，室溫下交聯(lián)l_24h ;在蒸餾水中浸洗3_6次，0.5h/次-1.5h/次，于-20—-80°C預(yù)凍，凍干；所述L2-嗎啉乙烷磺酸溶液的溶劑為體積濃度30% -50%乙醇水溶液；所述交聯(lián)液用下述方法配成:將L2-嗎啉乙烷磺酸加入到體積濃度30% -50%乙醇水溶液中使L2-嗎啉乙烷磺酸濃度為1-1OOmM ;加入碳化二亞胺，使碳化二亞胺的濃度為10-50mM，加入琥珀酰亞胺，使琥珀酰亞胺的濃度為2-20mM ； 6)切割、封裝、滅菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述多糖溶液為海藻酸鈉水溶液、透明質(zhì)酸水溶液、硫酸軟骨素水溶液、肝素水溶液和殼聚糖溶液至少一種，所述殼聚糖溶液的溶劑為0.05M-0.8M的乙酸水溶液。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述光激發(fā)為紫外光激發(fā)、日光激發(fā)或波長小于500nm，照度為300-200001ux的可見光激發(fā)。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述天然高分子溶液為膠原蛋白溶液、明膠水溶液、海藻酸鈉水溶液至少一種，膠原蛋白溶液的溶劑為0.05M-0.8M的乙酸水溶液。
10.權(quán)利要求6-9之一的方法制備的含銀抗菌敷料。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種含銀抗菌敷料及制備方法，制備步驟為：1)向多糖溶液中滴加氯離子鹽水溶液；2)將硝酸銀水溶液與步驟1)獲得的溶液混合均勻；3)光激發(fā)下，反應(yīng)；4)將步驟3)獲得的液體與天然高分子溶液混合均勻，預(yù)凍，凍干；5)切割、封裝、滅菌。本發(fā)明能夠通過天然高分子的選擇和配比改善敷料的力學(xué)性能，調(diào)整其降解速率。由于受到天然高分子的保護，納米結(jié)構(gòu)分散均勻、穩(wěn)定性好，具有殺菌速度快、銀離子持續(xù)穩(wěn)定釋放的優(yōu)勢。又以天然高分子為基材，具有三維多孔的結(jié)構(gòu)特征，使該敷料在發(fā)揮抗菌功能的同時，具有很好的吸濕性、降解性和生物相容性。本發(fā)明的方法制備的產(chǎn)品可用于臨床上因各種原因造成的皮膚缺損感染的治療。
【IPC分類】A61L15-28, A61L15-44, A61L15-32
【公開號】CN104857551
【申請?zhí)枴緾N201510342242
【發(fā)明人】關(guān)嫚, 段瑞平, 周志敏, 李學(xué)敏, 劉玲蓉, 張其清
【申請人】中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所
【公開日】2015年8月26日
【申請日】2015年6月18日