一種用于鑒定麻雀性別的特定基因的引物及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于鑒定麻雀性別的特定基因的引物及其應(yīng)用，所述引物包括序列號為SEQ ID NO.1的KLNIPBL?i16F2和序列號為SEQ ID NO.2的KLNIPBL?i16R2。本發(fā)明利用該對引物對麻雀肉樣或成年麻雀血液中提取出的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，并對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果表明擴(kuò)增序列為NIPBL基因的目的片段，雌性和雄性麻雀電泳條帶差異明顯，根據(jù)條帶數(shù)的不同可以明確區(qū)分麻雀的性別。本發(fā)明方法技術(shù)實用性強(qiáng)，重復(fù)性好，可以準(zhǔn)確鑒別麻雀的性別。
【專利說明】
-種用于鑒定麻雀性別的特定基因的引物及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種用于鑒定麻雀性別的特定基因的引 物及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著性別鑒定研究的興起，鑒定方法日新月異。當(dāng)前，利用分子生物學(xué)的手段進(jìn)行 性別鑒定分析，已成為必要手段之一。傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)判斷方法雖然普遍，但判斷剛解出的麻雀 維鳥不管公母都一個顏色時則存在誤差并不不可靠。而通過分子手段來進(jìn)行性別鑒定，如 樣品是麻雀幼體或缺損，腐敗組織等，很難從傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)特征來判斷麻雀的雌雄。于是出現(xiàn) 了利用DNA序列進(jìn)行物種的鑒定的方法，它為物種性別鑒定，篩選有經(jīng)濟(jì)價值的品種提供了 方便，快捷，準(zhǔn)確的手段。
[0003] 麻雀屬于單態(tài)性鳥(monomo巧hie birds),即雌雄同型，無論是幼鳥還是成鳥都很 難從外觀形態(tài)或其他行為上區(qū)分雌雄性別。剛解出的麻雀維鳥不管公母都一個顏色一一和 成年雌鳥顏色一樣，頭和背部沒有酒紅色的毛。雄維臉頰和吼部的毛色是淡青灰色（冷色 系），嘴下到吼部的毛根可W看到隱隱發(fā)黑，有的時候看到的黑色區(qū)域并不明顯，可W通過 把鳥抓在手上，吹開喉部的羽毛，從毛根深黑轉(zhuǎn)到毛尖灰色，有的毛尖會有點白岔。雌鳥臉 頰和吼部的毛色是淡黃褐色（暖色系），嘴下到吼部的毛色也是運樣，同一色系連成一片或 其他常規(guī)方法來鑒定，但只能在出維之后進(jìn)行。近年來發(fā)展的分子生物學(xué)方法可W將麻雀 的性別鑒定時間提早到胚胎期，而且正確率能夠達(dá)到100%。
[0004] NIPBL(Nipped-B蛋白同源基因）基因在鳥類性別染色體Z和W上都有同源序列，在 新鳥下綱等鳥類中（麻雀屬于新鳥下綱雀形目雀科雀屬），參見Suh，A.，Kriegs，J.O.， Brosius,J.,&Schmitz,J.Retroposon insertions and the chronology of avian sex chromosome evolution.Mol Biol Evol[J] ,2011.28(11) :2993-2997.可知Z和W染色體基 因內(nèi)含子片段長度不同，而在雞雁小綱和古飄總目等幾種鳥類中序列長度相似。
[0005] 故為了準(zhǔn)確的鑒定出麻雀性別，使用便捷，準(zhǔn)確的分子手段勢在必行。但是利用分 子測序方法進(jìn)行鑒定麻雀性別，需要大量成本。因此為了節(jié)約成本，本發(fā)明提供了特異性引 物，即可直觀地，高效地判斷出待測樣本的雌雄。
[0006] 目前通過分子手段鑒定麻雀性別還沒有相關(guān)應(yīng)用，即現(xiàn)在沒有報道基于NIPM^基 因（Nipped-B蛋白同源基因）的特定引物進(jìn)行性別鑒定的專利，文獻(xiàn)報導(dǎo)關(guān)于麻雀并獲得成 功的例子也沒有。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 根據(jù)W上現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提出一種用于鑒定麻雀 性別的特定基因的引物及其應(yīng)用，目的是可W快速、可靠、準(zhǔn)確的鑒定麻雀的性別。
[000引為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0009] -種用于鑒定麻雀性別的特定基因的引物，所述引物包括序列號為SEQ ID NO.1 的KLNIP化-il6F2和序列號為沈Q ID N0.2的KLNIP化-il6R2。
[0010] -種采用權(quán)利要求1所述引物鑒定麻雀性別的方法，具體包括如下步驟：
[00川步驟一，提取待測樣品的總DNA;
[0012] 步驟二，采用所述引物對步驟一提取的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0013] 步驟S，取步驟二中得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測;并通過瓊脂糖 凝膠電泳圖中泳道出現(xiàn)的條帶數(shù)進(jìn)行判斷。步驟=中所述條帶數(shù)為兩條，且兩條條帶中所 含有的DNA片段的長度分別約為8(K)bp和6(K)bp。在得到的瓊脂糖凝膠電泳圖中，若得到的產(chǎn) 物的泳道出現(xiàn)兩條條帶，則判斷所述待測樣品是雌麻雀，若含有步驟二得到的產(chǎn)物泳道中 出現(xiàn)一條條帶，則判斷該待測樣品是雄麻雀。
[0014] 其中PCR擴(kuò)增采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生 物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制，PCR的最大特點，是能將微量的DNA大幅增 加。
[0015] 為了達(dá)到更好的PCR擴(kuò)增效果，使得得到的瓊脂糖凝膠電泳圖更清晰可見，便于更 好地確定實驗結(jié)果，步驟二所述PCR擴(kuò)增為兩次，具體方法包括先對提取的總DNA進(jìn)行第一 次PCR擴(kuò)增，再將第一次PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物為模板，W與第一次PCR擴(kuò)增相同體系、相同程序 進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增。
[0016] 步驟二中所述PCR擴(kuò)增是的PCR擴(kuò)增體系為基準(zhǔn)，每條引物的濃度分別為 2.化1，總DNA的用量為化1。
[0017] PCR擴(kuò)增過程中的退火過程可W為本領(lǐng)域所常規(guī)使用的退火方式及返火參數(shù)，較 好的是，退火溫度為51-55°C，退火時間為30s-lmin;在本發(fā)明中，為了得到更好的擴(kuò)增效 果，所述退火溫度為52 °C，所述退火時間為40s。
[0018] 具體的說，采用的多重PCR反應(yīng)體系:Dream-化q buffer 2.扣L，引物各2.化L，化L 的dNTPMix，0.125化的Dream-Taq酶和1化的總DNA，1化的DMS0，并用雙蒸水補(bǔ)齊至25化。
[0019] PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性2min;然后進(jìn)行35個循環(huán)，該循環(huán)包括:94°C變性30s， 52°C退火30s和72°C延伸40s;最后再作72°C延伸lOmin。在上述反應(yīng)條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0020] 本發(fā)明有益效果是:本發(fā)明通過基于NIPBL(Nipped-B蛋白同源基因）基因設(shè)計的 特異性引物，利用PCR擴(kuò)增的方法，對待測樣品通過兩次一般的PCR擴(kuò)增，再通過瓊脂糖凝膠 電泳圖中的條帶顯示判定出麻雀性別，且所用的模板可從動物的毛皮、肌肉組織、內(nèi)臟外殼 等組織中提取，大大降低了取樣的難度，而且該方法可簡便快捷地鑒定麻雀性別，從而達(dá)到 了簡便易行，經(jīng)濟(jì)實用準(zhǔn)確地鑒定麻雀性別目的。本發(fā)明首次利用新開發(fā)的^?^^基因作為 麻雀性別鑒定W及作為性別鑒定新的分子標(biāo)記。本發(fā)明方法技術(shù)實用性強(qiáng)，重復(fù)性好，可W 準(zhǔn)確的鑒定麻雀性別。
【附圖說明】
[0021] 下面對本說明書附圖所表達(dá)的內(nèi)容及圖中的標(biāo)記作簡要說明：
[0022] 圖1是本發(fā)明的實施例1-3和對比例1-3的擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。
[002引其中，泳道1和泳道2來自K0672肌肉樣品，泳道3和泳道4來自K0673的肌肉樣品，泳 道5和泳道6來自K0619的肌肉樣品，泳道7和泳道8來自K0663的肌肉樣品，泳道9和泳道10來 自K0617的肌肉樣品，泳道11和泳道12來自K0618的肌肉樣品，泳道M為分子量標(biāo)記。
【具體實施方式】
[0024] 下面對照附圖，通過對實施例的描述，對本發(fā)明的【具體實施方式】如所設(shè)及的工藝 及操作使用方法等，作進(jìn)一步詳細(xì)的說明，W幫助本領(lǐng)域技術(shù)人員對本發(fā)明的發(fā)明構(gòu)思、技 術(shù)方案有更完整、準(zhǔn)確和深入的理解。
[0025] 需要闡明的是，所述引物均由通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司合成且引物濃度為 加 mol，本發(fā)明中使用的dNTPMix為hkara公司的市售品，Dream-taq buffe;r，Dream-taq為 biotool公司的市售品，其余所使用的化學(xué)試劑均為常規(guī)市售分析純試劑。
[0026] 樣品的取材:3只雌性麻雀，3只雄性麻雀。
[0027] 實施例1
[00%] 1)總基因組的提取:采用酪、氯仿抽提法，取約50mg編號為K0672(見下表1)的肌肉 組織樣本，剪碎后置于一只已滅菌的2. OmL的EP管；
[0029] 2)在EP管中加入ImL的DNA提取液及4化20mg/mL的RNaseA(核糖核酸酶），搖勻后 置于37°C水浴鍋中水浴化；
[0030] 3)取出EP管，加入扣L20mg/mL的蛋白酶K，搖勻后置于50°C水浴鍋中水浴約2-化， 直至肌肉完全消化，期間每隔lOmin上下?lián)u勻；
[0031] 4)取出EP管，待冷卻至室溫后，加入等體積的飽和酪，溫和上下?lián)u勻約7分鐘直至 水相與酪相混合成乳狀液；
[0032] 5)10000rfm，10°C下離屯、15min,取出上層水相至另一 20mLEP管中；
[0033] 6)重復(fù)酪提取一二次；
[0034] 7)加入等體積的CI(氯仿異戊醇），溫和上下?lián)u勻約7min，10000巧m，10°C下離屯、 15min，取出上層水相至另一 2.0mLEP管中；
[0035] 8)再次加入等體積的CI和上下?lián)u勻約7min, 10000;rPm, 10°C下離屯、15min，取出上 層水相至另一 1.5mL EP管中（分裝到2管中，每管30化L)
[0036] 9)加入1 /5體積的3mo 1 /1化AC (醋酸鋼)及2倍體積預(yù)冷的無水乙醇，室溫輕搖EP 管置于-20°C冰柜中冷凍化；
[0037] 10)從冰柜中取出EP管，1200化化，4 °C離屯、15min，并棄上清；
[003引 11)加入500化75%乙醇漂洗，12000rfm，4°C離屯、15min，并棄上清；
[0039] 12)再加入500化75%乙醇漂洗，12000計111，4°(：離屯、15111111，并棄上清，后風(fēng)干沉 淀；
[0040] 13)加入 100 化 1*TE 溶解 DNA;
[0041] 14)取化LDNA溶液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳；
[0042] 15)總DNA置于-40 °C冰柜中儲存。
[0043] 向PCR儀的樣品管中加入化eam-taq buffer 2.扣L，引物（下表2所示)各2.化L，化 L的dNTPMix，0.125化的化earn-化q酶和化L的總DNA，1化的DMS0(二甲基亞諷），并用雙蒸水 補(bǔ)齊至25化。
[0044] PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性2min;然后進(jìn)行35個循環(huán)，該循環(huán)包括:94°C變性30s， 52°C退火40s和72°C延伸40s;最后再作72°C延伸lOmin。在上述反應(yīng)條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將 擴(kuò)增后的產(chǎn)物作為模板在同樣程序，同樣體系進(jìn)行二次擴(kuò)增，再進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳 結(jié)果如圖1所示(泳道編號為1)。
[0045] 實施例2
[0046] 按照實施例1的方法進(jìn)行操作，不同的是，取待測樣品其編號為K0673(下表1所 示），電泳結(jié)果如圖1所示(泳道編號為3)。
[0047] 實施例3
[0048] 按照實施例1的方法進(jìn)行操作，不同的是，取待測樣品其編號為K0663(下表1所 示），電泳結(jié)果與實施例1相同（泳道編號為5)。
[0049] 對比例1
[0050] 將表1中編號為K0617按照實施例1的方法進(jìn)行擴(kuò)增及瓊脂凝膠電泳，電泳結(jié)果如 圖1所示(泳道編號為7)。
[0化1] 對比例2
[0052]按照對比例1的方法進(jìn)行操作，不同的是，待測樣品編號為K0618(下表1所示），電 泳結(jié)果如圖1所示(泳道編號為9)。
[0化3] 對比例3
[0054] 按照對比例1的方法進(jìn)行操作，不同的是，待測樣品編號為K0619(下表1所示），電 泳結(jié)果如圖1所示(泳道編號為11)。
[0055] 將所得到的PCR產(chǎn)物送至通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司進(jìn)行測序。
[0化6] 實施例1-3和對比例1-8的待測樣品信息如下表1 「0化71
[0060]通過表1的樣品信息和圖1所示的電泳圖可W看出，本發(fā)明通過基于NIPM^基因設(shè) 計的特異性引物，對待測樣品通過二次普通的PCR擴(kuò)增，再通過瓊脂糖凝膠電泳圖中的條帶 顯示判斷出麻雀的性別，且電泳結(jié)果與樣品信息完全符合，證實了該鑒定方法的可靠性，同 時，送至通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司進(jìn)行測序的DNA片段的序列與數(shù)據(jù)庫中己存在斑胸 草雀的化?^^^列進(jìn)行比對后，得到的比對結(jié)果表明同源性在97%^上，故而也進(jìn)一步證實 了麻雀的性別，而且在本實驗中，所用的模板可從動物的毛皮、肌肉組織、內(nèi)臟、外殼等組織 中提取，大大降低了取樣的難度，而且該方法可簡便快捷地，從而達(dá)到了簡便易行，經(jīng)濟(jì)實 用準(zhǔn)確地鑒定麻雀性別的目的。
[0061]上面結(jié)合附圖對本發(fā)明進(jìn)行了示例性描述，顯然本發(fā)明具體實現(xiàn)并不受上述方式 的限制，只要采用了本發(fā)明的方法構(gòu)思和技術(shù)方案進(jìn)行的各種非實質(zhì)性的改進(jìn)，或未經(jīng)改 進(jìn)將本發(fā)明的構(gòu)思和技術(shù)方案直接應(yīng)用于其它場合的，均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā) 明的保護(hù)范圍應(yīng)該W權(quán)利要求書所限定的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。
【主權(quán)項】
1. 一種用于鑒定麻雀性別的特定基因的引物，其特征在于，所述引物包括序列號為SEQ ID N0.1 的KLNIPBL-il6F2和序列號為SEQ ID N0.2的KLNIPBL-il6R2。2. 采用權(quán)利要求1所述引物在麻雀性別鑒定中的應(yīng)用。3. -種采用權(quán)利要求1或2所述引物鑒定麻雀性別的方法，具體包括如下步驟： 步驟一，提取待測樣品的總DNA; 步驟二，采用所述引物對步驟一提取的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增； 步驟三，取步驟二中得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測;并通過瓊脂糖凝膠 電泳圖中泳道出現(xiàn)的條帶數(shù)進(jìn)行判斷。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述鑒定麻雀性別的方法，其特征在于，步驟二所述PCR擴(kuò)增為兩次， 具體方法包括先對提取的總DNA進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增，再將第一次PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物為模板， 以與第一次PCR擴(kuò)增相同體系、相同程序進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述鑒定麻雀性別的方法，其特征在于，步驟三中所述條帶數(shù)為兩 條，且兩條條帶中所含有的DNA片段的長度分別約為800bp和600bp。6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述鑒定麻雀性別的方法，其特征在于，步驟二中所述PCR擴(kuò)增是以 25μ1的PCR擴(kuò)增體系為基準(zhǔn)，每條引物的濃度分別為2.2μ1，總DNA的用量為ΙμL。7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述鑒定麻雀性別的方法，其特征在于，步驟二中所述PCR擴(kuò)增的過 程中退火溫度為51-55°(：，退火時間為3〇8-11^11。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述鑒定麻雀性別的方法，其特征在于，所述退火溫度為52°C，所述 退火時間為40s。
【文檔編號】C12Q1/68GK106048044SQ201610547230
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年7月13日
【發(fā)明人】闞顯照, 王青青, 陸文康, 王萍, 蔣瀾, 王瑩, 章勤, 吳璇, 丁恒武
【申請人】安徽師范大學(xué)