本發(fā)明涉及生物群體中特定DNA序列的表示方法，特別是一種DNA序列模式的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：
基因是指具有遺傳效應(yīng)的DNA片段，不同種類(lèi)的生物體內(nèi)存在著不同的基因體系。然而某些基因由于其表達(dá)產(chǎn)物承擔(dān)著重要的生命功能而在生物群體中廣泛存在，如細(xì)胞色素氧化酶基因和rDNA基因存在于幾乎所有的生物細(xì)胞當(dāng)中。此外，這兩種基因的部分序列及緊鄰的非編碼區(qū)還具有高度的可變性，不同的生物類(lèi)群擁有其特定的序列。因此這兩種基因相關(guān)序列可以作為特定生物類(lèi)群的標(biāo)識(shí)，目前在生物體的種屬鑒定和生物群體結(jié)構(gòu)解析等方面得到了廣泛的應(yīng)用：細(xì)胞色素氧化酶基因相關(guān)序列正作為生物物種DNA條碼的首選片段，rDNA基因相關(guān)序列則正作為微生物菌群研究的理想片段。然而同一種生物擁有相同的上述序列只是一種理想情況，事實(shí)上即使同一種生物也會(huì)存在上述序列的變異（這種變異并不能簡(jiǎn)單歸結(jié)于亞種或者變種等），這種情況因不同的生物種屬而異，理論上這應(yīng)該是大多數(shù)生物種屬的常態(tài)。此外，對(duì)于群體生物學(xué)研究而言，有時(shí)候需要在不同生物類(lèi)群中進(jìn)行分析和比較，此時(shí)需要的是生物類(lèi)群層面的序列信息而非種屬層面。所述這兩種情況分別涉及到了序列的多種形式（種內(nèi)）和多種序列（種間或者類(lèi)群之間）的情況，此時(shí)多條序列的表示方式并不可取，可以采用序列模式進(jìn)行表征。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種DNA序列模式的構(gòu)建方法，該方法構(gòu)建的DNA序列模式可以直觀地展現(xiàn)出所研究生物種屬或類(lèi)群的序列特征，從而有利于生物群體特性的分析和研究。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種DNA序列模式的構(gòu)建方法，對(duì)于特定的DNA序列，將研究涉及到的生物種屬或類(lèi)群所有該DNA序列按照堿基兼并表示規(guī)則合并成一條DNA序列模式，這種合并可以在種、屬或其它分類(lèi)單位水平上進(jìn)行的，也可以是針對(duì)特定的生物類(lèi)群來(lái)進(jìn)行的。在本發(fā)明一實(shí)施例中，DNA序列模式的構(gòu)建步驟如下：步驟1：確定擬構(gòu)建的DNA序列模式涉及的生物種屬或類(lèi)群；步驟2：根據(jù)研究需要選擇特定的DNA片段，收集步驟1所述生物種屬或類(lèi)群的相應(yīng)DNA序列；步驟3：將步驟2中收集到的DNA序列進(jìn)行比對(duì)，剔除與其它序列明顯不一致或錯(cuò)誤的DNA序列；步驟4：根據(jù)研究需要在生物種屬或類(lèi)群水平上，將經(jīng)步驟3剔除后的生物種屬或類(lèi)群的DNA序列按照堿基兼并表示規(guī)則合并為一條DNA序列，并進(jìn)行必要的校對(duì)，此即生物種屬或類(lèi)群的DNA序列模式；其中，擬構(gòu)建的DNA序列模式涉及的生物種屬或類(lèi)群可以結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道和前期研究進(jìn)行確定。其中，所述堿基兼并表示規(guī)則為：當(dāng)某一位點(diǎn)的比對(duì)結(jié)果：1）只出現(xiàn)a、t、c、g，則參照堿基兼并表輸出結(jié)果；2）出現(xiàn)空格和a、t、c、g，則一律改成大寫(xiě)字母A、T、C、G；3）出現(xiàn)空格和多個(gè)堿基，則一律采用大寫(xiě)的兼并堿基表示；4）出現(xiàn)其它字母，則忽略；5）比對(duì)序列中部分序列前端和末端出現(xiàn)的連續(xù)缺失不被計(jì)成空格。其中兼并堿基并不是真實(shí)存在的堿基，而是用一個(gè)除a、t、c、g四種基本堿基表示外的其它符號(hào)代表某一位點(diǎn)可能出現(xiàn)的多堿基情況。本發(fā)明的有益效果是提供了一種所研究生物群體中生物類(lèi)群特定DNA序列的簡(jiǎn)便表示方法，即DNA序列模式，從構(gòu)建的DNA序列模式可以容易地分析出針對(duì)所研究生物群體該DNA序列的特征，包括擁有特定的保守區(qū)和可變區(qū)以及可變區(qū)的可變性等，從而為包括引物的評(píng)價(jià)和設(shè)計(jì)等方面提供依據(jù)，有助于所研究體系中生物群體特性的準(zhǔn)確解析。下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。附圖說(shuō)明圖1是本發(fā)明實(shí)施例的實(shí)施流程圖。具體實(shí)施方式本發(fā)明DNA序列模式的構(gòu)建方法，對(duì)于特定的DNA序列，將所研究體系涉及的生物種屬或類(lèi)群所有該DNA序列按照堿基兼并表示規(guī)則合并成一條DNA序列模式，這種合并可以在種、屬或其它分類(lèi)單位水平上進(jìn)行的，也可以是針對(duì)特定的生物類(lèi)群來(lái)進(jìn)行的；生物種屬或類(lèi)群的DNA序列模式就共同構(gòu)成了所研究體系的DNA序列模式。根據(jù)上述DNA序列模式的構(gòu)建方法，如圖1所示，DNA序列模式的構(gòu)建步驟具體如下：步驟1：確定擬構(gòu)建的DNA序列模式涉及的生物種屬或類(lèi)群；步驟2：根據(jù)研究需要選擇特定的DNA片段，收集步驟1所述生物種屬或類(lèi)群的相應(yīng)DNA序列；步驟3：將步驟2中收集到的DNA序列進(jìn)行比對(duì)，剔除與其它序列明顯不一致或錯(cuò)誤的DNA序列；步驟4：根據(jù)研究需要在生物種屬或類(lèi)群水平上，將經(jīng)步驟3剔除后的生物種屬或類(lèi)群的DNA序列按照堿基兼并表示規(guī)則合并為一條DNA序列，并進(jìn)行必要的校對(duì)，此即生物種屬或類(lèi)群的DNA序列模式。步驟5：根據(jù)研究需要對(duì)所構(gòu)建的DNA序列模式進(jìn)行特性分析，依據(jù)其序列特征進(jìn)行相應(yīng)的應(yīng)用（如引物評(píng)價(jià)和設(shè)計(jì)等）。上述步驟4中，所述堿基兼并表示規(guī)則為：當(dāng)某一位點(diǎn)的比對(duì)結(jié)果：1）只出現(xiàn)a、t、c、g，則參照堿基兼并表輸出結(jié)果；2）出現(xiàn)空格和a、t、c、g，則一律改成大寫(xiě)字母A、T、C、G；3）出現(xiàn)空格和多個(gè)堿基，則一律采用大寫(xiě)的兼并堿基表示；4）出現(xiàn)其它字母，則忽略；5）比對(duì)序列中部分序列前端和末端出現(xiàn)的連續(xù)缺失不被計(jì)成空格。其中因?yàn)橛糜谛蛄心Ｊ綐?gòu)建的各序列的起始和終止并非都一致，因此比對(duì)序列中部分序列前端和末端出現(xiàn)的連續(xù)缺失不被計(jì)成空格。其中兼并堿基并不是真實(shí)存在的堿基，而是用一個(gè)除a、t、c、g四種基本堿基表示外的其它符號(hào)代表某一位點(diǎn)可能出現(xiàn)的多堿基情況。所述堿基兼并表為：表1堿基兼并表其中，由于現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)當(dāng)中的DNA序列不可避免地會(huì)存在著一些誤差或者偏差，如局部測(cè)序錯(cuò)誤率較高，這在序列的始端和末端是十分常見(jiàn)的，還有會(huì)出現(xiàn)收集到的序列格式不一致（有的是正向序列有的是反向互補(bǔ)序列）等情況，因此有必要對(duì)得到的序列模式進(jìn)行校正。對(duì)此有一點(diǎn)可以作為甄別的依據(jù)，特定的DNA序列如前述的rDNA基因和細(xì)胞色素氧化酶基因，在同一種屬內(nèi)還是具有較高的保守性的，難以出現(xiàn)連續(xù)的大量的突變。其中，DNA序列模式的構(gòu)建是基于已知涉及的菌群信息及其現(xiàn)有的DNA序列，隨著相關(guān)研究的開(kāi)展、進(jìn)行和深入，菌群信息及其DNA序列將會(huì)得到更新或者補(bǔ)充，因此可以采用同樣的方法對(duì)構(gòu)建的序列模式進(jìn)行完善。下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。本實(shí)施例以紅曲黃酒釀造體系特有的微生物——紅曲霉菌群為研究對(duì)象，構(gòu)建其18SrDNA近全長(zhǎng)序列模式，并對(duì)其基本序列特性進(jìn)行分析。本實(shí)施例具體步驟如下：1、確定菌群信息本發(fā)明實(shí)施例涉及的是紅曲黃酒釀造微生物體系中的紅曲霉屬（Monascusspp.）。2、收集18SrDNA近全長(zhǎng)序列在NCBI的Nucleotide數(shù)據(jù)庫(kù)檢索紅曲霉屬的18SrDNA近全長(zhǎng)序列（真菌的18SrDNA序列全長(zhǎng)約有1800bp，但是目前數(shù)據(jù)庫(kù)中僅有少數(shù)真菌種屬的18SrDNA全長(zhǎng)序列，因此本實(shí)施例收集的是18SrDNA近全長(zhǎng)序列，不少于1500bp），檢索條件為：(((18S[Title])ANDMonascus[Organism])AND1500:2000[SequenceLength])NOT28S[Title]。按照上述條件共檢索到19條序列，其種群及AccessionNumber情況詳見(jiàn)表2。下載這19條序列，用Clustalx軟件（Clustalx1.8）進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)GU733347.1序列與其它18條序列差異較大，因此進(jìn)行剔除。表2紅曲霉種屬及其18SrDNA近全長(zhǎng)序列情況注：序列收集以2013.7.1的NCBI的核酸數(shù)據(jù)庫(kù)為準(zhǔn)；其中經(jīng)Clustalx軟件（Clustalx1.8）比對(duì)發(fā)現(xiàn)GU733347.1與其它序列差異性較大，故進(jìn)行剔除，在表中用粗體標(biāo)示。3、構(gòu)建18SrDNA近全長(zhǎng)序列模式按照上述DNA序列模式構(gòu)建步驟所述，將確證的18條Monascusspp.的18SrDNA近全長(zhǎng)序列轉(zhuǎn)換成其序列模式（序列如SEQIDNO.1所示）。利用Clustalx軟件（Clustalx1.8）對(duì)Monascusspp.的18SrDNA近全長(zhǎng)序列模式和轉(zhuǎn)換前的18條序列進(jìn)行比對(duì)分析，經(jīng)過(guò)校對(duì)發(fā)現(xiàn)所得到的序列模式符合所制定的轉(zhuǎn)換規(guī)則。但是該序列模式的第29-31位點(diǎn)分別為W、R和S，均是由序列DQ782881.1與其它17條序列不符所致，另外相比于其中的17條序列該序列在序列比對(duì)中的位點(diǎn)44、位點(diǎn)50和位點(diǎn)54處也存在缺失，所述六處位點(diǎn)均為序列DQ782881.1的始端，綜合分析認(rèn)為應(yīng)為序列DQ782881.1本身測(cè)序不準(zhǔn)所致而非突變，故采用其它序列的結(jié)果（即29-31位點(diǎn)分別為A、G和C，同時(shí)不計(jì)所述位點(diǎn)44、位點(diǎn)50和位點(diǎn)54這3處缺失）。因此經(jīng)過(guò)校正，所構(gòu)建的Monascusspp.的18SrDNA近全長(zhǎng)序列模式如SEQIDNO.2所示。校正后的Monascusspp.的18SrDNA近全長(zhǎng)序列模式共有1777bp，對(duì)應(yīng)于Saccharomycescerevisiae標(biāo)準(zhǔn)菌株NCYC505的18SrDNA序列（AccessionNumber為Z75578）的19-1796位點(diǎn)。4、序列模式特性分析對(duì)3中獲得的Monascusspp.的18SrDNA近全長(zhǎng)序列模式的可變位點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，如表3所示。表3Monascusspp.的18SrDNA近全長(zhǎng)序列模式可變位點(diǎn)情況該序列模式共有24處可變位點(diǎn)，其中插入或缺失位點(diǎn)有8處，轉(zhuǎn)換位點(diǎn)有14處（a、g轉(zhuǎn)換位點(diǎn)9處，t、c轉(zhuǎn)換位點(diǎn)5處），其余2處為顛換位點(diǎn)?？勺兾稽c(diǎn)約占全長(zhǎng)的1.35%，說(shuō)明Monascusspp.的18SrDNA序列具有很小的可變性。其中轉(zhuǎn)換位點(diǎn)最多，約占百分之六十（14/24），這和DNA的突變規(guī)律有關(guān)。在真菌基因組DNA中，C易被甲基化形成5’-甲基胞嘧啶，再脫氨基則會(huì)形成胸腺嘧啶。由于T本身就是DNA的基本構(gòu)成單元之一，因此不易被修復(fù)。所以T和C相互轉(zhuǎn)換（原始鏈）、A和G相互轉(zhuǎn)換（互補(bǔ)鏈）是較為常見(jiàn)的突變類(lèi)型。另外進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，位點(diǎn)591-810這一長(zhǎng)度為220bp的片段（約只占全長(zhǎng)的12.5%），其可變位點(diǎn)達(dá)到9個(gè)（約占全部可變位點(diǎn)的38%）；位點(diǎn)1041-1200這一長(zhǎng)度為160bp的片段（約只占全長(zhǎng)的9.0%），其可變位點(diǎn)達(dá)到6個(gè)（占全部可變位點(diǎn)的25.0%）。因此如果要采用微生物分子生態(tài)學(xué)手段（如DGGE即變性梯度凝膠電泳或TGGE即溫度梯度凝膠電泳技術(shù)）研究紅曲霉菌群，所選的引物其擴(kuò)增片段應(yīng)該盡可能趨于這兩個(gè)高可變區(qū)。序列表>SEQIDNO.1tgtagtcatatgcttgtctcaaagattawrscatgcatgtctaagtgtaagcaatttata60ctgtgaaactgcgaatggctcattaaatcagttatcgtttatttgatrgtaccttactac120atggatacctgtggtaattctagagctaatacrtgctaaaaaccccgacttcggaagggg180tgtatttattagataaaaaaccaacgcccttcggggctccttggtgaatcataataacta240aacgaatcgcatggccttgcgccggcgatggttcattcaaatttctgccctatcaacttt300cgatggtaggatagtggcctaccatggtggcaacgggtaacggggaattagggttcgatt360ccggagagggagcctgagaaacggctaccacrtccaaggaaggcagcaggcgcgcaaatt420acccaatcccgacacggggaggtagtgacaataaatactgatacggggctctttcgggtc480tcgtaatcggaatgagaacgacctaaataacctaacgaggaacaattggagggcaagtct540ggtgccagcagccgcggtaattccagctccaatagcgtatattaaagttgttgcagktaa600aaagctcgtagttgaaccttgggtctggctggccggtccgcctcaycgcgagtactggtc660cggccggacctttccttctggggaaAAcctcatggccttcaytggctgtggggggaaccC720rggacttttactgtgaaaaaattagagtgttcaaagcaggcctttgctcgaatacattag780catggaaAtaatagaataggacgtgcggGttctattttgttggtttctaggaccgccgta840atgattaatagggatagtcgggggcgtcagtattcagctgtcagaggtgaaattcttgga900tttgctgaagactaactactgcgaaagcattcgccaaggatgttttcattaatcagggaa960cgaaagttaggggatcgaagacgatcagataccgtcgtagtcttaaccataaactatgcc1020gactagggatcggacgggtttcyatgatgacccgttcggcaccttacgagaaAtcaaagt1080ttttgggttctggggggagtrtggtcgcaaggctgaaacttaaagraattgacggaaggg1140caccacaaggcgtggagcctgcggcttaatttgactcaacacggggaarctyaccaggtc1200cagacaaaataaggattgacagattgagagctctttcttgatcttttggatggtggtgca1260tggccgttcctagttggtggagtgatttgtctgcttaattgcgataacgaacgagacctc1320ggcccttaaatagcccggtccgcatttgcggGccgctggcttcttaaggggactatcggc1380tcaagccgatggaagtgcgcggcaataacaggtctgtgatgcccttagatgttctgggcc1440gcrcgcgcgctacactgacagggccCagcgagtacatcaccttggccgagaggcctgggt1500aatcttgttaaaccctgtcgtgctggggatagagcattgcaattattgctcttcaacgag1560gaatgcctagtaggcacgagtcatcagctcgtgccgaytacgtccctgccctttgtacac1620accgcccgtcgctactaccgattgaatggctcagtgaggcctccggactggcccagggag1680gttggcaacgacccccccgggccggaaagctggtcaaactcggtcatttagargaagtaa1740aagtcgtaacaaggtttmcgtaggtgaacctgcggaa1777>SEQIDNO.2tgtagtcatatgcttgtctcaaagattaagccatgcatgtctaagtgtaagcaatttata60ctgtgaaactgcgaatggctcattaaatcagttatcgtttatttgatrgtaccttactac120atggatacctgtggtaattctagagctaatacrtgctaaaaaccccgacttcggaagggg180tgtatttattagataaaaaaccaacgcccttcggggctccttggtgaatcataataacta240aacgaatcgcatggccttgcgccggcgatggttcattcaaatttctgccctatcaacttt300cgatggtaggatagtggcctaccatggtggcaacgggtaacggggaattagggttcgatt360ccggagagggagcctgagaaacggctaccacrtccaaggaaggcagcaggcgcgcaaatt420acccaatcccgacacggggaggtagtgacaataaatactgatacggggctctttcgggtc480tcgtaatcggaatgagaacgacctaaataacctaacgaggaacaattggagggcaagtct540ggtgccagcagccgcggtaattccagctccaatagcgtatattaaagttgttgcagktaa600aaagctcgtagttgaaccttgggtctggctggccggtccgcctcaycgcgagtactggtc660cggccggacctttccttctggggaaAAcctcatggccttcaytggctgtggggggaaccC720rggacttttactgtgaaaaaattagagtgttcaaagcaggcctttgctcgaatacattag780catggaaAtaatagaataggacgtgcggGttctattttgttggtttctaggaccgccgta840atgattaatagggatagtcgggggcgtcagtattcagctgtcagaggtgaaattcttgga900tttgctgaagactaactactgcgaaagcattcgccaaggatgttttcattaatcagggaa960cgaaagttaggggatcgaagacgatcagataccgtcgtagtcttaaccataaactatgcc1020gactagggatcggacgggtttcyatgatgacccgttcggcaccttacgagaaAtcaaagt1080ttttgggttctggggggagtrtggtcgcaaggctgaaacttaaagraattgacggaaggg1140caccacaaggcgtggagcctgcggcttaatttgactcaacacggggaarctyaccaggtc1200cagacaaaataaggattgacagattgagagctctttcttgatcttttggatggtggtgca1260tggccgttcctagttggtggagtgatttgtctgcttaattgcgataacgaacgagacctc1320ggcccttaaatagcccggtccgcatttgcggGccgctggcttcttaaggggactatcggc1380tcaagccgatggaagtgcgcggcaataacaggtctgtgatgcccttagatgttctgggcc1440gcrcgcgcgctacactgacagggccCagcgagtacatcaccttggccgagaggcctgggt1500aatcttgttaaaccctgtcgtgctggggatagagcattgcaattattgctcttcaacgag1560gaatgcctagtaggcacgagtcatcagctcgtgccgaytacgtccctgccctttgtacac1620accgcccgtcgctactaccgattgaatggctcagtgaggcctccggactggcccagggag1680gttggcaacgacccccccgggccggaaagctggtcaaactcggtcatttagargaagtaa1740aagtcgtaacaaggtttmcgtaggtgaacctgcggaa1777>SEQIDNO.1tgtagtcatatgcttgtctcaaagattawrscatgcatgtctaagtgtaagcaatttata60ctgtgaaactgcgaatggctcattaaatcagttatcgtttatttgatrgtaccttactac120atggatacctgtggtaattctagagctaatacrtgctaaaaaccccgacttcggaagggg180tgtatttattagataaaaaaccaacgcccttcggggctccttggtgaatcataataacta240aacgaatcgcatggccttgcgccggcgatggttcattcaaatttctgccctatcaacttt300cgatggtaggatagtggcctaccatggtggcaacgggtaacggggaattagggttcgatt360ccggagagggagcctgagaaacggctaccacrtccaaggaaggcagcaggcgcgcaaatt420acccaatcccgacacggggaggtagtgacaataaatactgatacggggctctttcgggtc480tcgtaatcggaatgagaacgacctaaataacctaacgaggaacaattggagggcaagtct540ggtgccagcagccgcggtaattccagctccaatagcgtatattaaagttgttgcagktaa600aaagctcgtagttgaaccttgggtctggctggccggtccgcctcaycgcgagtactggtc660cggccggacctttccttctggggaaAAcctcatggcctt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