本發(fā)明屬于高通量虛擬篩選領(lǐng)域，計算機輔助藥物設(shè)計范疇，特別涉及一種多精度計算機藥物篩選方法及其在篩選有生物活性的先導(dǎo)化合物上的應(yīng)用。技術(shù)背景新藥的研究有三個決定階段：先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)，新藥物的優(yōu)化研究，臨床與開發(fā)研究。計算機輔助藥物設(shè)計的主要任務(wù)就是先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)與優(yōu)化。合理藥物設(shè)計(rationaldrugdesign)是依據(jù)與藥物作用的靶點，即廣義上的受體，如酶、受體、離子通道、病毒、核酸、多糖等，尋找和設(shè)計合理的藥物分子。通過對藥物和受體的結(jié)構(gòu)在分子水平甚至電子水平的全面準(zhǔn)確了解進行基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計和通過對靶點的結(jié)構(gòu)、功能、與藥物作用方式及產(chǎn)生生理活性的機理的藥物設(shè)計。CADD通過內(nèi)源性物質(zhì)或外源性小分子作為效應(yīng)子作用于機體的靶點，考察其形狀互補，性質(zhì)互補(包括氫鍵、疏水性、靜電等)，溶劑效應(yīng)及運動協(xié)調(diào)性等進行分子設(shè)計。葡萄糖(D-glucose)是地球上包括從細菌到人類各種生物已知最重要、最基本的能量來源，也是人腦和神經(jīng)系統(tǒng)最主要的供能物質(zhì)；據(jù)估算，大腦平均每天消耗約120克葡萄糖，占人體葡萄糖總消耗量的一半以上。葡萄糖代謝的第一步就是進入細胞：親水的葡萄糖不能自由穿透疏水的細胞膜，其進出細胞需要通過鑲嵌于細胞膜上的葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白完成。其中一類屬于主要協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白超家族(MajorFacilitatorSuperfamily，簡稱MFS)的轉(zhuǎn)運蛋白是大腦、神經(jīng)系統(tǒng)、肌肉、紅細胞等組織器官中最重要的葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(glucosetransporters，簡稱GLUTs)。在人體的14個GLUTs中，GLUT1、2、3、4這四種蛋白生理功能最重要，研究最廣泛，其中GLUT1因發(fā)現(xiàn)最早而得名。GLUT1幾乎存在于人體每一個細胞中，是紅細胞和血腦屏障等上皮細胞的主要葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白，對于維持血糖濃度的穩(wěn)定和大腦供能起關(guān)鍵作用。在已知的人類遺傳疾病中，導(dǎo)致GLUT1功能異常的突變會影響葡萄糖的正常吸收，導(dǎo)致大腦萎縮、智力低下、發(fā)育遲緩、癲癇等一系列疾病(GLUT1Deficiencysyndrome，又稱DeVivosyndrome)。另一方面，當(dāng)發(fā)生癌變時，葡萄糖是腫瘤細胞最主要的能量來源，但是腫瘤細胞由于缺乏氧氣供應(yīng)而只能對葡萄糖進行無氧代謝，同質(zhì)量葡萄糖所提供的能量不到正常細胞的10％，因而對葡萄糖的需求劇增(這是被稱為WarburgEffect的腫瘤細胞代謝現(xiàn)象)，在很多種類的腫瘤細胞中都觀察到GLUT1的超量表達，以大量攝入葡萄糖維持腫瘤細胞的生長擴增，這使得GLUT1的表達量可能作為檢測癌變的一個指標(biāo)，抑制GLUT1活性的抑制劑的開發(fā)也是成為治療癌癥的重要方法之一。葡萄糖跨膜轉(zhuǎn)運的研究歷史基本上代表了人類理解物質(zhì)跨膜運輸?shù)臍v史。將近100年前，就觀測到紅細胞對葡萄糖的飽和性吸收；起初認為葡萄糖是通過自由跨膜擴散進入細胞的，隨著實驗證據(jù)的積累，1948年，LeFevre等首次提出葡萄糖的進入紅細胞的跨膜擴散需要細胞膜上的特定組分(蛋白質(zhì))參與；1952 年，Widdas等通過對人體紅細胞轉(zhuǎn)運葡萄糖的動力學(xué)研究提出了飽和運載體機制(saturablecarriermechanism)，理論上揭示了細胞膜上運載體(carrier)的存在(盡管之后的研究并不再支持這轉(zhuǎn)運模型，但至今許多跨膜轉(zhuǎn)運蛋白仍然以carrier命名，轉(zhuǎn)運蛋白家族以SLC分類)；1977年，Kasahara和Hinkle從人體紅細胞提純分離出了參與葡萄糖轉(zhuǎn)運的膜蛋白，并實現(xiàn)了脂質(zhì)體重構(gòu)功能實驗，證實了葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白的存在；1985年，HarveyLodish實驗室首次鑒定出了人體GLUT1蛋白的基因序列，并根據(jù)氨基酸序列預(yù)測了其具有12次跨膜區(qū)的拓撲結(jié)構(gòu)；1991年，DeVivo等首次報道了與GLUT1突變體相關(guān)的疾病癥狀，并將這一大類與GLUT1突變相關(guān)的疾病命名為DeVivo綜合癥，展示了GLUT1與人類健康的緊密關(guān)聯(lián)。自從獲得了大量生理、病理、細胞、生化信息之后，獲取GLUT1的三維結(jié)構(gòu)就變成了該領(lǐng)域最期待的下一個突破。為了結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究，科學(xué)家嘗試了從紅細胞中、動物組織中直接提取GLUT1或者通過重組表達的方法獲??；同時還嘗試通過研究GLUT1-4的同源蛋白結(jié)構(gòu)信息來間接理解這些重要的人源轉(zhuǎn)運蛋白。上個世紀(jì)80年代，Henderson等報道了數(shù)個與GLUT具有序列同源性的細菌糖轉(zhuǎn)運蛋白；90年代，一系列工作報道了GLUT1蛋白在多種表達體系中的重組表達；真正的結(jié)構(gòu)生物學(xué)突破發(fā)生于2012年，顏寧研究組首次解析了GLUTs的大腸桿菌同源蛋白XylE與葡萄糖結(jié)合的高分辨率晶體結(jié)構(gòu)，并利用同源建模預(yù)測了GLUT1-4的三維結(jié)構(gòu)；時至今日，人源GLUT1蛋白的晶體結(jié)構(gòu)的捕獲為理解這個具有歷史研究意義的轉(zhuǎn)運蛋白掀開了新的一章。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明目的在于開發(fā)一種以分子對接、虛擬篩選及細胞實驗技術(shù)為基礎(chǔ)的高精準(zhǔn)計算機藥物篩選方法，能夠適用于合理的藥物設(shè)計。本發(fā)明的首要目的是通過計算機Glide虛擬篩選方式得到GLUT的先導(dǎo)藥物。該先導(dǎo)化合物有對GLUT有抑制活性的潛力。本發(fā)明的第二個目的是通過DiscoveryStudio\Glide程序精確地選中靶點GLUT的綁定口袋。以供分子對接和虛擬篩選使用。本發(fā)明第三個目的是對分子對接區(qū)分GLUT1抑制劑和非抑制劑的能力進行評估。本發(fā)明第四個目的是用REOS規(guī)則對前期篩選的1500個小分子進行優(yōu)化處理。本發(fā)明的第五個目的是通過細胞生物學(xué)實驗驗證虛擬篩選得倒的先導(dǎo)化合物的活性。為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一種以GLUT1為靶點的計算機藥物篩選方法，其特征在于以分子對接及多精準(zhǔn)度虛擬篩選技術(shù)為基礎(chǔ)進行計算機藥物篩選設(shè)計，包含以下五個步驟：(1)GLUT1晶體結(jié)構(gòu)進行評估；(2)使用分子對接分子對接區(qū)分GLUT1抑制劑和非抑制劑的能力進行評估；(3)根據(jù)評估的結(jié)果挑選最佳的晶體結(jié)構(gòu)作為分子對接的模板；(4)利用ACD/ADME軟件包計算這些分子的分子性質(zhì)并保存；(5)虛擬篩選；(6)將第一輪篩選結(jié)果用REOS規(guī)則進行處理；(7)基于細胞 生物學(xué)實驗的先導(dǎo)化合物分子活性測試。本發(fā)明還采用了如下方案：以GLUT1為靶點的計算機藥物篩選方法在以GLUT1為靶點的先導(dǎo)化合物計算機篩選的應(yīng)用。本發(fā)明還采用了如下方案：以GLUT1為靶點的計算機藥物篩選方法在分子對接軟件Glide分子對接平臺的應(yīng)用。本發(fā)明還采用了如下方案：以GLUT1為靶點的計算機藥物篩選方法在高通量虛擬篩選(HTVS)平臺的應(yīng)用。本發(fā)明還采用了如下方案：以GLUT1為靶點的計算機藥物篩選方法在標(biāo)準(zhǔn)篩選(SP)平臺上的應(yīng)用。本發(fā)明還采用了如下方案：以GLUT1為靶點的計算機藥物篩選方法在附加篩選(XP)平臺的應(yīng)用。本發(fā)明還采用了如下方案：以GLUT1為靶點的計算機藥物篩選方法在Specs數(shù)據(jù)庫的應(yīng)用。本發(fā)明還采用了如下方案：以GLUT1為靶點的計算機藥物篩選方法在Chembridge數(shù)據(jù)庫的應(yīng)用。本發(fā)明還采用了如下方案：以GLUT1為靶點的計算機藥物篩選方法篩選出的小分子化合物在抑制GLUT1酶活性的應(yīng)用。附圖說明圖1是GLUT1晶體評估得倒的受體與小分子抑制劑相互作用的重要殘基。主要涉及Gln283、Gln282、Glu380。圖2是對分子對接區(qū)分GLUT1抑制劑和非抑制劑的能力進行評估時及進行虛擬篩選時小分子與受體的結(jié)合口袋，直接為5埃。圖3是三個有較高細胞抑制活性的小分子化學(xué)結(jié)構(gòu)式。四個小分子分別為化合物1：5-溴乙基-2-羥甲基-6-甲基-四氫吡喃-3，4-二醇；化合物2：4-(4-羥丁基)-2-羥甲基-3-羥基6-甲基-四氫吡喃；化合物3：2，3，4，-三羥基-5-氯-甲醇；化合物4：2，3-羥基-4-溴-5-氯-甲醇。圖4是三個有較高細胞抑制活性的小分子活性曲線。其中途中標(biāo)識1、2、3、4分別代表化合物1、化合物2、化合物3、化合物4。圖5是所述計算機高精度合理藥物篩選設(shè)計方法的流程圖。具體實施方式具體來說，請參閱圖1～圖5及附表1和附表3所示，本發(fā)明提供一種通過合理藥物設(shè)計的方法來定義來對GLUT1蛋白進行基于結(jié)構(gòu)的虛擬藥物篩選并驗證其生物活性。步驟如下：GLUT1晶體結(jié)構(gòu)進行評估。使用分子對接分子對接區(qū)分GLUT1抑制劑和非抑制劑的能力進行評估。根據(jù)評估的結(jié)果挑選最佳的晶體結(jié)構(gòu)作為分子對接的模板。利用ACD/ADME軟件包計算這些分子的分子性質(zhì)并保存。虛擬篩選將第一輪篩選結(jié)果用REOS規(guī)則進行處理?；诩毎飳W(xué)實驗的先導(dǎo)化合物分子活性測試。下面我們針對本發(fā)明進行具體描述：1.基于計算機的虛擬篩選方法(1)在進行虛擬篩選前，先對現(xiàn)有的GLUT1的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)進行評估(PDB：4PYP)。采用Glide對接的方法將晶體結(jié)構(gòu)中的化合物取出再重新對接到結(jié)合口袋中，并將對接打分最好的分子構(gòu)象作為其結(jié)合構(gòu)象，再將分子對接得到的構(gòu)象與晶體結(jié)構(gòu)中的構(gòu)象進行疊合，比較分子對接的效果。主要涉及Gln283、Gln282、Glu380。(2)對分子對接區(qū)分GLUT1抑制劑和非抑制劑的能力進行評估。BindingDB數(shù)據(jù)庫中的GLUT1抑制劑共有45個，非抑制劑分子數(shù)據(jù)集則采用DiscoveryStudio2.5中的FindDiverseMolecules模塊從Chembridge化合物數(shù)據(jù)庫中選取10000結(jié)構(gòu)差異最大的化合物組成。采用Glide分子對接方法把抑制劑和非抑制劑數(shù)據(jù)集中的分子對接到活性位點。(3)根據(jù)評估的結(jié)果挑選最佳的晶體結(jié)構(gòu)作為分子對接的模板，采用Glide篩選Chembridge化合物數(shù)據(jù)庫，采用GlideHTVS、SP打分模式進行評價，保留對接得分最好的10萬個化合物進行XP打分模式的篩選；對于Specs化合物數(shù)據(jù)庫，也先用GlideSP打分模式進行分子對接和打分，然后保留得分最好的5萬個化合物進行XP打分模式的篩選。經(jīng)過XP打分模式的篩選后，對于Chembridge化合物數(shù)據(jù)庫，保存得分最好的前3000位的分子，對于Specs化合物數(shù)據(jù)庫，保存前1500位的分子，然后二者合并在一起并除去重復(fù)的分子。(4)利用ACD/ADME軟件包計算這些分子的分子性質(zhì)并保存；采用MOE計算分子結(jié)構(gòu)中是否包含易反應(yīng)基團，把包含反應(yīng)基團的分子去掉；剔除logD和logP都大于6.5的化合物；剔除違反1條及以上五規(guī)則的分子以及違反3條及以上Opera規(guī)則的化合物。最后，保存得分靠前的前1500個分子。(5)將這1500個分子用REOS規(guī)則10進行處理，刪除可能含毒性、具有反應(yīng)活性以及其他不理想組分的分子，最后得到536個分子，然后再聚類分析分為124類(使用DiscoveryStudio2.5中的FindDiverseMolecules模塊)，最終挑選并購買了10個最有潛力的化合物進行生物學(xué)實驗。(6)我們利用MTT比色法測試其細胞活性以作進一步的篩選。MTT即3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽。該方法的原理是活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶將外源性的MTT還原成不溶于水的藍紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細胞中，而死細胞沒有這樣的功能。二甲亞砜(DMSO)可以溶解甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測儀在570nm波長處測定其光吸收值，可以間接地反映出活細胞的數(shù)量。在一定范圍細胞數(shù)內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細胞數(shù)成正比。主要的實驗流程如下：(6.1)細胞鋪板，將癌細胞稀釋到適當(dāng)濃度(10000個/mL)，向96孔板中加95μL細胞懸液，并置于 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。(6.2)向各孔中加入5μL濃度為25μg/mL的化合物，繼續(xù)培養(yǎng)48小時。(6.3)向已鋪板的各孔中，加15μL5mg/mL的MTT溶液，培養(yǎng)4小時。(6.4)將各孔中的溶液抽濾干凈，然后各加100μLDMSO。(6.5)用酶標(biāo)儀在570nm處測試OD值，并換算出小分子的IC50值，其中發(fā)現(xiàn)有三個小分子化合物IC50達到μM級別。附表1實驗材料和試劑名稱生產(chǎn)廠家KinaseAssayKitInvitrogen，PV4532細胞株MGC80-3中國科學(xué)院上海細胞庫細胞株P(guān)ANC-1中國科學(xué)院上海細胞庫改良型RPMI-1640培養(yǎng)基ThermoScientificDMEM/HighGlucose培養(yǎng)基ThermoScientific胎牛血清BioseraMTTSigma-Aldrich二甲亞砜國藥集團化學(xué)試劑有限公司(上海)附表2實驗儀器設(shè)備名稱生產(chǎn)廠家96孔細胞培養(yǎng)板Corning384孔低緣不透明黑色微孔板Corning微量移液器Eppendorf多功能酶標(biāo)儀ThermoScientificMicroplateReaderBIO-RAD，680潔凈工作臺上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠高壓蒸汽滅菌器三洋電機株式會社電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱上海精宏實驗設(shè)備有限公司CO2培養(yǎng)箱ThermoScientific微孔板恒溫振蕩器杭州奧盛儀器有限公司，AS-MB-1181當(dāng)前第1頁1 2 3