本發(fā)明屬于小麥抗災(zāi)減災(zāi)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種鑒定或評(píng)價(jià)小麥抗寒性的方法。
背景技術(shù)：
低溫災(zāi)害是指農(nóng)作物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，當(dāng)溫度下降到適宜溫度下限后，生長(zhǎng)就會(huì)出現(xiàn)延遲、停止甚至死亡的現(xiàn)象。小麥低溫災(zāi)害可分為小麥冬季凍害和春季寒害，是小麥生長(zhǎng)過(guò)程中頻發(fā)的自然災(zāi)害，嚴(yán)重影響并制約著小麥的生長(zhǎng)發(fā)育及產(chǎn)量的形成。尤其春季發(fā)生的倒春寒，是對(duì)小麥生產(chǎn)危害最嚴(yán)重的春季低溫氣象災(zāi)害之一，如2013年的倒春寒，對(duì)河南小麥的生長(zhǎng)造成了嚴(yán)重危害，受災(zāi)小麥減產(chǎn)幅度達(dá)15％～60％。
低溫對(duì)小麥生理傷害主要是使植株產(chǎn)生大量活性氧自由基，導(dǎo)致膜脂過(guò)氧化從而造成膜系統(tǒng)受損，有毒物質(zhì)積累，最終導(dǎo)致細(xì)胞和組織受害甚至死亡。在低溫脅迫過(guò)程中小麥植株會(huì)相應(yīng)地通過(guò)如誘導(dǎo)新蛋白質(zhì)的合成、可溶性糖含量增加和抗氧化酶活性增強(qiáng)等應(yīng)激反應(yīng)來(lái)減輕或消除低溫傷害產(chǎn)生的不利影響，因此，小麥植株在低溫脅迫下的生理指標(biāo)測(cè)定值可作為小麥抗寒性鑒定的輔助指標(biāo)。隸屬函數(shù)法是根據(jù)模糊數(shù)學(xué)原理，在多指標(biāo)測(cè)定的基礎(chǔ)上對(duì)材料進(jìn)行抗寒性綜合評(píng)價(jià),能比較準(zhǔn)確地反映出品種間的抗寒性差異，在小麥(姜麗娜,張黛靜,宋飛,等.不同品種小麥葉片對(duì)拔節(jié)期低溫的生理響應(yīng)及抗寒性評(píng)價(jià)[J].生態(tài)學(xué)報(bào),2014,34(15):4251-4261.)、茶樹(shù)(李葉云,舒錫婷,周月琴,等.自然越冬過(guò)程中3個(gè)茶樹(shù)品種的生理特性變化及抗寒性評(píng)價(jià)[J].植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào),2014(3):52-58.)和甘蔗(張保青,楊麗濤,李楊瑞,等.自然條件下甘蔗品種抗寒生理生化特性的比較[J].作物學(xué)報(bào),2011,37(3):496-505)等植物中均有應(yīng)用，但是對(duì)于小麥在春季低溫敏感期利用隸屬函數(shù)法進(jìn)行抗寒性評(píng)價(jià)未見(jiàn)報(bào)道。
選育耐寒小麥品種是解決小麥?zhǔn)芎Φ闹饕侄沃唬x育耐寒品種的關(guān)鍵是對(duì)耐寒品種的準(zhǔn)確鑒定，目前在鑒定小麥抗寒性方面主要依賴(lài)受凍后的表型特征進(jìn)行抗寒分級(jí)，但是對(duì)于冬季降溫程度低或春季發(fā)生的倒春寒，由于其受寒害表型特征不明顯則不能對(duì)品種的抗寒性進(jìn)行準(zhǔn)確判斷。小麥遭遇低溫后，是否發(fā)生損傷，與自身發(fā)育進(jìn)程和體內(nèi)多項(xiàng)生理特性的狀況密切相關(guān)。因此，借助于這些性狀指標(biāo)的測(cè)定，可預(yù)判材料是否能夠抵御本地區(qū)可能發(fā)生的低溫寒害。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種鑒定或輔助鑒定N個(gè)待測(cè)小麥品種抗寒性的方法。
本發(fā)明提供的鑒定或輔助鑒定N個(gè)待測(cè)小麥品種抗寒性的方法包括如下步驟：
(1)分別對(duì)N個(gè)待測(cè)小麥品種進(jìn)行低溫處理，得到N個(gè)低溫處理后的待測(cè)小麥品種；所述N為大于等于2的整數(shù)；
(2)分別檢測(cè)每個(gè)低溫處理后的待測(cè)小麥品種和與其對(duì)應(yīng)的未經(jīng)低溫處理的待測(cè)小麥品種的如下生理生化指標(biāo)：可溶性糖含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量，分別得到N個(gè)低溫處理后的待測(cè)小麥品種的可溶性糖含量測(cè)定值、SOD活性測(cè)定值和MDA含量測(cè)定值和N個(gè)未經(jīng)低溫處理的待測(cè)小麥品種的可溶性糖含量測(cè)定值、SOD活性測(cè)定值和MDA含量測(cè)定值；
(3)對(duì)N個(gè)所述低溫處理后的待測(cè)小麥品種的可溶性糖含量測(cè)定值、SOD活性測(cè)定值和MDA含量測(cè)定值進(jìn)行隸屬函數(shù)分析，得到每個(gè)品種的可溶性糖含量的隸屬函數(shù)值、SOD活性的隸屬函數(shù)值和MDA含量的隸屬函數(shù)值，
每個(gè)待測(cè)小麥品種的可溶性糖含量的隸屬函數(shù)值的計(jì)算方法為將所述待測(cè)小麥品種的可溶性糖含量測(cè)定值代入公式(Ⅰ)；
每個(gè)待測(cè)小麥品種的SOD活性的隸屬函數(shù)值的計(jì)算方法為將所述待測(cè)小麥品種的SOD活性測(cè)定值代入公式(Ⅰ)；
每個(gè)待測(cè)小麥品種的MDA含量的隸屬函數(shù)值的計(jì)算方法為將所述待測(cè)小麥品種的MDA含量測(cè)定值代入公式(Ⅱ)；
所述公式(Ⅰ)如下：u(Xij)＝(Xij－Xmin)/(Xmax－Xmin)；
所述公式(Ⅱ)如下：u(Xij)＝1－(Xij－Xmin)/(Xmax－Xmin)；
所述公式(Ⅰ)和所述公式(Ⅱ)中，i為N個(gè)待測(cè)小麥品種中的任意一個(gè)待測(cè)小麥品種，j為可溶性糖含量、SOD活性和MDA含量中的任意一個(gè)生理生化指標(biāo)；Xij為待測(cè)小麥品種i的生理生化指標(biāo)j的相對(duì)值，Xmax為N個(gè)低溫處理后的待測(cè)小麥品種的生理生化指標(biāo)j的相對(duì)值中的最大值；Xmin為N個(gè)低溫處理后的待測(cè)小麥品種的生理生化指標(biāo)j的相對(duì)值中的最小值；
所述相對(duì)值(Xij)的計(jì)算公式如下：
相對(duì)值(Xij)＝(待測(cè)小麥品種i在低溫處理后的生理生化指標(biāo)j測(cè)定值/未經(jīng)低溫處理的待測(cè)小麥品種i的生理生化指標(biāo)j測(cè)定值)×100％；
(4)根據(jù)每個(gè)所述待測(cè)小麥品種的可溶性糖含量的隸屬函數(shù)值、SOD活性的隸屬函數(shù)值和MDA含量的隸屬函數(shù)值，計(jì)算每個(gè)待測(cè)小麥品種的抗寒性綜合評(píng)價(jià)值D，所述待測(cè)小麥品種i的抗寒性綜合評(píng)價(jià)值(Di)的計(jì)算公式如下：
抗寒性綜合評(píng)價(jià)值Di＝(待測(cè)小麥品種i的可溶性糖含量的隸屬函數(shù)值+待測(cè)小麥品種i的SOD活性的隸屬函數(shù)值+待測(cè)小麥品種i的MDA含量的隸屬函數(shù)值)/3。
(5)根據(jù)每個(gè)所述待測(cè)小麥品種的抗寒性綜合評(píng)價(jià)值D判斷每個(gè)待測(cè)小麥品種為抗寒性強(qiáng)的品種、抗寒性中等的品種還是抗寒性差的品種：
若待測(cè)小麥品種的抗寒性綜合評(píng)價(jià)值D為0.65<D≤1.00，則待測(cè)小麥品種為或候選為抗寒性強(qiáng)的品種；
若待測(cè)小麥品種的抗寒性綜合評(píng)價(jià)值D為0.40<D≤0.65，則待測(cè)小麥品種為或候選為抗寒性中等的品種；
若待測(cè)小麥品種的抗寒性綜合評(píng)價(jià)值D為0.00<D≤0.40，則待測(cè)小麥品種為或候選為抗寒性差的品種。
上述方法中，所述對(duì)N個(gè)待測(cè)小麥品種進(jìn)行低溫處理為對(duì)N個(gè)處于藥隔期的待測(cè)小麥品種進(jìn)行低溫處理。所述藥隔期是指小麥幼穗分化發(fā)育過(guò)程中，雌蕊原基逐漸生長(zhǎng)增大并逐漸形成花藥原始體，由于此期花藥不同部位的細(xì)胞分裂速度不同，由圓形發(fā)展成長(zhǎng)方體，而且4個(gè)角的細(xì)胞分裂快，使初期的花藥自下而上形成一個(gè)微形縱溝，此時(shí)花藥內(nèi)部開(kāi)始分化形成藥隔，當(dāng)形態(tài)上能觀(guān)察到微型縱溝時(shí)，將此時(shí)定義為藥隔期。
上述方法中，所述低溫處理的溫度為-5℃-0℃；所述低溫處理的溫度具體為-3℃-0℃。
本發(fā)明的方法在實(shí)際應(yīng)用中，對(duì)小麥品種進(jìn)行低溫處理是需要在溫度恒定的環(huán)境下進(jìn)行低溫處理。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中是將待測(cè)小麥品種置于人工氣候室中進(jìn)行低溫處理。所述人工氣候室溫度設(shè)置為白天0℃(8:00-20:00)，夜間-3℃，溫度變幅為±0.5℃，白天采用人工光源補(bǔ)光，光照強(qiáng)度為600μmol·m-2·s-1。
上述方法中，所述低溫處理的時(shí)間為6h-18h；所述低溫處理的時(shí)間具體為12h。
上述方法中，所述抗寒性強(qiáng)的小麥品種為經(jīng)過(guò)低溫處理后減產(chǎn)幅度小于25％的小麥品種；所述抗寒性中等的小麥品種為經(jīng)過(guò)低溫處理后減產(chǎn)幅度為(25-40)％的小麥品種；所述抗寒性差的小麥品種為經(jīng)過(guò)低溫處理后減產(chǎn)幅度大于40％的小麥品種。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述方法的新用途。
本發(fā)明提供了上述方法在培育抗寒性強(qiáng)的小麥中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了上述方法在比較不同小麥品種的抗寒性中的應(yīng)用。
本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種抗寒性強(qiáng)的小麥的培育方法。
本發(fā)明提供的抗寒性強(qiáng)的小麥的培育方法是選取上述抗寒性綜合評(píng)價(jià)值D為0.65<D≤1.00的小麥品種進(jìn)行培育。
本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種鑒定或輔助鑒定待測(cè)小麥品種抗寒性的試劑盒。
本發(fā)明提供的鑒定或輔助鑒定待測(cè)小麥品種抗寒性的試劑盒包括檢測(cè)待測(cè)小麥品種的可溶性糖含量、SOD活性和MDA含量的物質(zhì)。
上述試劑盒中，所述檢測(cè)待測(cè)小麥品種的可溶性糖含量、SOD活性和MDA含量的物質(zhì)為檢測(cè)待測(cè)小麥品種的可溶性糖含量、SOD活性和MDA含量時(shí)所需的試劑和/或儀器。
上述試劑盒中，所述試劑盒還包括如下判斷標(biāo)準(zhǔn)的可讀載體1)或2)：
1)若待測(cè)小麥品種的抗寒性綜合評(píng)價(jià)值D為0.65<D≤1.00，則待測(cè)小麥品種為或候選為抗寒性強(qiáng)的品種；
若待測(cè)小麥品種的抗寒性綜合評(píng)價(jià)值D為0.40<D≤0.65，則待測(cè)小麥品種為或候選為抗寒性中等的品種；
若待測(cè)小麥品種的抗寒性綜合評(píng)價(jià)值D為0.00<D≤0.40，則待測(cè)小麥品種為或候選為抗寒性差的品種；
2)待測(cè)小麥品種的抗寒性綜合評(píng)價(jià)值D越高，待測(cè)小麥的抗寒性越強(qiáng)。
所述抗寒性綜合評(píng)價(jià)值D為根據(jù)所述待測(cè)小麥品種的可溶性糖含量、SOD活性和MDA含量按照權(quán)利要求1中(3)和(4)所述的方法計(jì)算得到的數(shù)值。所述抗寒性綜合評(píng)價(jià)值D在0.00-1.00之間。
本發(fā)明的最后一個(gè)目的是提供上述試劑盒或上述試劑盒中的可讀載體1)或2)的新用途。
本發(fā)明提供了上述試劑盒或上述試劑盒中的可讀載體1)或2)在鑒定或評(píng)價(jià)小麥抗寒性中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了上述試劑盒或上述試劑盒中的可讀載體1)或2)在制備鑒定或評(píng)價(jià)小麥抗寒性的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了上述試劑盒或上述試劑盒中的可讀載體1)或2)在培育抗寒性高的小麥中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了上述試劑盒或上述試劑盒中的可讀載體1)或2)在制備培育抗寒性高的小麥的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了上述試劑盒或上述試劑盒中的可讀載體1)或2)在比較不同小麥品種抗寒性中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了上述試劑盒或上述試劑盒中的可讀載體1)或2)在制備比較不同小麥品種抗寒性的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
本發(fā)明通過(guò)對(duì)低溫處理后的不同小麥品種二棱期、小花分化期、雌雄蕊分化期、藥隔期和四分體時(shí)期的穗發(fā)育觀(guān)察和生理指標(biāo)測(cè)定，發(fā)現(xiàn)藥隔期可作為抗寒性鑒定的生育期指標(biāo)，并通過(guò)對(duì)春季人工低溫脅迫下小麥抗寒性的調(diào)查，結(jié)合多項(xiàng)生理指標(biāo)變化與抗寒性的關(guān)系，采用隸屬函數(shù)法得到小麥抗寒性綜合評(píng)價(jià)值，建立了多指標(biāo)的綜合抗寒評(píng)價(jià)函數(shù)，提出了一種小麥抗寒性鑒定與評(píng)價(jià)的方法。與現(xiàn)有技術(shù)的用單一指標(biāo)或極少指標(biāo)評(píng)價(jià)小麥抗寒性的方法相比，本發(fā)明的方法更加準(zhǔn)確客觀(guān)，適用于不同小麥品種和種質(zhì)資源材料抗寒性的鑒定與評(píng)價(jià)，為小麥品種和種質(zhì)資源材料的抗寒性鑒定和抗寒性品種選育提供了技術(shù)依據(jù)。
附圖說(shuō)明
圖1為小麥抗寒性鑒定與評(píng)價(jià)的方法的流程圖。
具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
下述實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。
下述實(shí)施例中的二棱期、小花分化期、雌雄蕊分化期和四分體時(shí)期定義均在文獻(xiàn)“崔金梅,郭天財(cái).小麥的穗[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2000:18-54.”中公開(kāi)過(guò)。
下述實(shí)施例中的藥隔期是指小麥幼穗分化發(fā)育過(guò)程中，在雌蕊原基逐漸生長(zhǎng)增大并形成花藥原始體，由于此期花藥不同部位的細(xì)胞分裂速度不同，由圓形發(fā)展成長(zhǎng)方體，而且4個(gè)角的細(xì)胞分裂快，使初期的花藥自下而上形成一個(gè)微形縱溝，此時(shí)花藥內(nèi)部開(kāi)始分化形成藥隔，當(dāng)形態(tài)上能觀(guān)察到微型縱溝時(shí)，將此時(shí)定義為藥隔期。
下述實(shí)施例中的小麥品種由如下單位提供：
周麥18和周麥22由河南省周口農(nóng)科院提供；
矮抗58由河南科技學(xué)院提供；
鄭麥7698為河南省農(nóng)科院提供；
石麥19和石麥22由河北農(nóng)科院提供；
良星99、濟(jì)麥22和山農(nóng)20由山東農(nóng)科院提供；
安農(nóng)0711由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)提供；
淮麥33由江蘇徐淮地區(qū)淮陰農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所提供；
以上品種均通過(guò)國(guó)家審定或省審定，可于種子經(jīng)營(yíng)單位購(gòu)買(mǎi)。
下述實(shí)施例中的小麥品種的審定編號(hào)如下:
周麥18于2005年通過(guò)國(guó)家審定(國(guó)審麥2005006)；
良星99于2006年通過(guò)國(guó)家審定(國(guó)審麥2006016)；
濟(jì)麥22于2006年通過(guò)國(guó)家審定(國(guó)審麥2006018)；
矮抗58于2005年通過(guò)國(guó)家審定(國(guó)審麥2005008)；
鄭麥7698于2012年通過(guò)國(guó)家審定(國(guó)審麥2012009)；
周麥22于2007年通過(guò)國(guó)家審定(國(guó)審麥2007007)；
山農(nóng)20于2010年通過(guò)國(guó)家審定(國(guó)審麥2010006)；
石麥19于2009年通過(guò)國(guó)家審定(國(guó)審麥2009018)；
石麥22于2011年通過(guò)國(guó)家審定(國(guó)審麥2011014)；
安農(nóng)0711于2014年通過(guò)安徽省審定(皖麥2014002)；
淮麥33于2014年通過(guò)國(guó)家審定(國(guó)審麥2014001)。
實(shí)施例1、一種鑒定小麥抗寒性的方法及其有效性驗(yàn)證
一、一種鑒定小麥抗寒性的方法
本實(shí)施例對(duì)如下11個(gè)黃淮麥區(qū)主推品種：周麥18、良星99、濟(jì)麥22、矮抗58、鄭麥7698、周麥22、山農(nóng)20、石麥19、石麥22、安農(nóng)0711和淮麥33的抗寒性進(jìn)行鑒定。具體步驟如下：
1、盆栽試驗(yàn)
對(duì)如下11個(gè)黃淮麥區(qū)主推品種：周麥18、良星99、濟(jì)麥22、矮抗58、鄭麥7698、周麥22、山農(nóng)20、石麥19、石麥22、安農(nóng)0711、淮麥33進(jìn)行盆栽試驗(yàn)。盆栽試驗(yàn)種植方法為：盆直徑30cm，高35cm，裝肥沃表土并施足基肥，埋于試驗(yàn)田中，盆內(nèi)土壤與盆外大田齊平。每個(gè)品種種植30盆，每盆點(diǎn)播20穴，每穴1粒，定苗10株，管理參照大田生產(chǎn)。
2、低溫處理
對(duì)盆栽小麥植株進(jìn)行穗分化觀(guān)察，待小麥發(fā)育至二棱期、小花分化期、雌雄蕊分化期、藥隔期和四分體時(shí)期時(shí)分別取2盆試驗(yàn)材料移至人工氣候室進(jìn)行低溫處理。氣候室溫度設(shè)置為白天0℃(8:00-20:00)，夜間-3℃，溫度變幅為±0.5℃，白天采用人工光源補(bǔ)光，光照強(qiáng)度為600μmol·m-2·s-1。低溫處理設(shè)置6h、12h和18h三個(gè)水平，低溫處理6h時(shí)，處理溫度為0℃；低溫處理12h時(shí)，處理溫度為0℃；低溫處理18h時(shí)，處理溫度為-3℃-0℃。低溫處理結(jié)束后，將盆栽小麥埋于田間直至成熟收獲。
3、幼穗凍害級(jí)別的調(diào)查
在小麥處于二棱期、小花分化期、雌雄蕊分化期、藥隔期和四分體時(shí)期時(shí)，對(duì)經(jīng)過(guò)不同時(shí)間(6h、12h和18h)低溫處理后的11個(gè)小麥品種通過(guò)觀(guān)察穗發(fā)育情況進(jìn)行幼穗凍害等級(jí)調(diào)查。各小麥品種各選取生長(zhǎng)整齊且均勻一致的植株3株，其主莖用解剖針剝開(kāi)，在體視顯微鏡下觀(guān)察小麥幼穗發(fā)育進(jìn)程和記錄幼穗受凍害情況。具體調(diào)查方法參照文獻(xiàn)“崔金梅,郭天財(cái).小麥的穗[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2000:18-54.”和“劉平湘,郭天財(cái),韓巧霞,等.不同類(lèi)型冬小麥品種抗晚霜凍能力的鑒定[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2010,26(19):94-98.”中的方法。
結(jié)果如表1所示。從表1中可以看出：隨著幼穗發(fā)育進(jìn)程向前推移和低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，各品種幼穗凍害級(jí)別逐步增大，幼穗凍害級(jí)別以二棱期最低，藥隔期最高。其中周麥18、周麥22、山東20和淮麥33在不同穗發(fā)育時(shí)期經(jīng)三個(gè)不同低溫水平處理后，幼穗凍害級(jí)別較高，而矮抗58、石麥19、良星99和鄭麥7698幼穗凍害級(jí)別則較低。
對(duì)藥隔期和其它時(shí)期低溫處理后幼穗凍害級(jí)別間的相關(guān)性進(jìn)行分析，分析結(jié)果如表2所示。從表2中可以看出：藥隔期低溫處理6h、12h和18h后與小花分化期、雌雄蕊分化期的低溫處理6h、12h和18h后及四分體時(shí)期低溫處理12h后的各幼穗凍害級(jí)別相關(guān)性達(dá)到極顯著差異，與四分體時(shí)期低溫處理6h和18h后幼穗凍害級(jí)別相關(guān)性達(dá)到顯著差異，因此藥隔期的凍害級(jí)別與其它時(shí)期低溫處理后幼穗凍害級(jí)別的關(guān)系證明藥隔期可作為品種抗寒性鑒定的代表時(shí)期。
表1不同時(shí)期低溫處理水平下幼穗凍害級(jí)別
注；I-V分別代表二棱期、小花分化期、雌雄蕊分化期、藥隔期和四分體時(shí)期。
表2藥隔期和其它時(shí)期低溫處理后幼穗凍害級(jí)別間的相關(guān)性分析
注；I、II、III和V分別代表二棱期、小花分化期、雌雄蕊分化期和四分體時(shí)期。
4、生理生化指標(biāo)測(cè)定
低溫處理結(jié)束后，分別取小麥主莖上部3片展開(kāi)葉分別測(cè)定11個(gè)小麥品種在不同時(shí)間(6h、12h和18h)的低溫脅迫條件下的5項(xiàng)與抗寒性相關(guān)的生理生化指標(biāo)(試驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)，檢測(cè)各品種的某一生理生化指標(biāo)一次重復(fù)所用的葉片重量不得低于0.5g)，并分析不同時(shí)期低溫處理下各小麥品種生理生化指標(biāo)變化平均幅度，同時(shí)以未低溫脅迫處理植株葉片為對(duì)照。5項(xiàng)與抗寒性相關(guān)的生理生化指標(biāo)為可溶性蛋白含量、可溶性糖含量、SOD活性(超氧化物歧化酶活性)、CAT活性(過(guò)氧化氫酶活性)和MDA(丙二醛)含量。其中，可溶性蛋白含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法；可溶性糖含量測(cè)定采用蒽酮比色法；SOD活性測(cè)定采用氮藍(lán)四唑(NBT)光化還原法；CAT活性測(cè)定采用紫外吸收法；MDA含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸(TBA)反應(yīng)法。可溶性蛋白含量、可溶性糖含量和MDA含量的檢測(cè)方法參照文獻(xiàn)“周祖富,黎兆安.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2005:86-116.”中的方法；SOD活性的檢測(cè)方法參照文獻(xiàn)“李合生.植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)[M].北京：高等教育出版社,2000,167-169.”中的方法；CAT活性的檢測(cè)方法參照文獻(xiàn)“鄒琦.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2000.”中的方法。
5項(xiàng)與抗寒性相關(guān)的生理生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果如表3(表中數(shù)值為11個(gè)品種在不同低溫處理?xiàng)l件下的各個(gè)指標(biāo)的平均值)所示。從表3中可以看出，在二棱期各品種的可溶性糖含量、CAT活性、SOD活性除18h低溫處理后的可溶性糖含量降低，其余各時(shí)間段這4個(gè)生理指標(biāo)有不同程度增加。MDA含量在不同時(shí)間處理下，和對(duì)照相比，有不同程度下降，且與可溶性蛋白和可溶性糖增加幅度一致，在低溫處理12后，MDA含量降幅最大。說(shuō)明在二棱期小麥積累大量滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，以使細(xì)胞滲透勢(shì)增強(qiáng)，同時(shí)有更強(qiáng)的抗氧化能力去清除低溫脅迫時(shí)積累的活性氧自由基，維持細(xì)胞質(zhì)膜的穩(wěn)定性和完整性，二棱期不屬于低溫敏感期。
各小麥品種生理指標(biāo)變化平均幅度如表4所示。從表4中可以看出：在對(duì)后四個(gè)時(shí)期的生理指標(biāo)變化研究中發(fā)現(xiàn)，低溫處理后，小花分化期各品種的可溶性蛋白含量、可溶性糖、CAT活性的平均升幅、MDA含量的平均降幅與其余三個(gè)時(shí)期相比達(dá)到最大，分別為46.80％、54.05％、35.07％、54.37％和34.75％；而各品種可溶性糖含量、CAT活性、SOD活性的平均降幅、MDA含量的平均升幅在藥隔期達(dá)到最大，分別為25.77％、32.33％、38.22％、45.20％和84.73％。說(shuō)明在藥隔期經(jīng)低溫脅迫后，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和保護(hù)酶的大量減少，MDA的大量積累將導(dǎo)致小麥植株抗寒能力減弱，藥隔期對(duì)急劇降溫發(fā)生的倒春寒更為敏感，結(jié)合步驟3中的幼穗凍害級(jí)別調(diào)查結(jié)果，藥隔期可作為小麥倒春寒研究的敏感時(shí)期。
在藥隔期在6h和12h低溫處理水平下可溶性糖含量的平均增幅均大于可溶性蛋白含量的增幅，18h可溶性糖含量的降幅也大于可溶性蛋白含量的降幅，說(shuō)明可溶性糖對(duì)于低溫的響應(yīng)更敏感?？寡趸割?lèi)SOD和CAT酶活性在6h處理階段均成增加狀態(tài)，且SOD活性平均增幅大于CAT活性的平均增幅，而在12h和18h小時(shí)處理后，SOD活性平均降幅大于CAT活性的平均降幅，說(shuō)明SOD較CAT在溫度驟降時(shí)，在抗寒機(jī)制中發(fā)揮作用更積極。在本研究中，MDA含量的變化與滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和抗氧化酶活性的變化成反比，且隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，其含量也在不斷增加，前人研究表明MDA積累會(huì)使超氧化物自由基或活性氧的產(chǎn)生增多，將嚴(yán)重?fù)p傷細(xì)胞膜系統(tǒng)，使膜的完整性遭到破壞，所以在一定條件下丙二醛含量的高低和細(xì)胞膜受損傷的程度的大小相關(guān)。綜上所述，可溶性糖含量、SOD活性和MDA含量可作為春季抗寒性生理指標(biāo)來(lái)預(yù)測(cè)小麥的抗寒性。
表3不同時(shí)期低溫處理下各小麥品種生理指標(biāo)平均值
注；I-V分別代表二棱期、小花分化期、雌雄蕊分化期、藥隔期和四分體時(shí)期。
表4不同時(shí)期低溫處理下各小麥品種生理指標(biāo)變化平均幅度
注；I-V分別代表二棱期、小花分化期、雌雄蕊分化期、藥隔期和四分體時(shí)期。
將藥隔期不同低溫處理水平后的小麥幼穗凍害級(jí)別和各生理指標(biāo)變幅做相關(guān)性分析，分析結(jié)果如表5所示。從表5中可以看出：與6h和18h低溫處理相比，幼穗凍害級(jí)別和12h低溫處理后的可溶性糖含量、SOD活性和MDA含量的變幅間相關(guān)性均達(dá)到極顯著水平。因此在實(shí)際工作中，可以在12h低溫處理后，根據(jù)可溶性糖含量、SOD活性和MDA含量生理指標(biāo)值來(lái)預(yù)測(cè)小麥的抗寒性。
表5低溫處理幼穗凍害級(jí)別和各生理指標(biāo)變幅間的相關(guān)性
5、抗寒性分析
(1)隸屬函數(shù)分析
將步驟4獲得的不同小麥品種在藥隔期經(jīng)12h低溫處理后的每個(gè)生理生化指標(biāo)(可溶性糖含量、SOD活性和MDA含量)的測(cè)定值進(jìn)行隸屬函數(shù)分析，得到每個(gè)品種對(duì)應(yīng)的每個(gè)生理生化指標(biāo)(可溶性糖含量、SOD活性和MDA含量)的隸屬函數(shù)值。
若計(jì)算小麥品種的可溶性糖含量和SOD活性的隸屬函數(shù)值，則將該小麥品種的可溶性糖含量測(cè)定值和SOD活性測(cè)量值代入公式(1)；
u(Xij)＝(Xij－Xmin)/(Xmax－Xmin) (1)；
若計(jì)算小麥品種的MDA含量的隸屬函數(shù)值，則將該小麥品種的MDA含量測(cè)量值代入公式(2)；
u(Xij)＝1－(Xij－Xmin)/(Xmax－Xmin) (2)；
公式(1)和公式(2)中，i為所有待測(cè)小麥品種中的任意一個(gè)待測(cè)小麥品種，j為可溶性糖含量、SOD活性和MDA含量中的任意一個(gè)生理生化指標(biāo)；Xij為小麥品種i的生理生化指標(biāo)j的相對(duì)值，Xmax為所有低溫處理后的待測(cè)小麥品種的生理生化指標(biāo)j的相對(duì)值中的最大值；Xmin為所有低溫處理后的待測(cè)小麥品種的生理生化指標(biāo)j的相對(duì)值中的最小值。
相對(duì)值(Xij)的計(jì)算公式如下所示：相對(duì)值(Xij)＝(待測(cè)小麥品種i在低溫處理后的生理生化指標(biāo)j測(cè)定值/未經(jīng)低溫處理的待測(cè)小麥品種i的生理生化指標(biāo)j測(cè)定值)×100％；
(2)抗寒性綜合評(píng)價(jià)值D分析
根據(jù)每個(gè)品種對(duì)應(yīng)的每個(gè)生理生化指標(biāo)(可溶性糖含量、SOD活性和MDA含量)的隸屬函數(shù)值，計(jì)算每個(gè)小麥品種的抗寒性綜合評(píng)價(jià)值D，
抗寒性綜合評(píng)價(jià)值Di＝(待測(cè)小麥品種i的可溶性糖含量的隸屬函數(shù)值+待測(cè)小麥品種i的SOD活性的隸屬函數(shù)值+待測(cè)小麥品種i的MDA含量的隸屬函數(shù)值)/3。
不同小麥品種的抗寒性綜合評(píng)價(jià)值D的檢測(cè)結(jié)果如表6所示。比較表6中藥隔期在12h低溫處理后測(cè)定的可溶性糖含量、SOD活性和MDA含量的生理指標(biāo)值獲得的不同小麥的抗寒性綜合評(píng)價(jià)值D，不同參試品種在低溫脅迫后的抗寒性綜合評(píng)價(jià)值均在0.10和0.92之間。根據(jù)綜合值對(duì)參試品種的抗寒性進(jìn)行鑒定，第一類(lèi)為抗寒性強(qiáng)的品種：矮抗58、石麥19、鄭麥7698和良星99(0.65<D≤1.00)；第二類(lèi)為抗寒性中等的品種：濟(jì)麥22、安農(nóng)0711和石麥22(0.40<D≤0.65)；第三類(lèi)為抗寒性差的品種：淮麥33、山農(nóng)20、周麥22和周麥18(0.00<D≤0.40)。
表6低溫脅迫下小麥各生理指標(biāo)隸屬函數(shù)值和綜合評(píng)價(jià)值
二、鑒定小麥抗寒性的方法的有效性驗(yàn)證
對(duì)藥隔期經(jīng)過(guò)不同時(shí)間(6h、12h和18h)的低溫處理后的各小麥品種的單株穗數(shù)、穗粒數(shù)、千粒重、單株產(chǎn)量和減產(chǎn)幅度進(jìn)行檢測(cè)。
檢測(cè)結(jié)果如表7所示。從表7中可以看出：各小麥品種的產(chǎn)量及產(chǎn)量三要素均有所降低，單株穗數(shù)在6h、12h和18h低溫處理后降幅最大的品種分別為石麥22和周麥18(12h和18h)，降幅分別為18.25％、31.17％和41.43％；穗粒數(shù)降幅最大的品種分別是山農(nóng)20、安農(nóng)0711和山農(nóng)20，降幅分別為16.51％、24.50％和32.09％；千粒重在各低溫處理后降幅最大的品種分別是周麥22(6h和12h)和淮麥33，降幅分別為17.93％、29.40％和40.28％；產(chǎn)量在6h、12h和18h處理后降幅最大的品種分別是周麥18、周麥22和淮麥33，分別為28.67％、48.89％和62.95％，降幅最小的品種分別是良星99、鄭麥7698和矮抗58，分別為7.22％、21.53％和26.01％。
由于本實(shí)驗(yàn)是在人工脅迫下完成的，品種只受到逆境之一—低溫的脅迫，因此低溫是影響品種產(chǎn)量下降的主要因素，且本發(fā)明鑒定的不同品種在低溫脅迫處理后產(chǎn)量的降幅與該品種抗寒綜合評(píng)價(jià)值基本符合，即抗寒綜合評(píng)價(jià)值高的品種在低溫處理后具有更小的產(chǎn)量降低幅度，即具有更高的抗寒性，證明通過(guò)本發(fā)明的抗寒綜合評(píng)價(jià)值去衡量小麥品種和種質(zhì)資源材料的抗寒性高低是可靠的。
通過(guò)表7中的結(jié)果也可以看出：抗寒性強(qiáng)的小麥品種為經(jīng)過(guò)低溫處理后減產(chǎn)幅度小于25％的小麥品種；抗寒性中等的小麥品種為經(jīng)過(guò)低溫處理后減產(chǎn)幅度為(25-40)％的小麥品種；抗寒性差的小麥品種為經(jīng)過(guò)低溫處理后減產(chǎn)幅度大于40％的小麥品種。
表7低溫處理下不同小麥品種產(chǎn)量及構(gòu)成
因此，在實(shí)際工作中，可按照如下方法鑒定或輔助鑒定N個(gè)待測(cè)小麥品種的抗寒性(圖1)：
(1)分別對(duì)處于藥隔期的N個(gè)待測(cè)小麥品種進(jìn)行低溫處理，處理時(shí)間為12h，得到N個(gè)低溫處理后的待測(cè)小麥品種；
(2)分別檢測(cè)每個(gè)低溫處理后的待測(cè)小麥品種和未經(jīng)低溫處理的待測(cè)小麥品種的如下生理生化指標(biāo)：可溶性糖含量、SOD活性和MDA含量，分別得到N個(gè)低溫處理后的待測(cè)小麥品種的可溶性糖含量測(cè)定值、SOD活性測(cè)定值和MDA含量測(cè)定值和N個(gè)未經(jīng)低溫處理的待測(cè)小麥品種的可溶性糖含量測(cè)定值、SOD活性測(cè)定值和MDA含量測(cè)定值；
(3)對(duì)N個(gè)低溫處理后的待測(cè)小麥品種的可溶性糖含量測(cè)定值、SOD活性測(cè)定值和MDA含量測(cè)定值進(jìn)行隸屬函數(shù)分析，得到每個(gè)品種的可溶性糖含量的隸屬函數(shù)值、SOD活性的隸屬函數(shù)值和MDA含量的隸屬函數(shù)值，
每個(gè)待測(cè)小麥品種的可溶性糖含量的隸屬函數(shù)值的計(jì)算方法為將待測(cè)小麥品種的可溶性糖含量測(cè)定值代入公式(1)；
每個(gè)待測(cè)小麥品種的SOD活性的隸屬函數(shù)值的計(jì)算方法為將待測(cè)小麥品種的SOD活性測(cè)定值代入公式(1)；
每個(gè)待測(cè)小麥品種的MDA含量的隸屬函數(shù)值的計(jì)算方法為將待測(cè)小麥品種的MDA含量測(cè)定值代入公式(2)；
公式(1)如下：u(Xij)＝(Xij－Xmin)/(Xmax－Xmin)；
公式(2)如下：u(Xij)＝1－(Xij－Xmin)/(Xmax－Xmin)；
公式(1)和公式(2)中，i為N個(gè)待測(cè)小麥品種中的任意一個(gè)待測(cè)小麥品種，j為可溶性糖含量、SOD活性和MDA含量中的任意一個(gè)生理生化指標(biāo)；Xij為待測(cè)小麥品種i的生理生化指標(biāo)j的相對(duì)值，Xmax為N個(gè)低溫處理后的待測(cè)小麥品種的生理生化指標(biāo)j的相對(duì)值中的最大值；Xmin為N個(gè)低溫處理后的待測(cè)小麥品種的生理生化指標(biāo)j的相對(duì)值中的最小值；
待測(cè)小麥品種i的生理生化指標(biāo)j的相對(duì)值(Xij)的計(jì)算公式如下所示：
待測(cè)小麥品種i的生理生化指標(biāo)j的相對(duì)值(Xij)＝(待測(cè)小麥品種i在低溫處理后的生理生化指標(biāo)j測(cè)定值/未經(jīng)低溫處理的待測(cè)小麥品種i的生理生化指標(biāo)j測(cè)定值)×100％；
(4)根據(jù)每個(gè)待測(cè)小麥品種的可溶性糖含量的隸屬函數(shù)值、SOD活性的隸屬函數(shù)值和MDA含量的隸屬函數(shù)值，計(jì)算每個(gè)待測(cè)小麥品種的抗寒性綜合評(píng)價(jià)值D，待測(cè)小麥品種i的抗寒性綜合評(píng)價(jià)值(Di)的計(jì)算公式如下：
抗寒性綜合評(píng)價(jià)值Di＝(待測(cè)小麥品種i的可溶性糖含量的隸屬函數(shù)值+待測(cè)小麥品種i的SOD活性的隸屬函數(shù)值+待測(cè)小麥品種i的MDA含量的隸屬函數(shù)值)/3。
(5)根據(jù)每個(gè)待測(cè)小麥品種的抗寒性綜合評(píng)價(jià)值D判斷每個(gè)待測(cè)小麥品種為抗寒性強(qiáng)的品種、抗寒性中等的品種還是抗寒性差的品種：
若待測(cè)小麥品種的抗寒性綜合評(píng)價(jià)值D為0.65<D≤1.00，則待測(cè)小麥品種為抗寒性強(qiáng)的品種；
若待測(cè)小麥品種的抗寒性綜合評(píng)價(jià)值D為0.40<D≤0.65，則待測(cè)小麥品種為抗寒性中等的品種；
若待測(cè)小麥品種的抗寒性綜合評(píng)價(jià)值D為0.00<D≤0.40，則待測(cè)小麥品種為抗寒性差的品種；
抗寒性強(qiáng)的小麥品種為經(jīng)過(guò)低溫處理后減產(chǎn)幅度小于25％的小麥品種；
抗寒性中等的小麥品種為經(jīng)過(guò)低溫處理后減產(chǎn)幅度為(25-40)％的小麥品種；
抗寒性差的小麥品種為經(jīng)過(guò)低溫處理后減產(chǎn)幅度大于40％的小麥品種。