專利名稱：磁性顆粒及其聚類的檢測的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于檢測樣本室中的磁性顆粒的設備和方法。
背景技術：
磁性顆粒是例如用在生物傳感器中以標記人感興趣的樣本的成分。在US2009/148933A1中描述了這種應用的典型范例。根據(jù)本文獻,在關掉外部磁場時超導珠的磁化強度消失，使得這些顆粒不會成團(
)。

發(fā)明內容
基于這一背景，本發(fā)明的目的是提供實現(xiàn)對磁性顆粒的更魯棒和精確檢測的手段。 這一目的是由根據(jù)權利要求I所述的方法和根據(jù)權利要求4到6所述的設備實現(xiàn)的。在從屬權利要求中公開了優(yōu)選實施例。根據(jù)第一方面，本發(fā)明涉及一種用于檢測樣本室中的磁性顆粒的“基本方法”，其中，術語“磁性顆粒”應表示持久的磁性顆?；蚩纱呕w粒，尤其是納米顆?；蛭⒚最w粒。在很多情況下，磁性顆粒用作標簽，即它們要結合到人實際感興趣的一些目標成分(例如分子)?！皹颖臼摇蓖ǔＪ乔唬绕涫情_放腔、閉合腔或者通過流體連接通道連接到其他腔的腔。該方法將包括如下步驟，可以按照列舉的或任何其他適當次序執(zhí)行a)確定與第一檢測區(qū)域中的磁性顆粒的量相關的參數(shù)，下文稱為“顆粒參數(shù)”?？梢酝ㄟ^任何適當定義來表示“磁性顆粒的量”，包括絕對值(例如，磁性顆粒的總數(shù)量或總質量)和相對值(例如，每單位體積或面積的磁性顆粒數(shù)量或質量)。b)確定與第二檢測區(qū)域中的磁性顆粒的聚類的量或程度相關的參數(shù)，下文稱為“聚類參數(shù)”?？梢酝ㄟ^任何適當定義(例如，每個聚類的磁性顆粒平均數(shù)量或質量)，包括取決于顆粒聚類的任何參數(shù)，表示“聚類的程度”。第一和第二檢測區(qū)域通常是樣本室的子區(qū)域。它們可以是相同的，部分交疊的或者不同的。此外，它們可以包括整個樣本室。c)顆粒參數(shù)的評估基于聚類參數(shù)。例如可以在數(shù)據(jù)處理裝置中自動進行這種評估，所述數(shù)據(jù)處理裝置可以用專用電子硬件、具有適當軟件的數(shù)字數(shù)據(jù)處理硬件或兩者的混合來構建。該方法具有如下優(yōu)點除了檢測樣本中的磁性顆粒之外，它還提供了關于所述顆粒的可能聚類的信息。在實踐中證明這種信息很重要，因為顆粒檢測過程的輸出結果常常受到磁性顆粒聚類存在的影響。如果不存在磁性顆粒的(不可逆)聚類則產生正確結果的檢測方法例如可以在發(fā)生越多磁性顆粒聚類時產生越來越弱的結果。因此可以利用確定這樣聚類的程度提高顆粒檢測的可靠性、魯棒性和/或精確度。能夠將關于顆粒參數(shù)和聚類參數(shù)的信息用于不同目的。在優(yōu)選實施例中，如果聚類參數(shù)偏離預定值集合，即預定“正常范圍”，則生成警報信號。于是能夠通知用戶異常狀況發(fā)生，這削弱了顆粒檢測結果的可靠性，并可能例如必須要改變操作參數(shù)。根據(jù)另一實施例，可以基于聚類參數(shù)校正顆粒參數(shù)。這種方法要求關于顆粒參數(shù)對顆粒聚類程度依賴性的一些信息是已知的，例如從理論研究或校準流程已知。本發(fā)明的“基本方法”需要確定顆粒參數(shù)(與第一檢測區(qū)域中的磁性顆粒量相關)和聚類參數(shù)(與第二檢測區(qū)域中的聚類的程度相關)作為必要先決條件。在下文中，描述了能夠應用于該方法中的各種設備，以提供這些參數(shù)或至少可以從其導出顆粒參數(shù)和聚類參數(shù)的信息(優(yōu)選通過純粹計算，即無需額外測量)。然而，應該注意，這些設備也可以用于其他目的。用于“基本方法”中的第一設備包括如下部件a)磁場發(fā)生器,其用于在樣本室中生成磁場，其中，所述場在結合表面的“第一場區(qū)域”和“第二場區(qū)域”中分別相對于結合表面具有不同的傾斜(inclination)。磁場發(fā)生 器例如可以包括一個或多個永磁體和/或可以有選擇地進行控制的電磁體。優(yōu)選同時采取磁場在第一和第二場區(qū)域中的不同的傾斜，但通常也可以相繼地采用它們(即，在部分交疊期間甚至在不同時段)。此外，第一和第二場區(qū)域優(yōu)選是不同的，但通常它們也可以部分交疊，甚至相同(其中，在場區(qū)域交疊的那些部分中必須要相繼采用具有不同的傾斜的磁場)。此外，“結合表面”通常應該是樣本室和磁性顆粒能夠駐留其上或附近的相鄰部件之間的界面。如其名稱所示，在所述“結合”表面和磁性顆粒之間優(yōu)選有每種鏈接或結合。b)傳感器元件，其用于(分離地)檢測第一和第二場區(qū)域中的磁性顆粒，其中，傳感器元件產生與其檢測結果對應的檢測信號。c)評估單元，其用于使上述傳感器元件提供的第一和第二場區(qū)域的檢測信號彼此相關?？梢栽趯Ｓ秒娮佑布?、具有關聯(lián)軟件的數(shù)字數(shù)據(jù)處理硬件或兩者的混合中實現(xiàn)評估單元。檢測信號的相關例如可以包括計算其比值、差異或這兩個變量的任何其他函數(shù)。與所述第一設備相關的是一種包括如下步驟的方法a)在樣本室中生成磁場，其中，所述場在結合表面的“第一場區(qū)域”和“第二場區(qū)域”中分別相對于結合表面具有不同的傾斜。b)檢測第一和第二場區(qū)域中的磁性顆粒。c)將來自第一和第二場區(qū)域的檢測信號彼此相關。所述第一設備和對應方法允許通過磁場操控磁性顆粒并檢測在結合表面處的這些顆粒。具體特征是施加的磁場在結合表面的兩個區(qū)域中具有至少兩個不同的傾斜，并分離地檢測這些區(qū)域中的磁性顆粒，這樣能夠將所得的檢測信號彼此相關。結果表明，這種方法產生了關于結合表面狀況的寶貴附加信息。具體而言，能夠獲得磁性顆粒的可能(不可逆)聚類的信息，因為所述聚類對磁場的方向敏感。因此，能夠從檢測信號導出“顆粒參數(shù)”和“聚類參數(shù)”。應當指出，以上設備中發(fā)生的“基本方法”的“檢測區(qū)域”和“場區(qū)域”是不同概念。在典型的實施例中，第一和第二檢測區(qū)域是相同的，對應于第一和第二場區(qū)域的結合。這意味著利用將這一子區(qū)區(qū)分成第一和第二場區(qū)域而針對樣本室的同一子區(qū)確定“顆粒參數(shù)”和“聚類參數(shù)”。用于“基本方法”中的第二設備包括如下部件a)磁場發(fā)生器，其用于在樣本室中生成磁場，所述場在結合表面的“第一場區(qū)域”中傾斜于結合表面。在當前語境中，如果磁場不平行于表面，即如果場和表面之間的角度α滿足0° <α <90°，則認為磁場是相對于表面“傾斜的”。b)傳感器元件，其用于檢測所述第一場區(qū)域中的磁性顆粒，其中。傳感器元件產生與其檢測結果對應的檢測信號。c)評估單元，其用于將持久關閉所述磁場之前和之后獲得的檢測信號相關。在當前語境中，如果磁場的關閉的持續(xù)時間長于與結合表面處弛豫和擴散過程相關的預定時段，則認為磁場的關閉是“持久的”。對于直徑約為500nm的磁性顆粒，如果持續(xù)超過一分鐘，優(yōu)選長于兩分鐘，通?？梢哉J為是“持久”關閉。對于更大(更重)的顆粒(例如IOOOnm的珠子)，所需的最少時間可以更短，因為更大的重力將向表面更快地驅動顆粒。第二設備可以任選地包括第一設備的特征(在這種情況下，術語“第一場區(qū)域”可以指同一區(qū)域)。通常，上文相對于第一設備給出的解釋也類似適用于第二設備。
與所述第二設備相關的是一種包括如下步驟的方法a)在樣本室中生成相對于結合表面的“第一”場區(qū)域中的結合表面傾斜的磁場。b)檢測第一場區(qū)域中的磁性顆粒。c)將持久關閉所述磁場之前和之后獲得的檢測信號相關。所述第二設備和對應方法允許通過磁場操控磁性顆粒并檢測結合表面的這些顆粒。第二設備和方法的具體特征是磁場應該相對于結合表面傾斜，檢測這一場作用之前和之后的檢測信號并彼此相關。結果表明，這種方式提供了關于結合表面處的狀況，尤其是關于磁性顆粒可能的(不可逆)聚類的寶貴額外信息。再次可以使用這種信息導出“顆粒參數(shù)”和“聚類參數(shù)”。在第一或第二設備的第一場區(qū)域中，磁場優(yōu)選包括相對于結合表面超過約10°的角度。在這種情況下，磁場相對于結合表面充分傾斜，以顯示磁性顆粒的聚類效應。在第二場區(qū)域(如果有的話)中，磁場優(yōu)選包括相對于結合表面小于約10°，更優(yōu)選小于約5°的角度。這樣的磁場可以被認為基本平行于第二場區(qū)域中的結合表面。在這種配置中使磁性顆粒聚類的擴散相關效應最小化。用于“基本方法”中的第三設備包括如下部件a) “顆粒檢測單元”，其用于檢測樣本室第一檢測區(qū)域中的磁性顆粒。顆粒檢測單元通常產生與檢測結果相關聯(lián)的信號(例如電信號)，例如將檢測到的磁性顆粒的量表達為一些模擬值。因此，這一信號可以直接對應于本發(fā)明的方法需要的顆粒參數(shù)。顆粒檢測單元可以應用任何適當?shù)臋z測原理，例如光學、磁性、機械、聲學、熱和/或電的原理。最優(yōu)選地，顆粒檢測單元將是表面敏感的，即僅在接近于樣本室表面的有限區(qū)域之內檢測磁性顆粒。b) “聚類檢測單元”，其用于檢測磁性顆粒的聚類的程度。同樣地，聚類檢測單元通常產生與檢測結果相關聯(lián)并且可以直接對應于本發(fā)明的方法要求的聚類參數(shù)的信號(例如電信號)。有不同方式可以檢測聚類的存在。在優(yōu)選實施例中，聚類檢測單元例如可以包括光源和光檢測器，所述光檢測器被布置成測量第二檢測區(qū)域中的光透射。對于包括多個磁性顆粒的非球狀聚類，例如與外部磁場對準的磁性顆粒鏈，光透射將典型地取決于聚類的發(fā)生和程度。于是透射測量提供了確定聚類參數(shù)的適當手段。
在上述情況下，所述聚類檢測單元可以優(yōu)選包括至少一個反射和/或折射界面，光在其從光源到光檢測器的途中遇到所述界面。例如能夠將反射表面(鏡片)用在樣本室的一側以向光源反射回光，從而允許在樣本室的同一側布置光源和光檢測器。類似地，可以使用樣本室側面上的折射窗口重定向光，使得可以在方便的位置布置光源和/或光檢測器。根據(jù)本發(fā)明的方法和設備優(yōu)選可以包括磁場發(fā)生器，例如永磁體或電磁體，用于在樣本室中生成作用于磁性顆粒的磁場。磁場發(fā)生器優(yōu)選可以包括馬蹄形磁體。這提供了明確行為的配置，利用其能夠容易地產生不同的傾斜的磁場(例如，在極尖附近傾斜更大，它們之間大致為平行方向)。此外或備選地，磁場發(fā)生器可以包括與傳感器元件相對設置的磁體。樣本室中的磁場可以用于各種目的，通常包括與磁性顆粒交互作用。在很多重要應用中，配置磁場，使其在磁性顆粒上產生力，尤其是向結合表面吸引的力。為此，磁場通常將具有梯度，以產生期望方向的力?？梢允褂孟蚪Y合表面吸引磁性顆粒來加快其從整個樣 本體積向檢測它們的小得多區(qū)域中的遷移。在磁場作用期間，通常會形成磁性顆粒的聚類或鏈，其可以在關閉場之后持續(xù)。可以通過確定聚類參數(shù)來處理這種(不希望有的)不可逆聚類。根據(jù)具有磁場發(fā)生器的實施例的進一步發(fā)展，磁場被調制，尤其是被反復開關。因此磁場對磁性顆粒的效果與顆粒不受外部磁場影響的周期交替。如果磁場在磁性顆粒上施加力，這意味著例如顆粒的強制運動與自由(擴散控制的)遷移交替。應當指出，在當前語境中表示的磁場關閉通常比上文定義的“持久”關閉更短。磁場反復關閉的頻率優(yōu)選介于約IOHz和大約O. IHz之間(其中，將這種切換的周期定義為兩次相繼打開事件之間的時間)。磁場反復關閉的占空比優(yōu)選介于大約20%和大約90%之間，其中，所述占空比定義為“開”時段相對于整個切換期間(包括“開”和“關”時段)的持續(xù)時間。通過占空比，可以控制磁性顆粒必須要自由遷移多長時間而不受磁場影響。如果在磁場中發(fā)生了磁性顆粒的聚類并且如果聚類的取向相對于結合表面傾斜，無場遷移的可用時間決定了遠端磁性顆?；蜃泳垲愂欠裼凶銐驎r間通過擴散到達結合表面。因此，占空比的值可以決定性地影響檢測流程的結果。例如可以將這種相關性用于判斷聚類是可逆的(在關閉磁場之后不發(fā)生子聚類)還是不可逆的(發(fā)生子聚類)。所述磁場切換尤其可以發(fā)生在檢測顆粒參數(shù)和/或聚類參數(shù)期間。如上所述，由于磁場作用而形成的磁性顆粒聚類通常將由于一旦關閉磁場而發(fā)生熱運動而分裂。然而，在持久或不可逆聚類的情況下，通過磁性方式形成的顆粒聚類可以因為任何原因(例如由于化學結合)而持續(xù)。因此可以使用調制磁場的作用在可逆和不可逆磁性顆粒聚類之間區(qū)分并確定(不可逆)聚類的程度?？梢詮母鞣N不同測量推斷可逆和不可逆聚類之間的上述區(qū)分。最優(yōu)選地，可以相對于局部相對幅度，即相對于某個時間點最近局部極大值和最近局部極小值之間的相對差異，來評估聚類檢測單元的檢測信號，其中，分別在打開或關閉磁場時，采用上述局部極值。在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，樣本室包括覆蓋有針對磁性顆粒的結合部位的結合表面。應當指出，在當前語境中，磁性顆粒常?？梢园瑏碜员谎芯繕颖镜奶禺惤Y合的目標成分(例如原生質)，并且可以通過這些目標成分結合到結合部位。在結合部位僅結合特定聚類體的磁性顆粒，尤其是包括所述目標成分的磁性顆粒的意義上，結合部位可以相應地是“特異的”。如果是該方法或設備的一部分，可以通過任何適當?shù)姆椒ɑ蛟?，例如通過光學、磁性、機械、聲學、熱學和/或電學測量來實現(xiàn)磁性顆粒的檢測。檢測信號通常將是電信號或計算機產生的信號(例如來自圖像處理)，表示與對應感測區(qū)域中的磁性顆粒量相關的標量值。本發(fā)明還涉及將上述設備用于分子診斷、生物樣品分析、化學樣本分析、食物分析和/或法醫(yī)分析。例如，可以借助于直接或間接附著于目標分子的磁珠或熒光顆粒完成分子診斷。


本發(fā)明的這些和其他方面將從下文描述的實施例變得顯而易見并參考其加以闡 述。將借助于附圖以舉例方式描述這些實施例，在附圖中圖I示意性圖示了根據(jù)本發(fā)明的(第一 /第二)設備的側視圖；圖2分離地圖示了圖I設備中磁場的配置；圖3圖示了關閉磁場之后磁性顆粒聚類的局部破裂；圖4是示出了在發(fā)生珠子可逆聚類時對于占空比為40%的脈動磁場第一和第二場區(qū)域中的測量結果的圖示；圖5是在發(fā)生珠子可逆聚類時針對90%占空比像圖4那樣的圖示；圖6是在發(fā)生珠子不可逆聚類時針對40%占空比像圖4那樣的圖示；圖7是在發(fā)生珠子不可逆聚類時針對90%占空比像圖4那樣的圖示；圖8示意性圖示了根據(jù)本發(fā)明的(第三)設備，其具有聚類檢測單元，從樣本室頂側向底側施加光透射；圖9示出了圖8設備的修改，從樣本室的底側向頂側和后側施加光透射；圖10不出了圖8設備的修改,施加光透射而在樣本室的相對側窗口具有光折射；圖11圖示了針對磁場多次開/關切換周期，針對沒有聚類的樣本，在樣本室表面上不同位置獲得的光透射測量信號；圖12圖示了針對聚類樣本像圖11中那樣的測量信號；圖13以更高時間分辨率示意性圖示了打開磁場時以及關閉其之后光透射測量信號的時間過程；圖14是將所確定的聚類相關到顆粒檢測結果的圖示；圖15示出了在有和沒有被分析物誘發(fā)的聚類的樣本中檢測信號的相對幅度過程。附圖中相差100整數(shù)倍的相似附圖標記或數(shù)字是指相同或相似部件。
具體實施例方式在下文中將相對于生物或保健應用描述本發(fā)明，生物或保健應用例如包括DNA(分子診斷)和蛋白質(免疫化驗)的檢測，兩者都是人體中所有種類疾病的重要標志。免疫化驗技術可以使用小的(超)順磁性珠有選擇地俘獲感興趣的生物標志。接下來，磁珠能夠耦合到特異性抗體表面上的部位，接著對準珠子進行最后的檢測?；诖?，可以開發(fā)平臺檢測儀器以進行分散測量，例如唾液中藥物濫用的路旁測試或在醫(yī)生處進行人體血液中心臟標記的護理點測試。作為上述儀器的范例，圖I示意性示出了用于光學檢測試劑盒或載體110中提供的磁性顆粒MP的設備100。由于載體被手邊的樣本污染，它通常將是一次性裝置，例如由玻璃或透明塑料(例如聚苯乙烯)通過注射模制生產。此外，可以將載體110邏輯地認為是或不是設備100的一部分。載體110包括樣本室111，在其中可以提供待檢測(例如藥物、抗體、DNA等)目標成分的樣本流體。樣本還包括磁性顆粒MP，例如超順磁性珠，其中，這些顆粒MP通常作為標記結合到上述目標成分(為簡單起見，圖中僅示為磁性顆粒MP)。載體110的質量部分和樣 本室111之間的底部界面由稱為“結合表面”112的表面形成。這個結合表面112可以任選地涂布有俘獲元件，例如，抗體，其能夠特異性地結合目標成分。設備100包括光源121 (例如紅色650nm LED)，用于向載體110中發(fā)射“輸入光束” LI。輸入光束LI以大于全內反射(TIR)臨界角的角度到達結合表面112，因此被全內反射為“輸出光束” L2。輸出光束L2離開載體110，被光檢測器，例如由攝像機131的光敏像素檢測到。光檢測器131由此生成檢測信號，表示輸出光束L2的光量(例如，由這個光在整個光譜或光譜某部分中的光強表達)。評估單元132從光檢測器接收檢測信號以進一步處理(評估、記錄等)。設備100還包括磁場發(fā)生器140,其用于在結合表面112處和樣本室111的相鄰空間中可控地生成磁場B。磁場發(fā)生器例如可以由電磁體140實現(xiàn)，電磁體具有線圈和馬蹄型鐵芯，鐵芯具有兩個磁極尖端141和142。它可以任選地包括其他磁單元，例如試劑盒110(未示出)上方的(例如圓柱狀)磁體，通過疊加而共同生成磁場。借助于所生成的磁場，可以操控磁性顆粒MP，即磁化以及特定地移動(如果使用具有梯度的磁場)。于是，例如能夠將磁性顆粒MP吸引到結合表面112，以便加快關聯(lián)目標成分結合到所述表面。所述設備100應用光學模塊檢測磁性顆粒MP和實際感興趣的目標成分。為了消除或至少最小化背景的影響(例如樣本流體，諸如唾液、血液等)，檢測技術應當是表面特異性的。如上所述，這是通過利用受抑全內反射原理實現(xiàn)的。這個原理基于如下事實在入射光束LI被全內反射時，漸逝波傳播(以指數(shù)方式降落)到樣本室111中。如果這種漸逝波然后與具有和水不同折射率的另一介質，例如與磁性顆粒MP相互作用時，輸入光的一部分將耦合到樣本流體(這被稱為“受抑全內反射”)中，并且反射強度將減小(同時對于清潔的界面且沒有相互作用的情況，反射強度將為100%)。可以在通過引用并入本文中的WO2008/155723A1中找到這個流程的更多細節(jié)。上述種類的設備必須要應對的問題是，像唾液和血液(或血漿)的體液在物理和化學性質方面在患者間表現(xiàn)出很大差異。優(yōu)選地，生物傳感器中使用的化驗和激勵技術應當對這些變化是魯棒的。相關的問題是磁性顆粒的不可逆聚類。因為磁場B被用于向結合表面112吸引磁性顆粒MP，所以磁性顆粒MP變得被磁化，并且還開始彼此吸引。形成了磁性聚類鏈。在放大率足夠大的顯微鏡下可以清楚地觀測到這種效果。所述鏈由磁性顆粒MP彼此施加的磁力(所謂的珠-珠交互)維系在一起。在關閉磁激勵場B時，磁性顆粒不再被磁化(如果它們是順磁性的)，將所述鏈維系在一起的磁力消失。在正常情況下，所述鏈再次分裂成個體運動的珠。這一過程被稱為“可逆聚類”或磁性聚類磁場導致磁聚類，但一旦關閉磁場，聚類就再次消失。與可逆或磁性聚類相反，不可逆聚類也是可能的。有各種不可逆聚類的方式不可逆聚類能夠在沒有磁場的情況下發(fā)生(參考膠體化學)或者可以由于存在磁場而觸發(fā)。在不可逆聚類的情況下，當磁場被關閉時，聚類不會分裂成個體運動的珠子。不可逆聚類的量強烈取決于身體流體的組成，可能在患者之間變化很大。這種不可逆聚類的實際機制尚未被理解。一般而言，像圖I的設備測量的信號與待檢測的目標分子濃度成正比。這是設備的主要功能。高信號表示目標分子的高濃度，低信號表示目標分子的低濃度。然而，試驗還表明測量的信號受到不可逆聚類的量的影響。高濃度目標分子和大量不可逆聚類的組合將引起更低的信號。因此，不可逆聚類導致測量的信號的判讀錯誤。對于很多疾病而言，某種 物質(例如心臟標記)的高濃度表示身體中有機能失調。在儀器表示出低信號時，未注意到機能失調。這提出了一個問題。在下文中，將公開確定“聚類參數(shù)”的各種方法，聚類參數(shù)與(不可逆)聚類的程度相關。如果測量的信號大概不可靠或為了校正測量結果，聚類參數(shù)例如能夠用于發(fā)出警告。在圖I到7中，描述了第一種方法，其中利用了磁性顆粒和聚類的行為對磁場取向的依賴性。為了理解提出的方案，首先將參考圖2和3稍微詳細地解釋功能性磁性顆粒MP向結合表面112結合的過程。作為起點，假設測量點上方的樣本流體包含磁性顆粒MP (典型為超順磁性珠)，目標分子附著于它們之上。這里將不會進一步描述如何執(zhí)行這種培育反應。為了利用靶分子測量磁性顆粒的濃度，這些顆粒必須要結合到結合表面112上印刷的抗體。這些抗體特異性地捕捉目標分子。可以通過增強表面附近目標的濃度來加快目標和抗體之間這種結合反應的運動學。這是利用磁場B實現(xiàn)的。在打開磁場B時,磁力(垂直于結合表面)將磁性顆粒MP從液體向抗體所在的結合表面112驅動。這個過程被稱為激勵周期的“吸引階段”。上述過程的實質性方面是，盡管所有磁性顆粒(有或者沒有目標)都被磁場B向著結合表面吸引，但這些顆粒中僅有小部分將實際與表面接觸并能夠結合。磁性顆粒的第一部分將結合到原來空白的表面，但一旦達到特定的磁性顆粒表面覆蓋度，后面到達的磁性顆粒將會磁性聚集到已經結合的珠子。因為磁場通常與結合表面112形成一定的角度α(這個角度α取決于磁體磁極141、142之間的位置)，所以聚類CL中遠端珠子在漸逝光場外部，測量系統(tǒng)看不到。在連續(xù)磁場B下，在磁體中心C處分數(shù)表面覆蓋度約為10%，在磁體磁極尖端141、142處的區(qū)域P附近甚至更低(參考圖2)。為了允許磁性聚類的珠子到達結合表面112并結合，在第一吸引階段之后關閉磁場B。在這種情況下，聚類CL能夠分裂成個體運動的珠子，其一部分能夠通過擴散到達結合表面。這被稱為激勵周期的“擴散階段”。珠子的另一部分將擴散到液體通道中?？梢酝ㄟ^再次切換磁場B將這一部分送回表面。通過反復開關磁場B (總的激勵序列由很多激勵周期構成)，最終所有磁性顆粒都能夠結合到結合表面112。這是所述脈沖式激勵協(xié)議的本質。
從前文顯然看出，檢測信號的最大部分(90%)是通過聚類分裂成個體磁性顆粒且自由磁性顆粒向結合表面擴散的過程產生的。圖3示出了如果在磁場B已經關閉之后發(fā)生不完全分裂會發(fā)生什么。在圖3的左側部分，整個聚類CL被示為沿磁場B的場線取向。圖3的右部示出了在關閉磁場B之后這一聚類不完全分解成子聚類CLa、CLb。根本防止了屬于表面結合子聚類CLa的遠端磁性顆粒到達結合表面。從前一聚類釋放的更長片段CLb表現(xiàn)出更慢的擴散速率，將具有較小機會結合到表面112。在又一種情況下，表面上應當由足夠大自由空間容納更大片段。提到的這些效應將導致結合的磁性顆粒更低的信號。現(xiàn)在主要的問題是如何在由于低目標濃度導致的低水平信號和由于不可逆聚類的效應導致的低水平之間區(qū)分。通常，在馬蹄形磁體的中心C中測量結合磁性顆粒的表面濃度。在這一位置，測量最高的信號，點之間的可再現(xiàn)性最好。然而，如果考慮由磁場開關構成的脈沖式激勵，這種方法對擴散效應的敏感度較低，因為形成的鏈到結合表面的距離相當短。為了更好地看到擴散的效應，提出在鏈和結合表面之間生成更大的平均距離。馬蹄形磁體140生成的磁場線B的方向或多或少平行于結合表面112。在電磁體140的中心位置C處確實是這種情況(參考圖2)，其中場線和結合表面之間的角度α為0°。在更接近電磁體磁極尖端141、142之一的位置P處，磁場線B開始相對于表面形成有限角α。這基本是因為馬蹄形磁體的彌散場形狀或多或少是圓的一部分。接近磁極尖端位置角度α可以大到30°。在其最低能量狀態(tài)中，磁性顆粒鏈指向平行于磁場線B。于是，在磁極尖端附近的“第一場區(qū)域P”中，磁性顆粒和結合表面112之間的平均距離比馬蹄形磁體中心處“第二場區(qū)域C”中大得多。因此，在所述第一場區(qū)域P中測量的信號對珠擴散的變化，比第二場區(qū)域C處的信號敏感得多。這可以用于檢測不可逆聚類。在未出現(xiàn)不可逆聚類時，中心位置C處和磁極尖端位置P處的信號將或多或少相同。圖4示出了利用涂有表現(xiàn)出可逆聚類的抗生蛋白鏈菌素的磁珠進行的示范性測量的結果(在這里以及在下文中，曲線上的字母C表示中心位置的測量值，而P表示磁極尖端位置的測量；垂直軸表示相對單位的檢測信號S，而水平軸表示時間t)。激勵周期的“占空比”表示激勵周期中打開磁場的分數(shù)(即占空比表示“吸引階段”的相對持續(xù)時間，剩余持續(xù)時間由“擴散階段”填充)。調諧這一占空比，從而為磁極尖端的位置給予單個珠擴散的足夠時·間極尖的磁性顆粒有足夠時間達到結合表面并對檢測信號做貢獻。在圖4中這是由40%的占空比實現(xiàn)的，這表示珠子周期時間的40%是向結合表面吸引的，珠子周期時間60%自由向所有方向擴散。在圖5中所示的測量中，選擇的占空比高得多。在這種情況下，周期時間的90%用于吸引，周期時間的10%用于擴散。在極尖(上方曲線)測量的信號變得低于中心(底部曲線)處的信號，因為選擇的擴散時間太短(應當指出，信號S稱為“100%”的起動信號；因此將由位于圖中“更高信號”上方那些的S值表示)。極尖處的磁性顆粒不能及時到達結合表面。無論何時出現(xiàn)不可逆聚類，都會減緩聚類片段的擴散，因為判斷大于單個磁性顆粒，有更多來自流體的流體阻力。圖6示出了對于表現(xiàn)出不可逆聚類的抗生蛋白鏈菌素珠，作為時間t的函數(shù)的測量的信號。也可以通過顯微鏡試驗看到這一情況。在中心位置C處，單個磁性顆粒和片段之間的擴散差異較不顯著，因為這里，磁性顆?；蚱伪仨殧U散的距離較短。如圖4中所示，占空比為40%，對于這一具體情況，在中心C測量的信號稍微小于圖4中的對應信號。然而，在極尖位置P處，較慢的擴散防止了片段及時到達表面，即使對于40%的占空比也是如此。如果比較圖6和4的對應曲線，顯然可以看到這種情況。在極尖第一場區(qū)域P中獲得的檢測信號與在中心C處第二場區(qū)域中獲得的檢測信號S之間的比值減小。可以將這一比值用作不可逆聚類的度量。在圖7中所示的測量中，將占空比選擇為周期時間的90% (如圖5中那樣)。由于擴散時間不夠，所有檢測信號現(xiàn)在更低。馬蹄形磁體140生成的磁力指向主要垂直于結合表面112。磁性顆粒運送到磁體中心區(qū)域C大致等同于磁性顆粒到極尖區(qū)域P的運動。因此基本上，兩個區(qū)域都收集了相同量的珠子。在最后永久關掉磁場并且一直等待擴散過程完成時，預計在極尖位置P和中心位置C處信號量相同。在實踐中，并非始終能見到這種情況，因為珠子還擴散離開表面。然而，在觀測到可逆聚類的情況下，關閉占空比為90%的脈沖激勵在極尖附近的信號中給出額外貢獻(參考圖5中的曲線“P”)。在這種情況下，如果給予足夠多擴散時間，在激勵期間不能及時到達結合表面的珠子仍然能夠到達表面。對于不可逆聚類而言，幾乎觀測不到這樣的信號增強(參考圖7)。這種額外的信息還指向不可逆聚類行為。
總之，在與磁場大致平行于結合表面的磁體中心C附近的檢測信號相比時，在磁場相對于結合表面傾斜的激勵磁體的磁極尖端P附近測量檢測信號能夠提供關于不可逆聚類行為的信息。極尖處檢測信號和中心處檢測信號之比是用于不可逆聚類的量的度量。于是，可以向手持裝置中內置檢查。在不可逆聚類似乎表示測量的信號大概不可靠時，可以由評估單元132給出警告。在圖8到14中，描述了第二種方法，其中使用專門的聚類檢測單元確定聚類參數(shù)。圖8示意性示出了根據(jù)這種方法的傳感器裝置或設備200。類似于上述實施例，所述設備充當基于納米顆粒標簽，尤其是磁珠或顆粒MP的生物傳感器，其提供于試劑盒210的樣本室211中，可以利用電磁體241、242和243生成的電磁場致動。通常，利用能夠結合特定被分析物分子的抗體使磁性顆粒功能化。在化驗期間，可以通過磁力將顆粒MP吸引到樣本室211的“結合表面”212的“第一檢測區(qū)域”DRl中，其中結合顆粒的數(shù)目與樣本中存在的被分析物分子量正相關或逆相關。然后可以由“顆粒檢測單元”220利用任何對接近表面(即在第一檢測區(qū)域DRl中)的顆粒更敏感的技術檢測磁性顆粒MP (在圖中，可以布置顆粒檢測單元220/延伸到圖平面之外，以為其提供對第一檢測區(qū)域DRl的進出而不被部件262阻礙)。例如，檢測技術可以基于漸逝光場，例如如上所述的受抑全內反射(FTIR)。如上所述，像人血漿那樣的樣本流體似乎包含導致磁性顆粒MP不可逆聚合(“聚類”)的干擾因子，導致化驗性能降低。例如，在被分析物是心臟肌鈣蛋白I的情況下，這可能導致假陰性結果。因此精確確定磁顆?；炛芯垲惖牧康姆椒〞軐氋F，其或者作為控制(例如，如果聚類的量超過特定閾值令特定測量的結果不合格)或者作為校準器如果聚類的量和化驗性能降低之間的關系已知，可以校正獲得的結果，由此獲得更精確的測量結果O在設備200中，通過提供“聚類檢測單元”260實現(xiàn)上述目的，聚類檢測單元允許確定與磁性顆粒MP在“第二檢測區(qū)域"DR2中的聚類的程度相關的“聚類參數(shù)”。簡而言之，光通過包含樣本室211 (具有流體樣本)的試劑盒210透射，流體樣本中散布了磁性納米顆粒MP。在設備200中，這是通過最簡單直接的方式實現(xiàn)的將光源261放在試劑盒210 —側，并由檢測器262 (例如圖像傳感器)收集通過另一側的第二檢測區(qū)域DR2透射的光。觀測到在打開磁體241、242時，聚類檢測單元260記錄的強度增大。在關閉線圈并且顆粒再次分散成隨機圖案時，強度再次減小。如下文將更詳細解釋的，強度變化允許確定期望的“聚類參數(shù)”(聚類的程度)。聚類檢測單元260的布置對利用頂端線圈243提出了一些限制，線圈不包括芯材料，允許光通過。圖9示出了改造的設備300，其中利用試劑盒310—側(在圖中為頂側，但也可以在底部或任何其他側)的(非磁性)反射層363，例如鋁箔規(guī)避了這些限制。在這一實施例中，光兩次通過第二檢測區(qū)域DR2中的樣本?？梢詫⒕垲悪z測單元360的光源361和檢測器362都定位在同一側，例如試劑盒310的底側。圖10圖示了另一設備400，其中聚類檢測單元460的光源461發(fā)射的光在試劑盒410的小面被折射，通過第二檢測區(qū)域DR2中的液體行進，在試劑盒410的相對小面處再次被折射，并到達檢測器462。如果優(yōu)選僅分析試劑盒的小部分，可以利用與底部線圈在同一側或相對側的顯微 鏡物鏡這樣做。除了監(jiān)測透射光強度的變化之外，當然也能夠將檢測器定位在光源的基本光路外部，由此僅收集散射光。在低顆粒濃度下，這可能更有利，因為難以在高光強下檢測非常小的變化。在設備200、300和400中，收集光的檢測器262、362或462連接到具有軟件的控
制單元(未示出)，控制單元能夠為電磁線圈供電并記錄檢測器測量的強度。圖11中示出了測量的透射強度I的典型記錄。該記錄是在類似于設備300的實驗裝置中獲得的，其中光通過樣本反射回記錄強度的檢測器(圖像傳感器)。該圖實際包括在所記錄圖像的三個不同位置獲得的三條測量曲線。在記錄期間，反復開關電磁體。觀測到在打開磁體時，磁性顆粒在鏈中對準并且記錄的強度增大。在關閉線圈并且顆粒再次分散成隨機圖案時，強度再次減小。在圖13中更詳細地例示了這點，其中在垂直軸上表示(按任意單位)強度I，其中由檢測區(qū)域的對應顯微鏡圖像表示測量點。圖示的時間跨度對應于磁體的一次開/關周期，其中在t=0s和O. 5s打開磁體,在t=0. 5s和2s關閉磁體。觀測到在磁性顆粒表現(xiàn)出(不可逆)聚類時，在磁場作用期間形成的鏈不會(充分)再次分散。盡管圖11的圖示出了在非聚類樣本中獲得的信號樣本，圖12顯示了在表現(xiàn)出嚴重聚類的樣本中觀測到的信號變化。從圖11和12的比較可以看出，在獲得的兩條曲線之間有很多差異，例如基線(局部最小值)的增大、幅度的差異以及每個個體脈沖的弛豫時間(在這個細節(jié)水平上看不到)?？梢岳眠@些差異中的每個量化聚類的量，即“聚類參數(shù)”。尤其是給定時間t的相對幅度證明提供了測量特定樣本中聚類的量的魯棒方式，這個相對幅度Im1定義為Irel=100% ·(局部極大值-局部極小值)/局部極小值。圖14針對表現(xiàn)出不同程度聚類同時包含相同量被分析物的樣本，示出聚類的量和化驗性能的測量?；炐阅鼙唤o出為信號變化S，定義為在終點，即在沖洗步驟(左軸，開放的菱形)之后，從顆粒檢測單元(20，320，420)獲得的(例如FTIR)測量信號。聚類被給出為聚類化驗中測量的相對幅度Irel(右軸，完整菱形)，可以將其解釋為顆粒遷移率較低的信號遷移率更低(聚類的程度更高)。通過混合包含相同量被分析物的兩種樣本獲得用于測量的樣本，其中第一樣本未表現(xiàn)出聚類，而第二樣本表現(xiàn)出嚴重聚類。水平軸表示第二樣本的相對量，即誘發(fā)聚類的樣本的百分比BP?？梢钥闯觯T發(fā)聚類的第二樣本百分比BP越高，信號幅度S越低(這表示有更多聚類)。從圖14顯然看出，聚類的量Irel和化驗性能S是相關的，其中這種方法對樣本中的聚類的程度非常敏感。圖14還示出了存在聚類的結果是磁性標簽化驗中的測量的信號變化S未正確反映樣本中被分析物實際濃度。如上所述，在這種情況下可以通過兩種方式使用聚類的量Irel的確定I.作為控制如果樣本顯示出超過特定閾值的聚類，取消測量的資格，設備返回錯誤消息。這對于排除假陰性是非常重要的。2.作為校準器在其知道一定量的聚類如何導致磁性顆粒與表面的相互作用減小(因此減小結束信號)時，能夠校正這種減小的相互作用并將信號變化(S)的結果乘以取 決于聚類的量(Iw)的倍數(shù)。除了不希望上述聚類之外，應當指出，所提出的技術還能夠測量由于存在目標而誘發(fā)的聚類。作為范例，將涂布有針對心臟肌鈣蛋白I (CTnI)分子第一抗原決定基的抗體的磁性顆粒與涂布有針對cTnl第二抗原決定基的抗體的磁性顆?；旌?。最后，還增加cTnl(濃度為800pM)并在聚類化驗中分析完成的混合物。作為控制，還分析兩種磁性顆粒單獨的(沒有cTnI)混合物。測量數(shù)據(jù)(可以與圖11和12相比)表明，存在800pM cTnl導致嚴重聚類，因為cTnl分子可以被兩個顆粒同時結合。圖15示出了從這些測量獲得的相對幅度Irel的時間過程。因為這種化驗格式不需要顆粒結合到表面，其中常常有大部分顆粒不能參與形成分子夾層結構，這是效率很高的化驗格式。盡管SOOpM仍然是較高濃度，但從圖15可以看出，在這一濃度，聚類已經非常嚴重。在圖14中觀測到，在小得多程度的聚類下聚類化驗已經很敏感，因此預計將能夠比這里所示更靈敏地測量。此外，可以進一步優(yōu)化化驗自身(顆粒濃度，單個顆粒上兩種抗體，磁性激勵方案等)。盡管上文參考特定實施例描述了本發(fā)明，但各種修改和擴展是可能的，例如-傳感器可以是任何適當?shù)膫鞲衅?，以基于顆粒的任何性質檢測傳感器表面上或附近磁性顆粒的存在，例如，它能夠通過磁性方法(例如磁阻、霍爾、線圈)、光學方法(例如成像、熒光作用、化學發(fā)光、吸收、散射、漸逝場技術、表面等離子體激元諧振、拉曼等)、聲學檢測(例如表面聲波、體聲波、懸臂、石英晶體等)、電檢測(例如導電、阻抗、電流分析法、氧化還原循環(huán))、其組合等來檢測。-除了分子化驗之外，還可以利用根據(jù)本發(fā)明的傳感器裝置檢測更大的一半(moiety)，例如細胞、病毒或細胞或病毒的部分、組織提取液等。-可以在有或沒有相對于傳感器表面掃描傳感器元件的情況下進行檢測。-可以將測量數(shù)據(jù)推導為終點測量，以及通過動態(tài)地或間歇地記錄信號。-可以由感測方法直接檢測充當標簽的顆粒。還可以在檢測之前進一步處理顆粒。進一步處理的范例是，增加材料或修改標簽的(生物)化學或物理性質以便于檢測。-可以將該裝置和方法用于幾種生物化學化驗類型，例如結合/釋放化驗、夾層化驗、競爭化驗、轉移化驗、酶催化驗等。它尤其適于DNA檢測，因為大規(guī)模復用容易成為可能，可以通過噴墨印刷找襯底上噴寫不同的寡量(oligo)。
-該裝置和方法適于傳感器復用(即并行使用不同的傳感器和傳感器表面)、標簽復用(即并行使用不同類型的標簽)和反應室復用(即并行使用不同的反應室)。-該裝置和方法能夠用作針對小樣本體積的快速、魯棒和易用的護理點生物傳感器。反應室可以是用于緊湊讀取器的一次性物品，包含一個或多個場產生模塊和一個或多個檢測模塊。而且，本發(fā)明的方法和系統(tǒng)可用于自動化高處理量測試。在這種情況下，反應室例如是井形板或透明小容器，配合到自動化儀器中。-納米顆粒表示至少一個尺度在3nm和5000nm之間,優(yōu)選在IOnm和3000nm之間，更優(yōu)選在50nm和IOOOnm之間的顆粒。最后要指出，在本申請中，術語“包括”不排除其他元件或步驟，“一”或“一個”不 排除多個，并且單個處理器或其他單元可以完成幾個模塊的功能。本發(fā)明體現(xiàn)于每個新穎特征和特征的每種組合。此外，權利要求中的參考符號不應被解釋為限制其范圍。
權利要求
1.一種用于檢測樣本室(111, 211，311，411)中的磁性顆粒(MP)的方法，包括 a)確定與第一檢測區(qū)域(P，C；DR1)中的磁性顆粒(MP)的量相關的顆粒參數(shù)(S)； b)確定與第二檢測區(qū)域(P，C；DR2)中的磁性顆粒(MP)的聚類的程度相關的聚類參數(shù)(Irel); C)基于所述聚類參數(shù)評估所述顆粒參數(shù)。
2.根據(jù)權利要求I所述的方法， 其特征在于，如果所述聚類參數(shù)(Irel)偏離預定值集合則生成警報信號。
3.根據(jù)權利要求I所述的方法， 其特征在于，基于所述聚類參數(shù)(Irei)校正所述顆粒參數(shù)(S)。
4.一種用于在根據(jù)權利要求I所述的方法中應用的設備(100)，包括 a)磁場發(fā)生器(140)，其用于在樣本室(111)中生成磁場(B)，所述磁場在所述樣本室的結合表面(112)的第一場區(qū)域(P)和第二場區(qū)域(C)中分別相對于所述結合表面(112)具有不同的傾斜； b)傳感器元件(121，131)，其用于檢測第一和第二場區(qū)域(P，C)中的磁性顆粒(MP)； c)評估單元(132)，其用于使所述第一和第二場區(qū)域(P，C)的檢測信號彼此相關。
5.一種用于在根據(jù)權利要求I所述的方法中應用的設備(100)，包括 a)磁場發(fā)生器(140)，其用于在樣本室(111)中生成磁場(B)，所述磁場在所述樣本室(111)的結合表面(112)的第一場區(qū)域(P)中傾斜于所述結合表面(112)； b)傳感器元件(121，131)，其用于檢測所述第一場區(qū)域(P)中的磁性顆粒(MP)； c)評估單元(132)，其用于使在永久去激活所述磁場(B)之前和之后獲得的檢測信號相關。
6.一種用于在根據(jù)權利要求I所述的方法中應用的設備(200, 300,400),包括 a)顆粒檢測單元(220，320，420)，其用于檢測所述第一檢測區(qū)域(DRl)中的磁性顆粒(MP)； b)聚類檢測單元(260，360，460)，其用于檢測所述第二檢測區(qū)域(DR2)中的磁性顆粒(MP)的聚類的程度(Irel)。
7.根據(jù)權利要求6所述的設備(200，300，400)， 其特征在于，所述聚類檢測單元包括光源(261，361，461)和光檢測器(262，362，462)，所述光檢測器被布置成測量所述第二檢測區(qū)域(DR2)中的光透射。
8.根據(jù)權利要求7所述的設備(300，400)， 其特征在于，所述聚類檢測單元包括至少一個反射和/或折射界面(363)，光在其從所述光源(361，461)到所述光檢測器(362，462)的途中遇到所述界面。
9.根據(jù)權利要求I所述的方法或根據(jù)權利要求4到6中的任一項所述的設備(100，200,300,400), 其特征在于，有磁場發(fā)生器(140，141，142 ;241，242 ;341，342 ;441，442)，其用于生成作用于所述磁性顆粒(MP)的磁場(B)。
10.根據(jù)權利要求9所述的方法或設備(100，200，300，400)， 其特征在于，所述磁場(B)在所述磁性顆粒(MP)上向著所述樣本室(111，211，311，411)的結合表面(112，212，312，412)生成吸引力。
11.根據(jù)權利要求9所述的方法或設備(100，200，300,400), 其特征在于，所述磁場(B)被調制，尤其是被反復開關。
12.根據(jù)權利要求6和11所述的設備(200，300，400)， 其特征在于，關于所述聚類檢測單元(260，360，460)的檢測信號的局部相對幅度(Irel)對其進行評估。
13.根據(jù)權利要求I所述的方法或根據(jù)權利要求4到6中的任一項所述的設備(100，.200.300.400), 其特征在于，所述樣本室(111，211，311，411)包括覆蓋有針對磁性顆粒(MP )的結合部位的結合表面(112，212，312，412)。
14.根據(jù)權利要求I所述的方法或根據(jù)權利要求4到6中的任一項所述的設備(100，.200.300.400), 其特征在于，利用光學、磁性、機械、聲學、熱或電檢測流程來檢測所述磁性顆粒(MP)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于檢測樣本室(111)中的磁性顆粒(MP)的方法和關聯(lián)設備(100)。該方法包括確定與第一檢測區(qū)域(P，C)中的磁性顆粒(MP)的量相關的“顆粒參數(shù)”，確定與第二檢測區(qū)域(P，C)中的磁性顆粒(MP)的聚類的程度相關的“聚類參數(shù)”，以及基于所述聚類參數(shù)評估所述顆粒參數(shù)。公開了可以在所述方法中應用的各種設備。在一種設備(100)中，在樣本室(111)中生成磁場(B)，使其在第一和第二場區(qū)域(P，C)中具有不同的傾斜和/或使其相對于至少一個場區(qū)域中的結合表面(112)傾斜。然后在持久關閉傾斜磁場之前和之后檢測所述第一和第二場區(qū)域中和/或所述至少一個場區(qū)域中的磁性顆粒(MP)。所得到的檢測信號彼此相關以確定聚類參數(shù)。在其他實施例中，可以在施加開關的磁場期間從光透射測量確定聚類參數(shù)。
文檔編號H01F1/00GK102947900SQ201080067561
公開日2013年2月27日 申請日期2010年11月30日 優(yōu)先權日2010年6月22日
發(fā)明者J·B·A·D·范佐恩, M·M·奧夫揚科, T·H·埃弗斯, M·J·J·希伯爾斯 申請人:皇家飛利浦電子股份有限公司