本發(fā)明屬于中藥學(xué)研究領(lǐng)域，具體地說涉及中藥組方中代表成分的PK-PD結(jié)合模型的建立方法；尤其涉及一種治療腦缺血再灌注損傷的中藥組方代表成分的PK-PD結(jié)合模型的建立方法，可用于建立中藥組方中代表成分的PK-PD結(jié)合模型。

背景技術(shù)：

藥代動力學(xué)-藥效動力學(xué)(Pharmacokinetic-pharmacodynamic,PK-PD)結(jié)合模型是研究藥物的體內(nèi)過程、藥物對機體的作用及二者之間關(guān)系的重要工具，將PK-PD結(jié)合模型應(yīng)用于中藥研究，可為闡明中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機理提供科學(xué)依據(jù)。

近年來，許多學(xué)者在中藥的PK-PD結(jié)合模型的構(gòu)建做了很多探索性工作，然而中藥復(fù)雜體系的“多成分、多環(huán)節(jié)、多途徑、多靶點”作用特點，決定了開展中藥的PK-PD結(jié)合模型的研究具有較大困難，并且存在如下問題：(1)忽略了疾病狀態(tài)下的中藥藥代動力學(xué)研究，對疾病狀態(tài)下的中藥PK-PD結(jié)合模型研究的意義認識不足；(2)目前中藥PK-PD結(jié)合模型研究主要停留在單一活性成分和單一藥效指標(biāo)上，忽略了中藥的“多成分和多靶點”的作用特點，關(guān)于多成分、多靶點的PK-PD結(jié)合模型研究較少。

眾所周知，建立PK-PD模型的關(guān)鍵是藥效指標(biāo)能夠量化，而且通常具有明顯量效關(guān)系的中藥才能建立良好的PK-PD模型。然而，由于多數(shù)中藥發(fā)揮作用都是通過“多成分、多途徑、多靶點”產(chǎn)生的，那么中藥組方就更加復(fù)雜。因而如何選擇可量化的指標(biāo)，進而使之能夠與中藥組方有效成分之間具有顯著的量效關(guān)系成為制約代表成分PK-PD模型建立的瓶頸。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是針對背景技術(shù)中現(xiàn)有的中藥PK-PD結(jié)合模型建立存在的不足，提供一種中藥組方中四種代表成分的PK-PD結(jié)合模型的建立方法。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案為：一種中藥組方中四種代表成分的PK-PD結(jié)合模型的建立方法，包括以下步驟：

(1)中藥組方中四種代表成分在疾病模型動物體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究

取疾病模型大鼠，口服給予中藥組方干預(yù)，每天2次，連續(xù)3天；第4天于首次給藥前以及給藥后5min、15min、30min、1h、1.5h、2h、3h、4h、6h、8h、10h、12h、24h、36h通過插管采血0.2mL于肝素化的EP管中，離心，取血漿100μL；采用液質(zhì)聯(lián)用的方法測定不同時間點所得血漿中的中藥組方中四種代表成分的濃度，采用藥代動力學(xué)軟件，計算相關(guān)的藥代動力學(xué)參數(shù)；

(2)中藥組方干預(yù)后藥效動力學(xué)的研究

取步驟(1)相同的血漿樣本，用試劑盒測定不同時間點所得血漿中兩種藥效指標(biāo)的含量，繪制藥時曲線；

(3)中藥組方干預(yù)后四種代表成分在效應(yīng)室中的濃度和效應(yīng)關(guān)系的擬合

把步驟(1)中的中藥組方中四種代表成分的血藥濃度-時間數(shù)據(jù)導(dǎo)入到藥代動力學(xué)軟件采用Semi-compartmentalmodeling工具對血藥濃度-時間數(shù)據(jù)進行擬合，獲得四種代表成分在效應(yīng)室的濃度-時間數(shù)據(jù)，然后繪制四種代表成分的效應(yīng)室濃度和效應(yīng)曲線；

(4)中藥組方中四種代表成分的PK-PD結(jié)合模型的建立

固定步驟(1)中的代表成分相關(guān)的藥代動力學(xué)參數(shù)，對步驟(2)中時效關(guān)系進行擬合，得到相關(guān)的PD參數(shù)，根據(jù)PD參數(shù)，建立PK-PD結(jié)合模型。

優(yōu)選地，所述步驟(1)所述疾病模型大鼠是指腦缺血再灌注損傷大鼠模型。

優(yōu)選地，所述步驟(1)所述中藥組方干預(yù)是成功建模12小時后灌胃給予辛芍凍干粉針，給藥劑量是12.5mg/kg。

優(yōu)選地，所述步驟(1)所述每天2次為早上1次和下午1次。

優(yōu)選地，所述步驟(1)所述四種代表成分是燈盞乙素、燈盞甲素、芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷。

優(yōu)選地，所述步驟(1)所述插管采血是指大鼠右頸靜脈插管。

優(yōu)選地，所述步驟(1)和步驟(3)所述藥代動力學(xué)軟件是指WinNonLin軟件。

優(yōu)選地，所述步驟(2)所述兩種藥效指標(biāo)是指SOD和LDH。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：以疾病模型為研究對象，以WinNonLin軟件中的Semi-compartmental modeling工具，對血藥濃度-時間數(shù)據(jù)進行擬合，獲得中藥組方中代表成分在效應(yīng)室的濃度-時間數(shù)據(jù)，進而可以使得中藥組方代表成分與藥效指標(biāo)之間呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系，最終建立中藥組方代表成分的PK-PD結(jié)合模型，以期揭示中藥組方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機制。

附圖說明

圖1是辛芍組方中代表成分燈盞乙素在腦缺血再灌注損傷模型大鼠體內(nèi)的血藥濃度-時間和效應(yīng)(以SOD為藥效指標(biāo))時間曲線圖(n＝5)

圖2是辛芍組方中代表成分燈盞乙素在腦缺血再灌注損傷模型大鼠體內(nèi)的血藥濃度-時間和效應(yīng)(以LDH為藥效指標(biāo))時間曲線圖(n＝5)

圖3是辛芍組方中代表成分燈盞甲素在腦缺血再灌注損傷模型大鼠體內(nèi)的血藥濃度-時間和效應(yīng)(以SOD為藥效指標(biāo))時間曲線圖(n＝5)

圖4是辛芍組方中代表成分燈盞甲素在腦缺血再灌注損傷模型大鼠體內(nèi)的血藥濃度-時間和效應(yīng)(以LDH為藥效指標(biāo))時間曲線圖(n＝5)

圖5是辛芍組方中代表成分芍藥苷在腦缺血再灌注損傷模型大鼠體內(nèi)的血藥濃度-時間和效應(yīng)(以SOD為藥效指標(biāo))時間曲線圖(n＝5)

圖6是辛芍組方中代表成分芍藥苷在腦缺血再灌注損傷模型大鼠體內(nèi)的血藥濃度-時間和效應(yīng)(以LDH為藥效指標(biāo))時間曲線圖(n＝5)

圖7是辛芍組方中代表成分芍藥內(nèi)酯苷在腦缺血再灌注損傷模型大鼠體內(nèi)的血藥濃度-時間和效應(yīng)(以SOD為藥效指標(biāo))時間曲線圖(n＝5)

圖8是辛芍組方中代表成分芍藥內(nèi)酯苷在腦缺血再灌注損傷模型大鼠體內(nèi)的血藥濃度-時間和效應(yīng)(以LDH為藥效指標(biāo))時間曲線圖(n＝5)

圖9是辛芍組方中代表成分燈盞乙素在腦缺血再灌注損傷模型大鼠體內(nèi)的效應(yīng)室濃度和效應(yīng)(以SOD為藥效指標(biāo))曲線圖(n＝5)

圖10是辛芍組方中代表成分燈盞乙素在腦缺血再灌注損傷模型大鼠體內(nèi)的效應(yīng)室濃度和效應(yīng)(以LDH為藥效指標(biāo))曲線圖(n＝5)

圖11是辛芍組方中代表成分燈盞甲素在腦缺血再灌注損傷模型大鼠體內(nèi)的效應(yīng)室濃度和效應(yīng)(以SOD為藥效指標(biāo))曲線圖(n＝5)

圖12是辛芍組方中代表成分燈盞甲素在腦缺血再灌注損傷模型大鼠體內(nèi)的效應(yīng)室濃度和效應(yīng)(以LDH為藥效指標(biāo))曲線圖(n＝5)

圖13是辛芍組方中代表成分芍藥苷在腦缺血再灌注損傷模型大鼠體內(nèi)的效應(yīng)室濃度和效應(yīng)(以SOD為藥效指標(biāo))曲線圖(n＝5)

圖14是辛芍組方中代表成分芍藥苷在腦缺血再灌注損傷模型大鼠體內(nèi)的效應(yīng)室濃度和效應(yīng)(以LDH為藥效指標(biāo))曲線圖(n＝5)

圖15是辛芍組方中代表成分芍藥內(nèi)酯苷在腦缺血再灌注損傷模型大鼠體內(nèi)的效應(yīng)室濃度和效應(yīng)(以SOD為藥效指標(biāo))曲線圖(n＝5)

圖16是辛芍組方中代表成分芍藥內(nèi)酯苷在腦缺血再灌注損傷模型大鼠體內(nèi)的效應(yīng)室濃度和效應(yīng)(以LDH為藥效指標(biāo))曲線圖(n＝5)

具體實施方式

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式作進一步說明。在此需要說明的是，對于這些實施方式的說明用于幫助理解本發(fā)明，但并不構(gòu)成對本發(fā)明的限定。此外，下面所描述的本發(fā)明各個實施方式中所涉及的技術(shù)特征只要彼此之間未構(gòu)成沖突就可以相互組合。

實施例1

(1)辛芍組方中四種代表成分燈盞乙素、燈盞甲素、芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷在腦缺血再灌注損傷模型大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究

取5只280～300g的雄性SD大鼠，禁食12h，按0.35g/kg的劑量腹腔注射10％水合氯醛麻醉。采用改良的Longa方法制備大鼠腦缺血再灌注損傷模型；待模型成功后，取腦缺血再灌注損傷模型大鼠，口服給予辛芍組方干預(yù)，每天2次，連續(xù)3天。第4天于首次給藥前以及給藥后5min、15min、30min、1h、1.5h、2h、3h、4h、6h、8h、10h、12h通過插管采血0.2mL于肝素化的EP管中，離心，取血漿100μL。采用液質(zhì)聯(lián)用的方法測定不同時間點所得血漿中辛芍組方中四種代表成分(燈盞乙素、燈盞甲素、芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷)的濃度，利用WinNonLin軟件，計算燈盞乙素、燈盞甲素、芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷的主要藥代動力參數(shù)(表1)。

表1 辛芍組方中四種代表成分的主要藥代動力學(xué)參數(shù)

液質(zhì)聯(lián)用法測定辛芍組方中四種代表成分(燈盞乙素、燈盞甲素、芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷)的含量方法：

1)儀器

Waters Acquity UPLC超高壓液相-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(AcquityTM UPLC-TQD系統(tǒng)，包括二元高壓梯度泵、真空脫氣機、自動進樣器、電噴霧電離源、柱溫箱等，MassLynx 4.1質(zhì)譜工作站)；MTN-2800D氮吹濃縮裝置(天津奧特塞恩斯儀器有限公司)；XYN-15LP氮吹儀氮氣發(fā)生器(上海析友分析儀器有限公司)；680酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad)；Water purifier實驗室專用超純水機(沃特爾水處理設(shè)備有限公司)；微量移液器(德國Eppendorf股份公司)。

2)供試品制備

①樣品處理：取血漿樣品100μl，加1％甲酸水50μl，0.5μg/ml葛根素15μl，渦混，再加甲醇380μl，渦混，超聲15min，12000rpm離心10min，轉(zhuǎn)移上清液至1.5ml EP管中，于氮吹儀上，30℃吹干。50％乙腈150μl復(fù)溶，渦混，超聲15min，15000rpm離心10min，取上清液進樣。

②標(biāo)曲處理：空白血漿100μl，加1％甲酸水50μl，0.5μg/ml葛根素內(nèi)標(biāo)15μl，渦混，加混標(biāo)溶液75μl，渦混，加甲醇305μl，渦混，超聲15min，12000rpm離心10min，轉(zhuǎn)移上清液至1.5ml EP管中，于氮吹儀上30℃吹干。50％乙腈150μl復(fù)溶，渦混，超聲15min，15000rpm離心10min，取上清液進樣。

色譜和質(zhì)譜條件：

色譜條件:Waters Acquity BEH C18色譜柱(2.1mm×50mm，1.7μm)；柱溫：45℃，0.1％甲酸乙腈-0.1％甲酸水梯度洗脫，梯度為0～1min:2～5％；1～3min：5～15％；3～4min:15～20％；4～5min:20～35％；5～6min:35～90％；7min:5％；流速為0.35mL·min-1；進樣體積為3μL。

質(zhì)譜條件:電噴霧電離源(ESI)；離子源溫度：150℃；毛細管電壓：2.9kV；去溶劑氣溫度：400℃；碰撞氣為Ar(0.16mL·min^-1)；去溶劑氣為N2(800L·h^-1)；掃描方式為多反應(yīng)離子監(jiān)測模式(MRM)。燈盞乙素：m/z 463、燈盞甲素：m/z 447、芍藥苷：m/z 525.2、芍藥內(nèi)酯苷：m/z 481.1、葛根素：m/z 417.0。

(2)辛芍組方干預(yù)后藥效動力學(xué)的研究

取步驟(1)相同的血漿樣本，用試劑盒測定不同時間所得血漿中兩種藥效指標(biāo)(SOD和LDH)的含量，結(jié)合步驟(1)的血藥濃度數(shù)據(jù)，分別繪制四種代表成分(燈盞乙素、燈盞甲素、芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷)的血藥濃度-時間和效應(yīng)(分別以SOD和LDH為藥效指標(biāo))時間曲線圖(圖1、圖2、圖3、圖4、圖5、圖6、圖7和圖8)。

(3)辛芍組方中四種代表成分(燈盞乙素、燈盞甲素、芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷)在效應(yīng)室濃度的擬合

分別把步驟(1)中的辛芍組方中四種代表成分(燈盞乙素、燈盞甲素、芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷)的血藥濃度-時間數(shù)據(jù)導(dǎo)入到WinNonLin軟件，然后采用Semi-compartmental modeling工具對血藥濃度-時間數(shù)據(jù)進行擬合，獲得燈盞乙素、燈盞甲素、芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷在效應(yīng)室的濃度-時間數(shù)據(jù)，然后繪制燈盞乙素、燈盞甲素、芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷的效應(yīng)室濃度和效應(yīng)(分別以SOD和LDH為藥效指標(biāo))曲線(圖9、圖10、圖11、圖12、圖13、圖14、圖15和圖16)。

(4)辛芍組方中代表成分燈盞乙素的PK-PD結(jié)合模型的建立

固定步驟(1)中的燈盞乙素的相關(guān)藥代動力學(xué)參數(shù)，采用WinNonLin軟件中的PK-PD model對步驟(2)中時間-效應(yīng)(分別以SOD和LDH為藥效指標(biāo))關(guān)系進行擬合，得到相關(guān)的PD參數(shù)，進而獲得辛芍組方中燈盞乙素的PK-PD結(jié)合模型的參數(shù)，其中燈盞乙素以SOD為藥效指標(biāo)的PK-PD參數(shù)結(jié)果見表2，以LDH為藥效指標(biāo)的PK-PD參數(shù)結(jié)果見表3。

表2 辛芍組方中代表成分燈盞乙素以SOD為藥效指標(biāo)的PK-PD參數(shù)

表3 辛芍組方中代表成分燈盞乙素以LDH為藥效指標(biāo)的PK-PD參數(shù)

根據(jù)辛芍組方中代表成分燈盞乙素的PK-PD參數(shù)，當(dāng)以SOD為藥效指標(biāo)時，可得辛芍組方中代表成分燈盞乙素的PK-PD模型為:

E＝21.08+(5.49*Ce)/(Ce+7368.24)

當(dāng)以LDH為藥效指標(biāo)時，可得辛芍組方中代表成分燈盞乙素的PK-PD模型為:

E＝211.98-(89.13*Ce)/(Ce+2013.2)

由以上PK-PD模型可以根據(jù)辛芍組方中代表成分燈盞乙素的濃度推算出相對應(yīng)的藥效值，也可以根據(jù)藥效值推算相對應(yīng)的濃度。

實施例2

按照實施例1的方法，區(qū)別在于辛芍組方中代表成分燈盞甲素的PK-PD結(jié)合模型的建立。

固定步驟(1)中的燈盞甲素的相關(guān)藥代動力學(xué)參數(shù)，采用WinNonLin軟件中的PK-PD model對步驟(2)中時間-效應(yīng)(分別以SOD和LDH為藥效指標(biāo))關(guān)系進行擬合，得到相關(guān)的PD參數(shù)，進而獲得辛芍組方中燈盞甲素的PK-PD結(jié)合模型的參數(shù)，其中燈盞甲素以SOD為藥效指標(biāo)的PK-PD參數(shù)結(jié)果見表4，以LDH為藥效指標(biāo)的PK-PD參數(shù)結(jié)果見表5。

表4 辛芍組方中代表成分燈盞甲素以SOD為藥效指標(biāo)的PK-PD參數(shù)

表5 辛芍組方中代表成分燈盞甲素以LDH為藥效指標(biāo)的PK-PD參數(shù)

根據(jù)辛芍組方中代表成分燈盞甲素的PK-PD參數(shù)，當(dāng)以SOD為藥效指標(biāo)時，可得辛芍組方中代表成分燈盞甲素的PK-PD模型為:

E＝20.67+(1.22*Ce)/(Ce+5.58)

當(dāng)以LDH為藥效指標(biāo)時，可得辛芍組方中代表成分燈盞甲素的PK-PD模型為:

E＝214.17-(32.72*Ce)/(Ce+0.08)

由以上PK-PD模型可以根據(jù)辛芍組方中代表成分燈盞甲素的濃度推算出相對應(yīng)的藥效值，也可以根據(jù)藥效值推算相對應(yīng)的濃度。

實施例3

按照實施例1的方法，區(qū)別在于辛芍組方中代表成分芍藥苷的PK-PD結(jié)合模型的建立。

固定步驟(1)中的辛芍組方代表成分芍藥苷的相關(guān)藥代動力學(xué)參數(shù)，采用WinNonLin軟件中的PK-PD model對步驟(2)中時間-效應(yīng)(分別以SOD和LDH為藥效指標(biāo))關(guān)系進行擬合，得到相關(guān)的PD參數(shù)，進而獲得辛芍組方中代表成分芍藥苷的PK-PD結(jié)合模型的參數(shù)，其中芍藥苷以SOD為藥效指標(biāo)的PK-PD參數(shù)結(jié)果見表6，以LDH為藥效指標(biāo)的PK-PD參數(shù)結(jié)果見表7。

表6 辛芍組方中代表成分芍藥苷以SOD為藥效指標(biāo)的PK-PD參數(shù)

表7 辛芍組方中代表成分芍藥苷以LDH為藥效指標(biāo)的PK-PD參數(shù)

根據(jù)辛芍組方中代表成分芍藥苷的PK-PD參數(shù)，當(dāng)以SOD為藥效指標(biāo)時，可得辛芍組方中代表成分芍藥苷的PK-PD模型為:

E＝20.02+(1.58*Ce)/(Ce+0.02)

當(dāng)以LDH為藥效指標(biāo)時，可得辛芍組方中代表成分芍藥苷的PK-PD模型為:

E＝216.83-(37.31*Ce)/(Ce+0.04)

由以上PK-PD模型可以根據(jù)辛芍組方中代表成分芍藥苷的濃度推算出相對應(yīng)的藥效值，也可以根據(jù)藥效值推算相對應(yīng)的濃度。

實施例4

按照實施例1的方法，區(qū)別在于辛芍組方中代表成分芍藥內(nèi)酯苷的PK-PD結(jié)合模型的建立。

固定步驟(1)中的辛芍組方代表成分芍藥內(nèi)酯苷的相關(guān)藥代動力學(xué)參數(shù)，采用WinNonLin軟件中的PK-PD model對步驟(2)中時間-效應(yīng)(分別以SOD和LDH為藥效指標(biāo))關(guān)系進行擬合，得到相關(guān)的PD參數(shù)，進而獲得辛芍組方中代表成分芍藥內(nèi)酯苷的PK-PD結(jié)合模型的參數(shù)，其中芍藥內(nèi)酯苷以SOD為藥效指標(biāo)的PK-PD參數(shù)結(jié)果見表8，以LDH為藥效指標(biāo)的PK-PD參數(shù)結(jié)果見表9。

表8 辛芍組方中代表成分芍藥內(nèi)酯苷以SOD為藥效指標(biāo)的PK-PD參數(shù)

表9 辛芍組方中代表成分芍藥內(nèi)酯苷以LDH為藥效指標(biāo)的PK-PD參數(shù)

根據(jù)辛芍組方中代表成分芍藥內(nèi)酯苷的PK-PD參數(shù)，當(dāng)以SOD為藥效指標(biāo)時，可得辛芍組方中代表成分芍藥內(nèi)酯苷的PK-PD模型為:

E＝21.04+(7.16*Ce)/(Ce+372.4)

當(dāng)以LDH為藥效指標(biāo)時，可得辛芍組方中代表成分芍藥內(nèi)酯苷的PK-PD模型為:

E＝216.83-(37.31*Ce)/(Ce+0.04)

由以上PK-PD模型可以根據(jù)辛芍組方中代表成分芍藥內(nèi)酯苷的濃度推算出相對應(yīng)的藥效值，也可以根據(jù)藥效值推算相對應(yīng)的濃度。

辛芍組方中四種代表成分(燈盞乙素、燈盞甲素、芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷)的PK-PD模型的結(jié)果表明，SOD和LDH的濃度與燈盞乙素、燈盞甲素、芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷的濃度存在一定的相關(guān)性。由此可推測辛芍組方及其主要活性成分燈盞乙素、燈盞甲素、芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷可通過提高SOD、降低LDH發(fā)揮抗氧化作用來實現(xiàn)保護腦缺血再灌注損傷。

以上結(jié)合附圖對本發(fā)明的實施方式作了詳細說明，但本發(fā)明不限于所描述的實施方式。對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，在不脫離本發(fā)明原理和精神的情況下，對這些實施方式進行多種變化、修改、替換和變型，仍落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。