專(zhuān)利名稱(chēng)：腐殖質(zhì)還原棒桿菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于環(huán)境與新能源技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株具產(chǎn)電及腐殖質(zhì)呼吸活性的腐 殖質(zhì)還原棒桿菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腐殖質(zhì)呼吸是近年來(lái)倍受關(guān)注的新型微生物能量代謝方式。腐殖質(zhì)呼吸，又稱(chēng)醌 呼吸，是指微生物以腐殖質(zhì)為末端電子受體，通過(guò)氧化電子供體偶聯(lián)腐殖質(zhì)還原，并從這一 過(guò)程中貯存生命活動(dòng)的能量。能進(jìn)行腐殖質(zhì)呼吸的微生物稱(chēng)為腐殖質(zhì)還原菌。目前，腐殖 質(zhì)呼吸的環(huán)境重要性已被廣泛接受與認(rèn)同腐殖質(zhì)呼吸不僅與碳、氮、磷等元素的自然循環(huán) 過(guò)程相偶聯(lián)，而且還顯著影響重金屬與有機(jī)污染物還原轉(zhuǎn)化。腐殖質(zhì)還原菌在污染物原位 修領(lǐng)域有很好的應(yīng)用前景，分離純化新的腐殖質(zhì)還原菌成為近年研究熱點(diǎn)。微生物燃料電池(Microbial fuel cell，MFC)是以微生物為催化劑將有機(jī)物中的 化學(xué)能直接轉(zhuǎn)化成電能的裝置，具有產(chǎn)電與有機(jī)廢棄物處置的雙重功效。影響產(chǎn)電效率的 因素包括微生物代謝活性、陽(yáng)/陰極材料等。其中，微生物產(chǎn)電能力是影響MFC輸出功率密 度的最重要因素。近年研究發(fā)現(xiàn)，部分鐵還原菌及腐殖質(zhì)還原菌都具有高效產(chǎn)電活性，研究最多的 為希瓦氏菌屬(Shewanella)與地桿菌屬(Geobacter)。這些菌大都在中性條件下生長(zhǎng)，且 多為革蘭氏陰性菌。堿性條件有助于提高產(chǎn)電效率，但是堿性環(huán)境不利于大部分微生物生 長(zhǎng)，因此本專(zhuān)利旨在開(kāi)發(fā)堿性腐殖質(zhì)還原及產(chǎn)電微生物。經(jīng)文獻(xiàn)和專(zhuān)利檢索，尚未發(fā)現(xiàn)在堿 性條件下具有腐殖質(zhì)還原及產(chǎn)電活性菌株的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種堿性條件下生長(zhǎng)的腐殖質(zhì)還原及 產(chǎn)電高效菌株-腐殖質(zhì)還原棒桿菌(Corynebacterium humireducens)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述腐殖質(zhì)還原棒桿菌的分離純化方法。本發(fā)明的還有一個(gè)目的是提供所述腐殖質(zhì)還原棒桿菌的應(yīng)用。本發(fā)明篩選所得的腐殖質(zhì)還原棒桿菌(Corynebacteriumhumireducens)，于2008 年4月14日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯 路中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)，保藏號(hào)為CGMCC 2452。所述腐殖質(zhì)還原棒桿菌具有如下形態(tài)和生理生化特性1)菌體形態(tài)特性采用常規(guī)的細(xì)菌電子顯微鏡觀(guān)察，該菌株為革蘭氏陽(yáng)性菌；掃描電子顯微鏡結(jié)果 顯示菌株為棒狀，菌體大小為0. 5 0. 7iimXl. 5 2. 5iim，不運(yùn)動(dòng)。2)菌落形態(tài)特性在牛肉膏蛋白胨瓊脂固體培養(yǎng)基上好氧培養(yǎng)24小時(shí)后，菌落黃色，表面光滑，不 透明，邊緣整齊，菌落直徑為2 3mm。
3
3)生理生化特征耐鹽性強(qiáng)，能在0 12%氯化鈉(NaCl)的培養(yǎng)液中生長(zhǎng)；最適生長(zhǎng)溫度為37°C， 適宜生長(zhǎng)的pH值為8 9。具兼性厭氧生長(zhǎng)能力。接觸酶陽(yáng)性，化能異養(yǎng)菌，發(fā)酵代謝，不 產(chǎn)酸，不產(chǎn)氣，能還原硝酸鹽。在厭氧條件下，其電子供體利用譜較廣，能以甲酸、乙酸、丙 酸、乳酸、乙醇或蔗糖為電子供體還原AQDS，不能利用檸檬酸或甘油。4)分子生物學(xué)特征采用SDS-蛋白酶K、氯仿-異戊醇(體積比24 1)抽提、0. 6體積異丙醇沉淀 的方法提取細(xì)菌總DNA。采用細(xì)菌16SrDNA通用引物F8和R1542擴(kuò)增細(xì)菌的16SrDNA，在 1500bp附近出現(xiàn)明顯的條帶，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收后進(jìn)行序列測(cè)定，將獲得的DNA序列輸 入GenBank，以Blastn程序?qū)?shù)據(jù)庫(kù)中的所有序列進(jìn)行比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明菌株同 源性最近的6株菌都屬于棒桿菌，但相似性均小于97%，界定為新種。本發(fā)明同時(shí)提供了所述腐殖質(zhì)還原棒桿菌的分離純化方法通過(guò)對(duì)本實(shí)驗(yàn)室微生 物燃料電池的堿性污泥陽(yáng)極液進(jìn)行分離純化得到的。具體分離純化方法包括以下步驟1)取微生物燃料電池的污泥陽(yáng)極液接種于液體分離培養(yǎng)基中；液體分離培養(yǎng)基的組成是每升液體分離培養(yǎng)基中含1. 0g葡萄糖(電子供體)、 16gAQDS (電子受體)、2. 5g NaHC03、0.25g NH4C1、0. 678g NaH2P04.2H20、0. lg KCl、10.0mL維 生素溶液、10. OmL微量元素溶液，pH值為10。其中，維生素溶液是每升去離子水中含2. Omg 生物素、2. Omg葉酸、10. Omg維生素B6、5. Omg硫胺素、5. Omg核黃素、5. Omg煙酸、5. Omg泛酸 鈣、0. lmg維生素B12、5. Omg對(duì)氨基苯甲酸、5. Omg硫辛酸；微量元素溶液是每升去離子水中 含 1. 5g 氨三乙酸、3. Og MgS04 7H20、0. 5g MnS04 H20、1. Og NaCl、0. lg FeS04 7H20、0. lg CoCl2 6H20、0. lg CaCl2、0. lg ZnS04 7H20、0. Olg CuS04 5H20、0. Olg A1K(S04)2 12H20、 0. Olg H3B03、0. Olg Na2Mo04 2H20。2)往已接種污泥微生物燃料電池的陽(yáng)極液的液體分離培養(yǎng)基中鼓充高純氮?dú)獠?少于30分鐘，鼓氣完畢蓋橡膠蓋加鋁蓋密封，置于厭氧工作站(N2和C02按照80 20的體 積比的混合)，30°C靜置培養(yǎng)，觀(guān)察培養(yǎng)液的顏色變化情況。3)當(dāng)培養(yǎng)液顏色從無(wú)色變?yōu)樯铧S色時(shí)，以10%的接種量將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至另一新 鮮的液體分離培養(yǎng)基，厭氧操作及厭氧培養(yǎng)條件同(2)。如此富集培養(yǎng)三次。4)將第四代反應(yīng)后的培養(yǎng)液采用稀釋平板法稀釋到105 106個(gè)/mL，將稀釋后 的培養(yǎng)液0. lmL均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基上，置于厭氧工作站(N2/C02 = 80/20) 30°C培養(yǎng) 48h，挑取單菌落進(jìn)行分離與純化。所述LB固體培養(yǎng)基的組成是蛋白胨10g/L酵母提取物 5g/L，NaCl 10g/L,瓊脂粉 20g/L, pH 值為 10。本發(fā)明所述腐殖質(zhì)還原棒桿菌在厭氧條件下的電子供體利用譜較廣，能以甲酸、 乙酸、丙酸、乳酸、乙醇或蔗糖為電子供體還原AQDS，可廣泛應(yīng)用于有機(jī)污染物的原位生物修復(fù)。本發(fā)明所述腐殖質(zhì)還原棒桿菌堿性條件下具有高效的腐殖質(zhì)還原能力及產(chǎn)電活 性，其在堿性條件下產(chǎn)電穩(wěn)定，燃料利用譜較廣，能利用乳酸、葡萄糖、蔗糖、淀粉、丁二酸、 麥芽糖或木糖等多種有機(jī)物，可用于微生物燃料電池發(fā)電技術(shù)及高濃度有機(jī)廢棄物的資源 化處置。
本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明提供了一種新的在堿性條件下具有腐殖質(zhì)還原及產(chǎn)電活性的棒桿菌菌株， 為堿性條件下腐殖質(zhì)還原及微生物燃料電池發(fā)電技術(shù)提供了一種新的高效微生物菌株，應(yīng) 用前景廣闊。


圖1為本發(fā)明腐殖質(zhì)還原棒桿菌CGMCC 2452在20000倍下的掃描電鏡照片圖2為腐殖質(zhì)還原棒桿菌CGMCC 2452的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù) 圖3為腐殖質(zhì)還原棒桿菌CGMCC 2452在pH為9時(shí)還原AQDS的電子利用情況圖4為腐殖質(zhì)還原棒桿菌CGMCC 2452堿性條件下利用不同底物對(duì)應(yīng)的產(chǎn)電活性
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。試驗(yàn)所用乳酸、乙酸、甲酸、丙酸、乙 醇、蔗糖或葡萄糖等不一一在實(shí)施例中贅述。但并不因此限定本發(fā)明范圍。實(shí)施例1 本發(fā)明腐殖質(zhì)還原棒桿菌的分離純化1)從pH為10的污泥微生物燃料電池中取5mL陽(yáng)極液接種于IOOmL液體分離培養(yǎng)基中。所述污泥微生物燃料電池的構(gòu)造在專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?00910041235. 4的專(zhuān)利申請(qǐng)中已
做詳細(xì)描述。所述液體分離培養(yǎng)基的組成是每升液體分離培養(yǎng)基中含1. Og葡萄糖(電子供 體)、16g AQDS(電子受體)、2. 5g NaHC03、0. 25gNH4Cl、0. 678g NaH2PO4 · 2Η20、0· Ig KCl, 10. OmL維生素溶液、10. OmL微量元素溶液，pH值為10。其中，維生素溶液是每升去離子 水中含2. Omg生物素、2. Omg葉酸、10. Omg維生素B6、5. Omg硫胺素、5. Omg核黃素、5. Omg 煙酸、5. Omg泛酸鈣、0. Img維生素B12、5. Omg對(duì)氨基苯甲酸、5. Omg硫辛酸；微量元素溶 液是每升去離子水中含1.5g氨三乙酸、3. Og MgSO4 · 7Η20、0· 5g MnSO4 ‘ H2OU-Og NaCl、 0. IgFeSO4 ·7Η20、0· Ig CoCl2 ·6Η20、0· Ig CaCl2,0. Ig ZnSO4 ·7Η20、0· OlgCuSO4 · 5Η20、0· Olg AlK(SO4)2 · 12Η20、0· Olg H3BO3>0. OlgNa2MoO4 · 2Η20。2)往已接種污泥微生物燃料電池的陽(yáng)極液的液體分離培養(yǎng)基中鼓充高純混合氣 體不少于30分鐘，所述高純混合氣體可采用N2和CO2按照80 20的體積比的混合氣體， 鼓氣完畢用鋁蓋密封，置于厭氧工作站(N2AX)2 = 80/20)，30°C靜置培養(yǎng)，觀(guān)察培養(yǎng)液的顏 色變化情況。3)當(dāng)培養(yǎng)液顏色從無(wú)色變?yōu)樯铧S色時(shí)，以10%的接種量將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至另一新 鮮的液體分離培養(yǎng)基，鼓充高純混合氣體不少于30分鐘，鼓氣完畢用鋁蓋密封，置于厭氧 工作站30°C靜置培養(yǎng)。如此富集培養(yǎng)三次。4)將第四代反應(yīng)后的培養(yǎng)液采用稀釋平板法稀釋到10_5 10_6，將稀釋后的培養(yǎng) 液0. ImL均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基上，置于厭氧工作站(N2/C02 = 80/20) 30°C培養(yǎng)48h，挑 取單菌落純化，即得所述菌株(Corynebacterium humireducens)，于2008年4月14日保藏 在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路中國(guó)科學(xué)院微 生物研究所)，保藏號(hào)為CGMCC 2452。
所述LB固體培養(yǎng)基的組成是蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，瓊脂 粉 20g/L，pH 值為 10。實(shí)施例 2 菌株(Corynebacterium humireducens)的生理生化特性菌株為非發(fā)酵型兼性厭氧菌，耐鹽堿。生長(zhǎng)溫度范圍為25 40°C，45°C以上及 10°C以下不能生長(zhǎng)；生長(zhǎng)PH范圍為7.0 11. 0(最適pH9.0)；生長(zhǎng)所需NaCl %為0 12% O 13%不能生長(zhǎng))。根據(jù)生理生化特性，將該菌鑒定為棒桿菌(Corynebacteria)。表1發(fā)明菌株的生理生化特征 +表示呈陽(yáng)性反應(yīng)；-表示呈陰性反應(yīng)實(shí)施例 3 菌株(Corynebacterium humireducens)的分子分類(lèi)地位如附圖2所示，與發(fā)明菌株同源性最近的6株菌都屬于棒桿菌，分別 是C. marinum(相似性 96. 9 % , 1393bp), C. testudinoris (96. 8 %, 1395bp), C. halotolerans(96. 4 %, 1392bp) > C. felinum(96. 0 %, 1383bp) > C. singulare (96. 0 %, 1297bp)及C. freiburgense(95. 9%,1395bp)。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育理論，菌株間相似性只有大于 97%，才能認(rèn)為是相同菌株，目標(biāo)菌株與其最相近菌株C. marinum的相似性也只有96. 9%， 故該菌界定為新種。結(jié)合上述的生理生化特性、16SrRNA序列比對(duì)結(jié)果，本發(fā)明腐殖質(zhì)還原棒桿菌 歸屬于棒桿菌屬，為該屬菌的一個(gè)新種，命名為腐殖質(zhì)還原棒桿菌(Corynebacterium humireducens)。實(shí)施例4 本發(fā)明腐殖質(zhì)還原棒桿菌在pH為9時(shí)利用乳酸還原AQDS試驗(yàn)液體培養(yǎng)基配方每升去離子水中含檸檬酸鐵2. 25g，NaHC032. 5g，NH4Cl 0. 25g， NaH2PO4 · 2H20 0. 678g，KCl 0. lg，維生素溶液和微量元素溶液各10. OmL (維生素溶液和微 量元素溶液成分同實(shí)施例1)，用0. 5mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH分別為9，于121°C滅菌20分鐘，滅菌后添加滅菌的乳酸溶液，混合均勻，乳酸終濃度為1.0g/L。從保存腐殖質(zhì)還原棒桿菌 (Corynebacterium humireducens)的斜面用接種針挑取菌苔2環(huán)接種至LB液體培養(yǎng)基中， 于30°C，180轉(zhuǎn)/分鐘搖床活化菌體9h，使細(xì)菌數(shù)量達(dá)到108(CFU/mL)數(shù)量級(jí)。以10%的接 種量接種活化菌液于液體培養(yǎng)基中，厭氧工作站(N2AX)2 = 80/20)下30°C靜置培養(yǎng)；同時(shí) 設(shè)置不加菌的對(duì)照，觀(guān)察培養(yǎng)液的顏色變化情況。每隔1天取4mL培養(yǎng)液，采用紫外-可見(jiàn) 分光光度計(jì)在450nm處測(cè)定還原態(tài)AQDS (AH2DS)含量，以AH2DS濃度為指標(biāo)，驗(yàn)證菌株以乳 酸為電子供體還原AQDS能力。結(jié)果見(jiàn)附圖3所示，附圖3中縱坐標(biāo)為AH2DS濃度(單位， mmol/L)，橫坐標(biāo)為時(shí)間(單位，天)，從上至下的曲線(xiàn)依次是乙酸、乳酸為電子供體和對(duì)照 的實(shí)驗(yàn)結(jié)果曲線(xiàn)。從附圖3結(jié)果可知，以葡萄糖為電子供體時(shí)生成的AH2DS濃度不斷上升， 說(shuō)明C. humireducens CGMCC 2452在體系pH為9時(shí)能夠利用乳酸還原AQDS。實(shí)施例5 本發(fā)明腐殖質(zhì)還原棒桿菌在pH為9時(shí)利用乙酸還原AQDS試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)方法同實(shí)施例4，不同的是電子供體為乙酸，每隔一段時(shí)間測(cè)定AH2DS濃度， 結(jié)果見(jiàn)附圖3。從附圖3可知，以乙酸為電子供體時(shí)生成的AH2DS濃度不斷上升，說(shuō)明 C. humireducens CGMCC2452在體系pH為9時(shí)能夠利用乙酸還原AQDS。實(shí)施例6 本發(fā)明腐殖質(zhì)還原棒桿菌在pH為9時(shí)利用葡萄糖為燃料的產(chǎn)電活性驗(yàn) 證實(shí)驗(yàn)方法與步驟同發(fā)明專(zhuān)利“產(chǎn)氣腸桿菌在微生物發(fā)電方面的應(yīng)用及其發(fā)電方 法”(周順桂，等.專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?00810029222.0)實(shí)施例1。不同的是陽(yáng)極液pH值為9，接 種物為本發(fā)明腐殖質(zhì)還原棒桿菌菌懸液，陽(yáng)極液中葡萄糖濃度為1.0g/L，陰陽(yáng)極通過(guò)1000 歐姆外阻連接。根據(jù)輸出電壓數(shù)據(jù)，計(jì)算體積功率密度，結(jié)果見(jiàn)附圖4所示，附圖4中縱坐 標(biāo)為功率密度(單位，mW/m3)，橫坐標(biāo)為時(shí)間(單位，小時(shí))，從上至下的曲線(xiàn)依次是乳酸、葡 萄糖為燃料和對(duì)照的實(shí)驗(yàn)結(jié)果曲線(xiàn)。從附圖4可知陽(yáng)極液pH值為9、葡萄糖濃度為l.Og/ L時(shí)，其最大體積功率密度為密度112. 49mff/m3,不接菌的MFC其體積功率則為零，說(shuō)明本發(fā) 明腐殖質(zhì)還原棒桿菌在堿性條件下能夠利用葡萄糖產(chǎn)電。實(shí)施例7 本發(fā)明腐殖質(zhì)還原棒桿菌pH為9時(shí)利用乳酸為燃料的產(chǎn)電活性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)方法與步驟同實(shí)施例6，不同的是陽(yáng)極液中燃料為lg/L的乳酸，以陽(yáng)極液中 不加燃料的MFC為對(duì)照，根據(jù)輸出電壓數(shù)據(jù)，計(jì)算體積功率密度，結(jié)果見(jiàn)附圖4所示。從附 圖4可知，腐殖質(zhì)還原棒桿菌利用乳酸為燃料產(chǎn)電的最大體積功率密度為319. 65mW/m3，說(shuō) 明腐殖質(zhì)還原棒桿菌在堿性條件下能夠利用乳酸產(chǎn)電。
權(quán)利要求
一種腐殖質(zhì)還原棒桿菌(Corynebacterium humireducens)，于2008年4月14日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC 2452。
2.—種權(quán)利要求1所述腐殖質(zhì)還原棒桿菌的分離方法，其特征在于包括以下步驟(1)取污泥微生物燃料電池的陽(yáng)極液接種于PH值為10的液體分離培養(yǎng)基中；(2)往已接種污泥微生物燃料電池的陽(yáng)極液的液體培養(yǎng)液中鼓充高純混合氣體后密 封，厭氧靜置培養(yǎng)；(3)當(dāng)培養(yǎng)液顏色從無(wú)色變?yōu)辄S色時(shí)以10%的接種量富集培養(yǎng)；(4)將富集培養(yǎng)后的培養(yǎng)液厭氧培養(yǎng)，挑取單菌落進(jìn)行分離與純化。
3.—種權(quán)利要求1所述腐殖質(zhì)還原棒桿菌的應(yīng)用，其特征在于應(yīng)用于有機(jī)污染物的原 位生物修復(fù)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于應(yīng)用所述腐殖質(zhì)還原棒桿菌在堿性環(huán)境下 利用乳酸、乙酸、甲酸、丙酸、乙醇或蔗糖還原有機(jī)污染物。
5.一種權(quán)利要求1所述腐殖質(zhì)還原棒桿菌的應(yīng)用，其特征在于應(yīng)用于微生物燃料電池 發(fā)電或高濃度有機(jī)廢棄物的資源化處置。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于應(yīng)用所述腐殖質(zhì)還原棒桿菌在堿性條件下 利用微生物燃料電池的乳酸、葡萄糖、蔗糖、淀粉、丁二酸、麥芽糖或木糖燃料發(fā)電。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種腐殖質(zhì)還原棒桿菌及其應(yīng)用。所述腐殖質(zhì)還原棒桿菌(Corynebacterium humireducens)通過(guò)對(duì)污泥微生物燃料電池的陽(yáng)極液進(jìn)行分離純化得到的，于2008年4月14日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC No.2452。本發(fā)明所述腐殖質(zhì)還原棒桿菌在厭氧條件下的電子供體利用譜較廣，具有堿性條件下高效的腐殖質(zhì)還原能力及產(chǎn)電能力，可廣泛應(yīng)用于有機(jī)污染物的原位生物修復(fù)、微生物燃料電池發(fā)電技術(shù)或高濃度有機(jī)廢棄物的資源化處置。
文檔編號(hào)H01M8/16GK101892180SQ20101016921
公開(kāi)日2010年11月24日 申請(qǐng)日期2010年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月30日
發(fā)明者周順桂, 李芳柏, 武春媛, 王躍強(qiáng), 袁勇 申請(qǐng)人:廣東省生態(tài)環(huán)境與土壤研究所